Mtodos moleculares para a deteco e

caracterizao de patgenos




Mtodos de diagnstico molecular de doenas
infecciosas:


Rapidez & Especificidade
Anlise de componentes estruturais e/ou produtos celulares
Identificao precisa de agentes isolados em cultura

Deteco rpida de antgenos bacterianos em cultura e fludos orgnicos
Deteco de anticorpos formados durante a infeco
Avaliao da resposta a vacinas
Dosagem de antimicrobianos no soro e outros fludos orgnicos
Microrganismos cuja identificao confirmatria baseada em
propriedades sorolgicas Antgenos como marcadores taxonmicos

Microrganismos cuja epidemiologia fundamentada em propriedades
sorolgicas Antgenos como marcadores epidemiolgicos
APLICAO DE MTODOS IMUNOLGICOS
RPIDOS EM BACTERIOLOGIA
VANTAGENS DO EMPREGO DE MTODOS
PARA DETECO RPIDA DE ANTGENOS
Rapidez no diagnstico preciso e suas implicaes
imediatas no tratamento adequado, particularmente de
infeces por microrganismos de crescimento lento e
naquelas com alta taxa de mortalidade

Sucesso mesmo em pacientes em terapia
antimicrobiana

As tcnicas so relativamente simples e de custo
moderado
CONDIES QUE PODEM AFETAR A DETECO
DE ANTGENOS
Qualidade dos reagentes
Tratamento do espcimem antes do teste extrao, solubilizao,
aquecimento
Concentrao do antgeno no espcimem clnico
Dose infectante
Estgio e curso natural da infeco
Localizao do antgeno no organismo e sua cintica de excreo
Cintica de eliminao do antgeno pelo hospedeiro
M
A
T
E
R
I
A
L

C
L

N
I
C
O

Alimento
Fezes
Sangue
Urina
Enriquecimento ou
Cultura em meio lquido
Cultura em meio lquido
Normalmente observado
at 7 dias
Cultura
primria
Colonias
suspeitas
Identificao
presuntiva
Confirmao
bioqumica
Caracterizao
antignica
DIA 1 DIA 4 DIA 3 DIA 2 DIA 5
POTENCIAL APLICAO DOS ANTICORPOS NA
IDENTIFICAO DE BACTRIAS
DETECO DE ANTGENOS E ANTICORPOS
AG AC
SISTEMA
REVELADOR
ntegro
Recombinante
Peptdeo
Monoclonais
Precipitao
Aglutinao
Enzima
Radioistopo
Fixao
do C`
Extrato
Policlonais
Fluorocromo Purificado

DETECO DE ANTGENOS
ELISA
DOT-ELISA
TESTE IMUNOCROMATOGRFICO
AGLUTINAO
IFI

Testes de Aglutinao
Para a Deteco de Antgenos (Particulados)


Mtodos de Diagnstico Imunolgico de Doenas Infecciosas

I. Tcnicas de Aglutinao


Partculas de Latex (Aglutinao pelo Latex)

Clulas de S. aureus Cowan I(Coaglutinao)

Hemacias animais (Hemaglutinao)
Suportes mais comuns:

TESTE DE AGLUTINAO
LATEX
COAGLUTINAO
TESTE DE AGLUTINAO DIRETA:
CONJUNTO DIAGNSTICO PARA
DETECO DE ESTREPTOCOCOS
TESTE DE AGLUTINAO
REAES DE AGLUTINAO
HEMOAGLUTINAO
TESTES RPIDOS - IMUNOCROMATOGRFICO
Y
Y

Y

Y

Y

Y

Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Cryptosporideo
negativo
Giardia Crypto Anti-IgG
Giardia
TESTE DE IMUNOCROMATOGRAFIA PARA DETECO DE
COPROANTGENOS (C. parvum ou G. intestinalis)
REAO DE WIDAL - Febre tifide
1:20 1:40 1:80
1:160 1:320 1:640
0,950 mL
PBS
0,5 mL
PBS
0,5 mL
PBS
0,5 mL
PBS
0,5 mL
PBS
0,5 mL
PBS
0,5 mL
0,5 mL
0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
Acrescentar 0,5 mL de
Ag em cada tubo
50 L do
soro
Armazenar a 4C por 72 horas
Realizar a leitura a cada 24 horas
SFILIS
Importncia: diagnstico, definio do estgio
da infeco e controle de cura
Agente etiolgico: Treponema pallidum
Fases da sfilis no tratada:
Perodo de incubao - 3 semanas
Estgio primrio - 1 a 6 semanas
Estgio secundrio - 2 a 10 semanas
Estgio latente subclnico - 1 a 40 anos
Estgio tardio
Testes Sorolgicos
Anticorpos reagnicos (no treponmicos)
Floculao e Fixao C
Anticorpos treponmicos TPI, FTA-ABS
(Fluorescent Treponemal Antibody Absorption Assay)
e MHA-TP (Microhemagglutination Treponema pallidum)
SENSIBILIDADE DOS TESTES IMUNOLGICOS NO
DIAGNSTICO DA SFILIS
INNO-LIA SYPHILIS KIT
WESTERN BLOT
SFILIS
VDRL
ANTGENOS Cardiolipina e lecitinas + colesterol
Tcnica quantitativa no soro ou plasma Placa de Kline

Amostra 50 L
Controle positivo 50 L
Controle negativo 50 L

Suspenso antignica de VDRL 22 L

colocar a placa em movimeto rotatrio durante 4 min. a 180 rpm
ou manualmente em superfcie plana

Ler os resultados em microscpio e objetiva de 10X com luz direta
PASTOREX STREP
IDENTIFICAOPOR AGLUTINAO DE ESTREPTOCOCOS b-hemolticos

Suspeno de Ltex com anticorpos anti- grupo A, B, C, D, F e G

Antgenos - polissacardeos de parede celular

Os antgenos so extraidos previamente a partir de colonias isoladas
de agar-sangue

Extrao:
0,3 mL de sol de enzima em tubo
Pegar cinco colnias e dispersar na emzima
Incubar por 15 a 45 min. a tem. amb. ou 10 a 30 min. a 37
o
C

Identificao do grupo
agitar os frascos com ltex e colocar 1 gota de cada em crculos do carto
colcar uma gota de extrado em cada dos crculos
agitar em movimento orbital por 1 min.
PROTOCOLO BSICO
Preparar a amostra a ser testada e proceder a extrao do antgeno
conforme recomendao do fabricante
em tubo colocar 1 gota do reagente de extrao 1
Um ala de ~ 4 colnias b-hemoltica
adicionar 1 gota do reagente de extrao 2
Misturar a reao por 10 segundos
adicionar 5 gotas do reagente de extrao 3 e proceder como no item anterior


Depositar (aps homogeneizao) 1 gotas de cada reagente no
centro de diferentes reas delimitadas no carto de reao
Homogeneizar a suspenso com ajuda de haste plstica ou palito.
Agitar o carto com movimentos rotatrios suaves por, no mximo,
dois minuto.
Observar evidncias de reao positiva: formao de grumos.
STREPTO-SEC
SLIDEX MENINGITE KIT 5
Ltex sensibilizados para deteco de antigenos liberados no LCR

LCR aquecer a 100
o
C / 5 min. e centrifugar por 10 min. a 2.000 rpm

Ltex:
R1 H. influenza tipo b
R2 S. pneumoniae
R3 N. meningitidis grupo A
R4 N. meningitidis grupo B
R5 N. meningitidis grupo C
R6 controle positivo

1 gota de R1 a R6 + 30 Lde sobrenadante do LCR
Misturar com auxlio de basto e com movimentos de rotao

CONTEDO BSICOS DOS RELATRIOS DE TDL

-DENOMINAO DO CONJUNTO DIAGNSTICO USADO E FABRICANTE

-FINALIDADE DE SEU USO

-CARACTERSTICAS DO CONJUNTO DIAGNSTICO
- PRINCPIO DO TESTE EMPREGADO
- COMPONENTES DO CONJUNTO (DESCRIO DO CONJUNTO)

-MATERIAL TESTADO

-RESULTADOS ESPERADOS X RESULTADOS OBTIDOS

- DISCUSSO E CONCLUSES