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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE

MEXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES
“ZARAGOZA”

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICA 14:
FISIOLOGIA BACTERIANA (PRUEBAS
BIOQUIMICAS)
ALUMNOS: **Castañeda Piña Juan Carlos
**Escobar Blanco Luís
**Ordóñez Piña Imelda
Importancia de la fisiología
bacteriana (Pruebas bioquímicas)
Generalidades
**La mayoría de las Rx bioquímicas metabólicas
de microorganismos es controladas por
medio de enzimas.

**Es esencial conocer el metabolismo de los


M.O. para comprender las relaciones
hospedero- patógeno y patógeno-medio.
**La determinación de las características
bioquímicas es el paso primordial para la
identificación de la gran mayoría de MO.

A B C

**Se debe verificar efectos y cambios que


sufre un medio de cultivo.
Al realizar este tipo de determinaciones
deben tomarse en cuenta algunos factores
que influyen directamente en el
metabolismo bacteriano como:

*Temperatura
*pH óptimo de crecimiento
*Concentración de oxigeno y CO2
*Tipo de medio de cultivo
*Tipo de esterilización
*Tipo de microorganismo
CALDO ROJO DE FENOL
OBJETIVO:
Determinar la capacidad de que un M.O.
fermente un CHO especifico y producir un
H+ o un H+ con gas.
El estudio de algunas especies como:
*Lactobacilos *Shigella Sp
*Bacillus sp *Proteus Sp
*Streptococcus sp *Klebsiella Sp
*Enterobacter *Clostridium Sp
*Sallmonella Sp
Fermentadores de glucosa: todos los
miembros de las Enterobacteriaceae.

Fermentadores de Glucosa y lactosa


E.Coli
Klepsiella Sp.
Enterobacter Sp.
FUNDAMENTO
El rojo de fenol es el indicador de pH mas
frecuentemente utilizado para demostrar
la fermentación de un CHO.
Con el rojo de fenol, el cambio de color
ocurre cerca del pH original del medio.
Determinar la capacidad de un
microorganismo un CHO especifico
incorporado a un medio básico,
produciendo un ácido o un ácido con un
gas visible.
REACCION
GENERAL
Indicador pH+ CHO´s CO2+H2+
( Aldehídos,
bacteria Ácidos,
glucólisis
Alcoholes,
Cetonas,
Cambio de color.
**Inicialmente los ChO´s son degradados a
monosacáridos para entrar a la célula
bacteriana y ser degradados.

*La fermentación es un proceso es un


proceso metabólico de oxido-reducción
anaeróbico.

Los productos finales característicos de la


fermentación bacteriana son:
1)Ácido Láctico
2)Ácidos acético y fórmico
3)Ácido láctico y alcohol etílico
4) Acetilmetilcarbinol (acetoina) y CO2
5)Acido succínico
6)CO2, acetona y alcohol isopropilico
7) Alcohol butílico.
Fermentación alcohólica
Glucosa 2 Etanol + CO2

*Las bacterias alcohólicas degradan a la


glucosa en Ác. Pirúvico (intermediario clave)
siguiendo el ciclo de Embden – Meyerhof.
**Proceso llevado a cabo por levaduras
Saccharomyces Sp.
Fermentación del ácido láctico

Homolácticas Heterolácticas

Embden -Meyerhof Embden Meyerhof


Shunt de las pentosas
Entner-Duodoroff

Ac. Láctico **Etanol


Ac. láctico Ác. Acético **Co2
Ác. Fórmico **Glicerol
*Lactobacillus
*Bacillus Sp
*Streptococcus
*Leuconostoc
Fermentación formica

Fermentación Fermentación
Ácido mixta Butilenglicolica

Ácido Fórmico, acético, Mismos Productos en


fórmico, láctico, Menor cantidad y
Etanol. 2-3 butenglicol (butanediol)
FERMENTACION PROPIÓNICA
**El principal producto final del ácido
Pirúvico es el ácido propiónico y CO2 a
través del ácido succínico.
*También se puede producir ácido acético.
**Propionibacterium
**Clostridium propionicum
**Corinebacterium diphtheriae
Fermentación butírica
**La fermentación del alcohol
butílico es llevada a cabo por
bacterias anaerobias como el
clostridium.
*Formación de Ac. Acético, ácido
fórmico, etanol, ácido butírico,
alcohol butílico, acetona,
alcohol isopropilico.
COMPOSICION
Extracto de Carne………………….…1g
Peptona proteasa ………………….10 g
Cloruro Sódico…………………….….5g
Rojo de fenol soln al 5%..............1.8mL
Agua Destilada………………….1000mL
*A esta base agregar 5g del CHO deseado.
*Ajustar el pH a 7.4
*Poner tubos de Durham invertidos
*Pasar por la autoclave a 115ºC por 10 min.
Se debe de inocular por difusión en cada uno
de los caldos con el microorganismo.

*La inoculación debe de hacerse con un


inoculo denso.

*Incubar el tubo a 35ºC durante 18 a 24


horas.

*Realizar las observaciones correspondientes


e interpretar los resultados.
Microorganismos que se
utilizan como control positivo
y negativos en el laboratorio.
Precauciones:
Cuando se utiliza un tubo de Durham se
debe de colocar de manera invertida.

Esto debido al estudio de producción de


gases en algunas familias de bacterias
fermentativas y distinguir de entre las que
no producen este producto residual de la
fermentación.
*El caldo no presente trazas de NO32- .
*El medio con CHO´S cuando se retira de la
autoclave posee un color anaranjado suave
que cambia al naranja-rojo cuando se enfría.
*Se debe de tener cuidado cuando se
interpretan las pruebas ya que el color que
denota la fermentación varia de acuerdo al
indicador de pH utilizado.

*La adición de CHO´S en el medio puede


producir una condición acida.
Caldo nitrato
OBJETIVOS:
-Determinar la capacidad de un
microorganismo de reducir los nitratos a
nitritos o gas nitrógeno libre

- Diferenciación de especies

- Diferenciación de géneros
Fundamento
La reducción de nitrato (NO3-) a nitrito
(NO2) y a nitrógeno gaseoso (N2) por lo
común se produce en condiciones de
anaerobiosis.
METODO
INOCULALAR POR
DIFUSION EL CALDO INCUBAR EL
NITRATO CON EL TUBO A 35 C
MICROORGANISMO DURANTE 24- 48
HORAS

NO
Color
Agregar 5 gotas de
rojo
Alfa- Naftilamina y 5
gotas de ácido
Agregar Fin de sulfanilico
la
zinc
prueba
Reacciones
- -
NO3 + 2e + 2H NO2 + H 2O
Caldo Nitrato
Composición:
Peptona......................5 gr
Extracto de carne......... 3 gr
Nitrato potásico........... 1 gr
Agua destilada........... 1000 ml
Disolver los ingredientes y ajustar el pH a 7
y distribuir 5 ml en cada tubo.
Microorganismos utilizados
como control
Positivo (+)
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa

Negativo (-)
Acinetobacter Iwoffi
INTERPRETACION
Resultados
Fase I
Resultado positivo (+)
- Color rojo oscuro en 1-2 min
Resultado negativo
-Falta de desarrollo de color

• Fase 2: Prueba de reducción de Cinc


Resultado positivo
-Ausencia de desarrollo de color
Resultado negativo
a) Color rosa a rojo oscuro en 5-10 min
c) Nitrato presente; no reducido por el
microorganismo
PRECAUCIONES
Realizar la interpretación de los
resultados inmediatamente.
AGAR ALMIDON
• Objetivos:
Determinar la capacidad de un
microorganismo de hidrolizar el almidón
• Diferenciación de especies
Fundamento
•La observación de hidrólisis enzimática
por parte de la α -amilasa o endoamilasa
excretada por bacterias.

• Moléculas de Yodo atrapadas en las


hélices de unidades de glucosa.
Hidrolisis
MEDIOS UTILIZADOS

Agar Almidón
Peptona 5g
Extracto de carne 3g
Cloruro de sodio 5g
Agar 20g
Agua destilada 1.000mL
Método
INCUBAR A 35 c
Inocular la placa DURANTE 24-
con el 48 HORAS
microorganismo

Cubrir la placa
con solución de
lugol
MICROORGANISMOS
UTILIZADOS COMO CONTROL
ANAEROBIOS ANAEROBIOS AEROBIOS AEROBIOS NEGATIVO
POSITIVO (+) NEGATIVO (-) POSITIVO (+) (-)
Bacteroides Clostridium Bacillus subtilis Escherichia coli
fragilis bifermentans
Clostridium
perfringens
Interpretación
Resultados

- Positivo (+)
Medio de color
púrpura-azul con un
área incolora.
-Negativo (-)
Medio de color
púrpura-azul en el
crecimiento.
Precauciones
Registrar los resultados inmediatamente
después de agregar el reactivo de yodo
ya que el color azul formado puede
aclararse, lo que da un resultado falso
positivo en ausencia del almidón.
Pruebas de
ROJO DE METILO –
VOGES PROSKAUER
ROJO
DE
METILO
ROJO DE METILO
OBJETIVOS

 Identificación de especies bacterianas que


producen ácidos fuertes a partir de
glucosa.

Diferenciar entre géneros y especies


dentro de un género de la familia
Enterobacteriaceae.
ROJO DE METILO
FUNDAMENTO

 Es una prueba cuantitativa basada en el


uso de un indicador de pH, rojo de
metilo, para determinar la concentración
de ión hidrógeno cuando un
microorganismo fermenta la glucosa.
ROJO DE METILO

 Los MR + ác. estables:


láctico, acético,
fórmico, succínico
/[ H ] máx.

Los MR -
ACETOÍNA
[H] neutralidad /
CO2 y O2.
ROJO DE METILO
Metabolismo gral. De E. coli
2 ac. Láctico + ac. Acético +
2 EtOH + 2 CO2 + 2 H2

metabolismo de Klebsiella – Enterobacter


+ ½ O2 2,3 – butanodiol + H2O
+ 2 CO2

ACETOÍNA
ROJO DE METILO
Fórmula de Clark y Lubs a pH 6,9
Peptonas 7.0 g

Glucosa 5.0 g
(dextrosa)
Buffer fosfato 5.0 g
dipotásico
Agua destilada 1,000 mL
ROJO DE METILO
Pesar la cantidad
exacta y Δ solución
fraccionar
5 mL por tubo
rehidratar con agua
suavemente

inóculo liviano
debajo de la
superficie Esterilizar
Incubar del medio,
121º, 15 lb, 15’.
mín:
35º, 48 h
tapas fl ojas.
recom:
30º, Interpretar
3 -5 días. Agregar Resultado:
indicador +ó-
ROJO DE METILO
Microorganismos utilizados para el control de calidad

Bacteria MR +/- VP +/ -

E. coli + -

Enterobacter - +
aerogenes
ROJO DE METILO
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
MR + Cultivo suficientemente
ácido para permanecer el
color rojo (pH 4,4), en la
superficie del medio.

MR - Color amarillo (pH 6,0),


en la superficie del medio.

Rx tardía Color naranja rojizo por


menos producción de
ácido a partir del sustrato
de prueba, incubación a 4
días.
VOGES-
PROSKAUER
VOGES - PROSKAUER
OBJETIVOS

Determinar la capacidad de algunos


microorganismos para producir un producto final
neutro (acetilmetilcarbinol AMC, acetoína), a
partir de fermentación de glucosa .
Diferenciar entre géneros y especies dentro de
un género de la familia Enterobacteriaceae.
VOGES - PROSKAUER
FUNDAMENTO

 Es una prueba basada en la detección


de acetoína. La producción de acetoína
es una de las vías metabólicas de la
glucosa en bacterias.
VOGES - PROSKAUER
Metabolismo general

2
acetoína

+ CO2
VOGES - PROSKAUER
Fórmula de Clark y Lubs a pH 6,9

Peptonas 7.0 g

Glucosa 5.0 g
(dextrosa)
Buffer fosfato 5.0 g
dipotásico
Agua destilada 1,000 mL
VOGES - PROSKAUER
Pesar la cantidad
Δ solución fraccionar
exacta y
rehidratar con agua suavemente 5 mL por tubo

mín:
35º, inóculo liviano
18-24 h debajo de la Esterilizar
Incubar superficie
del medio, 121º, 15 lb, 15’.
tapas flojas.
recom:
30º,
3 -5 días. Agregar Interpretar
Reactivos Resultado:
VP +ó-
VOGES – PROSKAUER
® Reactivos VP de Barritt

α- naftol al 5%
A en EtOH
absoluto

B KOH al 40%
VOGES - PROSKAUER
® Reactivos VP de Coblentz

α- naftol al 5% en
A EtOH al 95%

Creatina al 0.3% en
KOH al 40%.
B Creatina N-metil-N-
guanilglicina;
NH:C(NH2N(CH3)C
H2COOH.
VOGES - PROSKAUER
® Reactivos VP único de O’Meara (modificado)

Creatina al 0.3%
en KOH al 40%
VOGES - PROSKAUER
®Método de utilización

1. Retirar una alícuota 2. Agregar los reactivos V-P


para la prueba V-P
I. Reactivos de Barritt o
a. Barritt: 2.5 mL Coblentz
b. Coblentz: 2.0 mL a. 0.6 mL del reactivo A
c. O’Meara: 1.0 mL b. 0.2 mL del reactivo B
II. Reactivo de O’Meara
a. Agregar 1 mL del
reactivo
VOGES - PROSKAUER
®Método de utilización

3. Dejar reposar los tubos antes


de interpretar el resultado.

a. Tubos con Barritt: 10 – 15’.


b. Tubos con Coblentz: 10 – 20’.
c. Tubos con O’Meara: 35º ó
22-25ºC, leer a las 4h.
VOGES - PROSKAUER
® Acción del reactivo
fermentación
Glucosa Acetoína

KOH 40%
Acetoína + α-naftol Diacetilo + 2 H2O

o 2
condensación
Diacetilo + Núcleos de guanidina color
rosado-rojo
de la peptona
VOGES - PROSKAUER
® Microorganismos utilizados para el control de calidad

Bacteria VP +/ -

E. coli -

Enterobacter +
cloacae
VOGES - PROSKAUER
® INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

VP+
color rosado-rojo, en la
superficie del medio (acetoína
presente).

VP -
Color amarillo en la superficie
del medio; color cobrizo se
debe a los reactivos cuando
se mezclan.

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