CULTURA DE

PROTOPLATI
Cultura de protoplati
Din sistematica vegetal i animal se cunoate
faptul c speciile sunt delimitate prin bariere de
incompatibilitate sexual, ceea ce reduce posibilitile de
ncruciri interspecifice.
Creterea variabilitii genetice, att de necesar n
lucrrile de ameliorare i selecie, implic gsirea unor
metode de rupere a barierelor de incompatibilitate care
izoleaz speciile ntre ele.
Aceasta a devenit realizabil prin crearea de
protoplati din celulele somatice izolate i fuziunea lor,
ca unic mijloc de amestecare a genomurilor cloroplastice
i mitocondriale.

La esuturile vegetale, membrana celulozic i stratul pectic care
asigur sudura dintre celule face imposibil manipularea direct a
celulelor n scopul fuzionrii lor.
De aceea s-a urmrit gsirea unor tehnici de dezagregare a
membranei pectocelulozice, ajungnd la forma de protoplati.
Cultura de protoplati
Definiie. Protoplatii sunt celule
somatice nude lipsite de membrane
pectocelulozice rigide (perete celular) care au
capacitatea de a fuziona, de a se divide n
continuare i de a da natere la noi plante.
Cultura de protoplati
Primele ncercri de eliberare a protoplatilor din esuturile
vegetale au fost fcute de Klercker (1892) care a elaborat
metoda mecanic de separare a celulelor prin plasmolizare
total i microdisecia membranelor. Aceast metod era ns
traumatizant i puin eficient.
Mai trziu, n 1960, Cocking n Anglia, Otsuki i Takebe (1969)
n Japonia au elaborat metoda enzimatic de producere a
protoplatilor, metod n care se folosesc enzime extrase din
microorganisme ce diger peretele rigid al celulelor vegetale.
Metoda elaborat de Cocking, utilizat pn n prezent, permite
obinerea unei cantiti mari de material biologic modificat, cu
meninerea viabilitii i structurii nealterate a celulelor.
Takebe (1971) a obinut primii protoplati viabili, prin digerarea
enzimatic a membranelor celulozice de la celulele frunzelor de
tutun. Au urmat realizri privind obinerea de protoplati la
Daucus carota (Grambow, 1972) i la Petunia hybrida
(Hess,1973).
Cultura de protoplati
Protoplatii pot fi izolai din toate organele i esuturile plantelor:
mezofilul frunzelor;
esuturi epidermale;
rdcini i nodoziti ale rdcinilor;
muguri, petale;
gruncioare de polen n curs de germinare;
fructe, semine;
esuturi cultivate in vitro.
Materialul cel mai utilizat este reprezentat de frunze de la care se ia
epiderm inferioar prin jupuire sau printr-un tratament enzimatic.
Dintr-un gram de frunze proaspete se pot obine circa un milion de
protoplati i cteva milioane de plante noi.
Recent, au nceput s fie utilizate fragmente de calus, izolate din
culturi de esuturi in vitro (care au o cretere rapid dac sunt
asigurate condiii riguros controlabile).
Cultura de protoplati
Protoplatii se obin de obicei prin
tratarea esuturilor vegetale genitoare,
secionate n fragmente nguste, n
condiii aseptice, cu un amestec de
enzime, capabile s degradeze peretele
celular, n soluii care conin stabilizatori
osmotici (protectori) necesari pentru a
pstra structura celular i a menine
viabilitatea acestora.
Principalii stabilizatori osmotici
folosii n doze reduse sunt: manitol,
sorbitol, amestec de polivinilpirolidin
(2%) cu zaharoz.

Tehnologia culturilor de protoplati
Tehnologia culturilor de
protoplati necesit cunoatera i
stpnirea complet a diferitelor
etape care pornesc de la
explantul donor pn la planta
regenerat:
obinerea de protoplati viabili;
regenerarea pereilor celulari;
inierea diviziunilor celulare;
meninerea diviziunilor pn la
obinerea microcalusurilor;
regenerarea plantelor din aceste
calusuri.
Surface
Sterilisation
Soak in water Preplasmolysis
Remove lower
epidermis
Enzymes
Cell wall
Protoplast
Enzyme treatment
Isolated
protoplasts
Washing process to remove debris
Culture
on agar
Tehnologia culturilor de protoplati

1. Izolarea protoplatilor se realizeaz prin 2
metode:
- metoda mecanic (presupune tierea esutului
vegetal plasmolizat n prealabil, n fii subiri i
microdisecia membranelor)
- metoda enzimatic

2. Purificarea

3. Incubarea

Etape ale izolrii i cultivrii protoplatilor
Tehnologia culturilor de protoplati
Izolarea protoplatilor prin metoda enzimatic
n compoziia peretelui celular au fost identificate 3 componente
de baz: celuloz, hemiceluloz i substane pectice.
De aceea, dup o plasmolizare uoar, pentru izolarea
protoplatilor se folosesc trei categorii de enzime: pectinaze,
celuloze i hemiceluloze care sunt introduse n esuturi prin
metoda infiltraiei in vacuum.
Aceste enzime cu activitate hidrolizant sunt extrase din
microorganisme (Aspergilus niger, Trichoderma viride) i
dispersate n soluii apoase cu concentraii cunoscute.
n prezent produsul comercial cel mai utilizat n tehnologia
protoplatilor este celuloza Onazuka R-10, iar dintre pectinaze o
larg utilizare o au preparatul Macerozyme R-10).
Tratamentul cu enzime se realizeaz timp de 4-18 ore, la
temperatura de 25-27 0C, pentru a asigura hidrolizarea
pectinelor i a moleculelor de celuloz din membrane.
Tehnologia culturilor de protoplati
1. Izolarea protoplatilor prin metoda enzimatic

Factorii implicai n izolarea cu succes a
protoplatilor vegetali:
tipul i concentraia enzimelor hidrolitice specia vegetal
explantul utilizat (frunze, cotiledoane, rdcini, calus)
alegerea agentului plasmolizant corespunztor,
metodele, condiiile de incubare (durat, temp., lumin)
metodele de purificare.
Izolarea protoplatilor din mediul de incubaie se
face prin 2-3 centrifugri la viteze reduse, timp de 7-10
minute (asigurnd sedimentarea lor), dup care urmeaz
splarea restului de enzime cu soluie de zaharoz
(15-20 %) i NaCl.
Tehnologia culturilor de protoplati

1. Izolarea protoplatilor prin:
- metoda mecanic
- metoda enzimatic

2. Purificarea

3. Incubarea

Etape ale izolrii i cultivrii protoplatilor
Tehnologia culturilor de protoplati
2. Etapa de purificare

Procesul de izolare a protoplatilor
este urmat de etapa de purificare,
necesar pentru obinerea unor suspensii
celulare pure, necontaminate cu resturi de
celule distruse sau perei celulari nedigerai.
Purificarea se realizeaz prin centrifugri i
resuspendri succesive n soluia cu
stabilizator osmotic.
Dup centrifugare, la interfaa dintre
cele dou soluii se formeaz un inel de
culoare verde n care sunt concentrai
protoplati viabili, iar resturile nedigerate i
celulele moarte se depun la fundul
eprubetei.
Tehnologia culturilor de protoplati

1. Izolarea protoplatilor se realizeaz prin 2 metode:
- metoda mecanic
- metoda enzimatic

2. Purificarea

3. Incubarea

Etape ale izolrii i cultivrii protoplatilor
Tehnologia culturilor de protoplati
3. Incubarea
Timpul de incubare variaz n funcie de natura i
vrsta materialului biologic iniial utilizat pentru izolare.
Cultura protoplatilor poate fi fcut att pe mediu
lichid, medii semisolide sau pe medii combinate lichide i
solide.
Protoplatii n stare purificat sunt trecui n alte
medii lichide. Mediul de cultur este foarte complet,
bogat n sruri minerale, vitamine, substane
stimulatoare de cretere, asigurnd regenerarea unui
nou perete celular.

La unele specii, protoplatii regenereaz peretele celular n 2-3 zile i
concomitent intr n diviziune. Dup 20-25 zile se formeaz o colonie
celular, din care va apare un calus (30-45 zile). Din calus vor genera
lstari vegetativi sau rdcini, n funcie de suplimentarea mediului nutritiv
cu citochinine sau auxine.
Plantulele nrdcinate (mature) se formeaz n 4-6 luni, dup care
sunt transplantate n ser.
Tehnologia culturilor de protoplati
Testarea viabilitii protoplatilor
nainte de a se efectua o cultur de
protoplati este necesar s se
determine viabilitatea acestora. Se
realizeaz prin examinarea suspensiei
de protoplati la microscopul optic.
Protoplatii viabili prezint cureni
citoplasmatici, evideniai prin deplasri
ordonate ale mitocondriilor, au form
perfect sferic, iar cloroplastele sunt
aranjate ordonat n stratul citoplasmatic
periferic.
Protoplatii mori (distrui) prezint
forme neregulate, iar cloroplastele
formeaz aglomerri la unul din polii
celulei.

Cultura de protoplati
Aplicaii la plantele floricole
n momentul de fa lista speciilor de plante floricole
de interes economic la care s-a realizat regenerarea de
plante de la protoplati este destul de cuprinztoare.
Ex.: Digitalis lanata, D. purpurea, Helianthus annuus,
Ipomoea batatas, Lolium multiflorum, L. corniculatus,
Nicotiana sp., etc.
Aceast tehnic permite:
cercetri aprofundate asupra funcionrii celulei;
aplicarea de tratamente mutagene la celule izolate;
obinerea unor plante rezistente la bacterii, ciuperci i
chiar duntori;
permite manipulri genetice ca introducerea sau
substituirea de gene.
Cultura de protoplati
Protoplatii sunt celule vegetale nude
folosite pentru manipularea materialului genetic:
hibridare somatic
transformare cu ADN exogen
transferul de cromozomi, nuclee i diverse
organite celulare
studiul virozelor vegetale
elucidarea modului de aciune al agenilor
patogeni bacterieni i fungici.
Etapele procesului de izolare a protoplatilor