Carga bacteriana y diagnstico

molecular de la sepsis :

Un nuevo paradigma
Dr. Miguel Angel Luzardo Urdanteta
Mdico Puericultor Pediatra
Especialista en Medicina Crtica Peditrica
Hospital Manuel Noriega Trigo (IVSS)
Maracaibo
Carga bacteriana y diagnstico molecular de la
sepsis bacteriana
Antecedentes
THIAGO, L. y col. We should be measuring genomic bacterial load and vrulence factors. Critical Care medicine 2010 Vol. 38 Nro 10 (supl.)
Usar una carga microbiolgica cuantitativa no es un nuevo
concepto en la practica clnica.

La carga bacteriana pudiese tambin ser usada con el fin de
evaluar la severidad, la respuesta de monitoreo microbiolgico
a la terapia, y evaluar el pronstico en los pacientes spticos

La observacin de que las mediciones de carga bacteriana no
son afectadas por el retraso en la sumisin de la muestra o por
la administracin de antibiticos antes de la admisin
hospitalaria.
Un alto conteo bacteriano en sangre de nios con bacteriemia
est asociado con un incrementado riesgo al desarrollo de una
enfermedad mas severa.


Ventajas:
El diagnstico molecular promete mucho para la deteccin de
patgenos tpicos y atpicos causante de sepsis

Elimina la preocupacin acerca de la viabilidad reducida del
organismo asociado con el transporte de muestras y los efectos
de terapia antibitica previa

La deteccin de ADN del patgeno basado en PCR es
biolgicamente significativo





Carga bacteriana y diagnstico molecular de la
sepsis bacteriana
Evidencia
Cohen J. Diagnosing sepsis: Does microbiology matter? Critical Care 2008; 12: 212
0.80


0.60


0.40


0.20



0.00
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00
Probabilidad predicha de shock sptico como una funcin de la carga bacteriana del
St. Pneumoniae detectada por PCR-rt cuantitaitva
RELLO, Jordi y col. Severity of penumococcal pneumonia associated with Genomic bacterial Load. CHEST. Nro. 136. 2009.
P
r
o
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Nmero logaritmico de copias /ml
La carga bacteriana pudiese tambin ser usada con el fin de evaluar la
severidad, la respuesta de monitoreo microbiolgico a la terapia, y evaluar el
pronstico en los pacientes spticos
Resultados acorde a la categora 16S en pacientes con enfermedad neumocccica
Rello J, Lisboa T, Lujan y col. Severidad de neumonia neumocccica asociada con carga genmica bacteriana. Chest. 2009; 136: 832-840
Carga bacteriana y diagnstico molecular de la sepsis bacteriana
Evidencia
Importancia de los factores de virulencia
Streptococcus pneumoniae:
PsPa y Pspc, neumolisina y
citolisina clave para
elaboracin de vacunas

La combinacin del tipo
capsular y el trasfondo gentico
es importante en determinar la
virulencia




1. Anderson R. Stell HC y col. Comparison of effects of Macrlides, amoxicilin, ceftriaxone, doxycycline, tobramycin and fluoroquinolones on teh production of
pneumolysin by Streptococcus pneumoniae in vitro. Journal of Antibiotic chemotherapy 2008; 60: 1155-1158
2. Garca Suarez y col. Streptococcus pneumoniae virulence factors and their clinical impact: An Update. Enferm Infecc Microbilo Clin. 2006; 24: 512-517
3. Gor Do y col: Relationship between surface accesibility for PpmA, PsaA and PspA and antibody mediated immunity to systemic infection by Streptococcus
pneumoniae. Infect Immunology 2005; 73: 1304-1313
Factores de virulencia
Stafilococcus aureus:
Posee Molculas de la matriz adhesiva reconocedoras de
componentes de superficie microbiana (MSCRAMMs)

Puede formar biopeliculas en el husped y las superficies de
prtesis

Sus antgenos pueden producir un sndrome tipo sepsis
iniciando una tormenta de citocinas

Presencia de la PVL (Panton-Valentine)


1. Gordon RJ, y col. Pathogenesis of methicilin-resistant Staphylococcus aureus infection. Clin Infect diseases 2008; 46: S350-S359
2. Donlan Rm, y col.: Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiolo. Rev 2005; 15: 167-193
Factores de virulencia
Pseudomonas aeruginosa:
Hauser Ar, y col. Type III protein secretion is associated with poor clinical outcomes in patients with ventilator-associated pneumonia caused by Pseudomonas
aeruginosa. Crit Care Medicine 2002; 30: 521-528

Roy Burmann A, y col. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Diseases
2001; 183: 1767-1774
Posee sistema de secrecin tipo 3

Cuatro toxinas han sido identificadas hasta la fecha:
ExoS, ExoT, , ExoU y ExoY

Este tipo de secrecin est asociada con una
mortalidad mayor en pacientes con un alto tenor
bacteriano en las secreciones respiratorias

Autoinductores que son liberados por las bacterias
en el entorno


Mtodos de diagnstico Microbiolgico y Molecular
Los avances en la microbiologa molecular ha conllevado
al desarrollo de nuevos estudios moleculares con el
potencial de diagnostica la sepsis rpidamente y
confiablemente

La sensibilidad de cualquier ensayo molecular es
dependiente del campo de ADN bacteriano a partir del
proceso de extraccin y la presencia de inhibidores

La calidad del estudio tambin es afectada por la
contaminacin (bacteriana, fungica o con ADn humana,
contaminacin cruzada del laboratorio y bajos niveles de
ADN del patgeno en bacteriemias de bajo grado.

Gescher DM, Kovacevic y col. Fluroescence in situ hybridisation (FISH) accelerates identification of Gram positive cocci in positive blood cultures. Int. Journal
Antimicrobian Agents 32 (Supp1 ) S51-S59 (2008)
El FISH involucra la identificacin del
organismo despus de la hibridacin con
sondas de ADN marcado con fluorescente y
siendo visualizadas estas muestras bajo el
microscopio ptico o con fluorescencia.

El FISH permite una rpida identificacin del
organismo y la institucin de terapia
antimicrobiana y redujo unos 30 das la
mortalidad.
Tcnicas FISH basadas en hibridacin
Mtodos de amplificacin
La PCR amplifica regiones diana especificas en el
genoma bacteriano.

La mayor parte de estas regiones es el gen ARNr 16S
un gen ubicuo que es preservado en todas las bacterias
y que comprende tanto regiones variables como
conservadoras
Woese CR. Bacterial Evolution. Microbiology Rev. 51 (2), 221-271 (1993)
Las amplificaciones de PCR dirigidas a
regiones conservadas, como las panbacterianas
(ARNr 16S) o panfungicas (regiones de ADN
espaciador transcrito internamente), son tiles
cuando son seguidas por la secuenciacin de la
hibridacin


Los cebadores de PCR universales o de amplio
espectro son usados para detectar la presencia o
ausencia de ADN bacteriano o fngico en
muestras de pacientes
Estudios de PCR de amplio espectro
Evertsson U y col. Detection and identification of fungi in blood using broad range 28S rDNA PCR amplification an species-specific hybridisation. APMIS 108
(5), 385.392 (2000)
Schabereiter-Gurtner C, y col. Evaluation of a protocol for molecular broad range diagnosis of cultue-negative baterial infections in clinical routine diagnosis. J.
Appl. Microbiol. 104 (4), 1228-1237 (2011)
Estas PCR estn basadas en secuencias gnicas especificas seleccionadas
usando informacin a partir de secuencias genmicas completas
documentadas

Los estudios especficos de genes son tiles en condiciones donde la
determinacin de las especies pueda retrasa la identificacin final

Los estudios especficos de patgeno pueden ser tiles en las situaciones
perinatales donde los patgenos especficos son sospechados (ejm
Streptococcus del grupo B y E. Coli en la sepsis de aparicin temprana.

Estudios con PCR especfica de Patgenos
Klingspor L, y col. Molecular detection and identification of Candida and Aspergillus spp. From clinical samples using real time PCR. Clinical
microbiological Infect. 12 (8); 745-753 (2010)
Bergseng H y col. Real time PCR targeting the sip gene for detection of group B Streptococcus colonization in pregnant women at delivery. J.
Med. Microbiology 56 (Pt 2). 223-228 (2007).
Estos estudios de PCR que diferencian rpidamente
entre organismos gran positivos y gran negativos
pueden tener valor clnico en la optimizacin de la
terapia antibitica.


Las capacidades de deteccin del estudio son
limitadas por los primers seleccionados (limitando el
numero de microorganismos detectados) y el sistema
tambin es intil para evaluar la susceptibilidad
antimicrobiana.

PCR Multiplex
Mancini N, Caletti y col. Molecular diagnosis of polymicrobial sepsis. J. Clinical Microbiology. 47(4), 1274-1275 (2010)
Matrices de sondas para objetivos
genmicos especficos de organismos
y han sido usados para la
identificacin directa de organismos a
partir de muestras de pacientes.

Puede evaluar los genes de resistencia
antibitica y los marcadores de
virulencia por ejemplo del SAMR


Plataforma de microestudio de ADN
1. Cleven BE, y col. Identification and characterization of bacterial pathogens causing bloodstream infections by DNA microarray. J. Clinical microbiology.
44(7), 2389-2397 (2008)
2. Palka-Santini M, y col. Rapid identification, virulence analysis and resistance profiling of Staphylococcus aureus by gene segment based DNA
microarrays:application to blood culture post-processing. J. Microbiol. Methods 68(3), 468-477 (2007)
Mtodos moleculares en el diagnstico de la sepsis
Hibridacin Amplificacin
Estrategias de
deteccin
postamplificacin
Mtodos de
cidos no
nucleicos
FISH
PNA FISH
Hibridacin por sonda
Microensayos
PCR
PCR de amplio espectro
PCR especifica de patgeno
PCR multiplex
PCR + secuenciacin
PCR + Pirosecuenciacin
PCR + Hibridacin
PCR + MALDITOF-MS
Proteomica
Espectroscopa
Estudios de fagos
Adaptado de: Venkatesh, Flores y col. Molecular microbiological methods in the diagnosis of neonatal sepsis. Expert review Anti infect.
Therapy. 8(9) 1037-1048 (2010)
Los estudios moleculares son rpidos y requieren pequeos
volmenes de sangre

Pueden ser automatizados, permitiendo un alto desempeo y
reducen el trabajo microbiolgico comparado con los
hemocultivos

Los mtodos moleculares pueden evaluar la virulencia y la
resistencia antibitica que puede informar para el beneficio
de la terapia
Conclusiones Finales
Los resultados positivos de los mtodos moleculares mas
sensibles (deteccin de ADN del patgeno) en el caso de un
hemocultivo negativo (ausencia de organismos viables)
necesita ser interpretado cuidadosamente en un entorno
clnico. La contaminacin de la muestra necesita ser excluida.

Los resultados falsos negativos a partir de estudios
moleculares pueden ser debidos a ADN insuficiente, presencia
de bajos niveles de ADN del patgeno o la presencia de
inhibidores.

Conclusiones Finales
Los altos valores predictivos negativos de una
evaluacin diagnostica pueden ser clnicamente tiles en
reglamentar la sepsis y evitar antibiticos innecesarios

Los costos, disponibilidad de equipo y habilidades
tcnicas en el laboratorio microbiolgico son
consideraciones importantes

El costo efectividad de los nuevos estudios moleculares
deberan ser establecidos antes de la aceptacin amplia en
la prctica clnica

Conclusiones Finales
Corazn y Alma
100% Chiquinquireo