Sunteți pe pagina 1din 35

Obiectivul principal al biotehnologiei plantelor este acela de a

crea noi varieti de plante cultivate. Cele mai importante aplicaii


ale biotehnologiei moleculare vizeaz modificarea coninutului
nutritiv al plantelor, dar i introducerea n genomul unor plante de
cultur a noi gene, care s confere rezisten la atacul unor
insecte, virusuri, rezisten la erbicide, stres i senescen.

Mai mult, unele dintre cele mai moderne aplicaii n domeniu
au ca obiectiv modificarea cilor biochimice care sunt
responsabile de pigmentaia florilor, precum i transformarea
plantelor n adevrate bioreactoare.
Plante rezistente la atacul unor insecte

Dac plantele de cultur pot fi manipulate genetic n vederea
dobndirii capacitii de a produce insecticide funcionale, se
ntrevede posibilitatea obinerii de plante care s fie rezistente la
atacul unor insecte, eliminndu-se astfel necesitatea stropirilor
(uneori necesare a fi efectuate de 8 ori pe parcursul unui sezon de
vegetaie), att de costisitoare i capabile s introduc n
ecosisteme substane potenial periculoase.

S-a estimat c n 1995, n ntreaga lume s-au cheltuit peste 4
miliarde de dolari pentru insecticide. n mod evident, costul
ntreinerii unor culturi rezistente la atacul insectelor este mult mai
mic dect cel necesar meninerii unor culturi sensibile la boli i
duntori. n plus, insecticidele biologice sunt, n mod normal,
extrem de specifice fa de un numr redus de specii de insecte, i
pot fi, n general, considerate ca inofensive pentru om i
eucariotele superioare.
n timp, au fost puse la punct un numr de strategii menite s
asigure rezistena unor plante de cultur fa de atacul unor insecte
duntoare. Un astfel de demers implic folosirea unei gene
responsabile de biosinteza unei protoxine cu aciune insecticid,
gen provenit de la cteva subspecii ale bacteriei Bacillus
thuringiensis (B. thuringiensis).

O alt strategie abordat este cea a utilizrii unor gene ce
codific de sinteza unor proteine vegetale (cum ar fi inhibitori de
amilaz i/sau proteaz), cu efect demonstrat mpotriva unei largi
varieti de insecte. Odat ce o insect ingereaz astfel de
inhibitori, consumnd respectiva plant, nu va mai fi capabil s
digere alte plante, deoarece digestia amidonului i a altor nutriente
vegetale va fi blocat. n acest fel, insectele se vor hrni din ce n ce
mai puin.
Protoxina produs de B. thuringiensis nu este remanent
n mediu i nici nu este periculoas pentru mamifere, ceea ce
nseamn c protecia, pe aceast cale, a plantelor, este
nepoluant i sigur.

Din pcate, preparatele coninnd aceast toxin, pulverizat
pe suprafaa plantelor, nu sunt eficiente mpotriva insectelor care
triesc n interiorul plantei. Din acest motiv, genele aparind
bacteriei i care sunt responsabile de sinteza toxinei, trebuie s
fie exprimate de chiar celulele plantelor receptive. Utilizarea unor
astfel de plante transgenice, elimin necesitatea stropirilor cu
preparate coninnd toxine de la B. thuringiensis.
Un experiment reuit n acest sens este cel de obinere a unor
plante transgenice de tomate. Aceste plante produc, pe baza unei
secvene mai scurte a genei de la B. thuringiensis, o protoxin
capabil a oferi protecie mpotriva a numeroase insecte
duntoare.

Aceast "versiune" mai scurt a genei, a fost pus sub controlul
unui promotor constitutiv foarte puternic (promotorul 35S de la
virusul mozaicului conopidei) i al unei secvene terminator eficiente
(situsul poliadenilat de terminare a transcripiei nopalin-sintetazei).

Acest ansamblu a fost clonat n regiunea T a ADN-ului unui
vector plasmidial cointegrat de tip T.
Gen marker
selectabil
vegetal (NFT)
ori
E. coli
de la
Bordur
dreapt
tNOS
tNOS
pNOS
p35S
Gena
toxinei
de la . B.t
Spc
r
Secvent de
ADN omolog
Structura unui vector de clonare cointegrat, purttor al genei de la B. thuringiensis, care codific o
protoxin cu efecte insecticide
Vectorul conine gena de rezisten la spectinomicin (Spc
r
), care
permite selecia celulelor transformate, att la E. coli, ct i la A.
tumefaciens. Plasmida conine i o origine de replicare provenit de
la E. coli i gena neomicin fosfotransferazei, plasat sub controlul
promotorului genei nopalin-sintetazei i cu un situs poliadenilat de
terminare a transcripiei.

Selecia poate fi realizat astfel n prezena kanamicinei. n plus,
vectorul cointegrat posed o regiune de bordur dreapt provedit de
la o plasmid Ti a nopalinei i un segment din plasmida Ti a
octopinei, care ofer regiuni de omologie, necesare recombinrii
homologe cu o plasmid Ti lipsit de regiunea ADN-T.

Plasmida astfel construit i manipulat la E. coli, este
transferat, prin conjugare, la o tulpin de A. tumefaciens, coninnd
o plasmid Ti lipsit de ADN-T (plasmid dezarmat). Dup
recombinare, mica secven a genei protoxinei este transferat n
ADN-ul cromosomial al plantelor de tomate.
Att n sere, ct i n cmpurile experimentale, plantele
transgenice de tomate s-au dovedit rezistente ntr-o msur mai mare
sau mai redus fa de atacul larvelor unor insecte duntoare:
Manduca sexta, Heliothis zea i Keiferia lycopersicella.
Protecia fa de duntori nu este ns total i nici nu are
aceeai eficien fa de toi duntorii urmrii n experimente. De
regul, n fiecare caz, protecia maxim s-a obinut i prin
administrarea unei doze foarte reduse de insecticid chimic.

ntr-un efort dramatic de a mri nivelul de expresie a genelor
pentru protoxina bacterian, s-au pus la punct alte dou metode.
Ambele experimente au utilizat, pentru clonare, versiuni modificate ale
genei toxinei bacteriene, fie prin mutagenez situs-specific, fie prin
sintez chimic.

Plantele transgenice obinute au prezentat nivele ale expresiei
genei toxinei de la B. thuringiensis, de peste 100 ori mai mari dect
cele nregistrate n cadrul primului experiment, n care s-a utilizat
varianta slbatic (natural i nemodificat) a genei.
Plante rezistente la infecii virale

Virusurile care infecteaz plantele produc n fiecare an mari pierderi
de recolt. n absena unor tratamente chimice eficiente, cultivatorii
au ncercat s transfere, pe cale natural, deci prin hibridri,
rezistena la infecii virale, aprut spontan la unele plante. Din
nefericire, chiar n cazul soiurilor rezistente, apar frecvent reversii la
starea de sensibilitate fa de virus, iar rezistena fa de atacul unui
tip de virus nu confer rezisten i n faa infeciei cu ali virui, chiar
nrudii.
n ultimii ani, cercettorii au nceput s utilizeze tehnici de inginerie
genetic n scopul producerii de plante transgenice care s manifeste
rezisten fa de infeciile virale.
Aceste metode se pot grupa n trei categorii, n funcie de strategia
abordat:
imunizarea plantei prin folosirea unor gene care codific pentru
proteine din anvelopa viral;
utilizarea altor gene virale;
folosirea unor secvene genice virale antisens, menite s confere
rezisten.
Cnd plantele transgenice exprim gene care codific proteine din
anvelop viral (cele mai abundente proteine la nivelul unui virus), aparinnd
unui virus care infecteaz n mod obinuit respectivele plante, capacitatea
aceluiai tip de virus de a infecta aceste plante i de a se rspndi sistemic n
organismul vegetal este, de obicei, masiv diminuat. Dei mecanismul prin
care proteinele din anvelop viral ale unui virus previn proliferarea aceluiai
virus nu este elucidat, este evident c efectul antiviral se produce timpuriu, n
primele faze ale infeciei virale, att timp ct orice activitati de replicare i/sau
sintez de proteine virale sunt puternic inhibate.
Folosind aceast metod, cercettorii au obinut, deja, numeroase plante
rezistente la diferite tipuri de virusuri.
O cale diferit de abordare a problematicii rezistenei plantelor la infecii
virale se bazeaz pe folosirea moleculelor antisens.
Att la eucariote, ct i la procariote, o molecul de ARN, care este
complementar cu un transcript genic (deci cu o molecul de ARNm), poart
denumirea de ARN antisens. ARNm transcris este considerat a fi ARN sens.
Prezenta unui ARN antisens poate provoca o scdere a nivelului translaiei
unei proteine specifice, deoarece molecula antisens, fiind complementar cu
ARNm specific, formeaz cu acesta un duplex, blocnd posibilitatea ARNm de
a fi translat, la nivelul ribosomilor. Mai mult, duplexurile ARN antisens - ARNm
sunt rapid degradate, ceea ce conduce la scderea numrului de molecule de
ARNm particulare pentru o anumit polipeptid, n celul.
n aceste condiii, este posibil, cel puin teoretic, s se produc o
plant transgenic, capabil s sintezizeze ARN antisens,
complementar cu ARNm necesar biosintezei proteinelor de capsid
ale unui virus specific, ceea ce ar avea ca rezultat blocarea proliferrii
i rspndirii sistemice a virusului respectiv.

Mai multe grupuri de cercettori au reuit s obin plante
transgenice care sintetizeaz ARN antisens, complementar ARNm al
unor proteine virale de anvelop i au testat capacitatea acestor
plante de a rezista n faa atacului respectivului virus. S-a constatat
ns c plantele manifestau rezisten doar n cazul n care titrul
inoculului viral folosit era redus, n caz contrar, la concentraii mari ale
virusului, maladia viral manifestndu-se i pierderile de recolt fiind
la fel de mari ca n cazul plantelor normale, nemanipulate genetic.

Evident, mai sunt necesare cercetri n vederea obinerii de
plante transgenice rezistente la infecii virale, utiliznd strategia mai
sus menionat.
O alt metod, menit s conduc la obinerea de plante
transgenice rezistente la infecii virale recurge la proteinele antivirale,
produse de ctre unele plante, n mod natural.
Un exemplu n acest sens este oferit de planta Phytolacca
americana, care produce trei proteine antivirale diferite, ce pot fi puse
n eviden la nivelul peretelui celular. Cele trei proteine sunt diferit
distribuite n organele plantei i sunt produse funcie de sezonul de
vegetaie. Astfel, proteina antiviral PAP I apare n frunzele de
primvar, PAP II este prezent n pereii celulari la nivelul frunzelor
de var, n timp ce PAP III se regsete n semine.
Cnd o cantitate redus de protein PAP purificat, este aplicat
pe suprafaa frunzelor de la alte specii de plante, plantele respective
vor manifesta imunitate" mpotriva mai multor tipuri de infecii virale.
Pe baza acestor observaii, cercettorii au ajuns la concluzia c
proteinele PAP ar fi candidaii ideali pentru un program de dezvoltare a
unor plante transgenice, rezistente la un larg spectru de infecii virale.
Plante rezistente la erbicide
Circa 10% din producia agricol mondial este pierdut n fiecare
an ca efect al dezvoltrii buruienilor duntoare, n condiiile n care,
anual, sunt cheltuite 10 miliarde de dolari pentru erbicide. Mai mult,
majoritatea erbicidelor nu acioneaz selectiv, doar asupra
buruienilor care infesteaz culturile agricole i, din nefericire,
numeroase erbicide polueaz mediul.
n aceste condiii, este lesne de neles interesul cercettorilor de a
gsi o modalitate de obinere a plantelor de importan agricol,
rezistente la erbicide.
n vederea realizrii acestui deziderat sunt prevzute un numr de
strategii, dintre care se pot meniona:
inhibarea prelurii erbicidului de ctre plant;
supraproducia proteinei-int a erbicidului de ctre planta sensibil,
astfel nct funciile celulare s nu fie afectate chiar n prezena
erbicidului;
reducerea capacitii proteinei-int a erbicidului de a se cupla la
acesta;
dotarea plantei cu o nou capacitate metabolic - aceea de a
inactiva erbicidul.

Erbicidul (erbicidele)
Modul de dezvoltare a rezistenei la erbicide
Triazine Rezistena este dobndit prin modificarea secvenei genei psbA, responsabil de bio-
sinteza proteinei-int a erbicidului, proteina D-1 cloroplastic
Sulfoniluree Gene care codific versiuni rezistente de acetolactat-sintetaz, introduse la orez i alte
plante de cultur
Imidazolinone Linii celulare mutante, purttoare ale unei forme rezistente de acetolactat sintetaz au
fost izolate din culturi de esuturi
Ariloxifenoxipropionai,
ciclohexandione
Aceste erbicide inhib activitatea acetil- CoA. Rezistena, selectat n culturi de esuturi,
este provocat de o form modificat a enzimei, insensibil la degradarea indus de
aceste erbicide
Glifosat Rezistena apare prin supraproducia de EPSPS (5-enolpiruvatsikimat-3-fosfat sintetaz),
proteina int a acestui erbicid. Rezistena a fost indus artificial, prin transformarea
plantelor de soia cu o gen de rezisten EPSPS la gliofosat, iar la tutun cu o gen a
gliofosat-oxidoreductazei, enzim cu capacitatea de a degrada gliofosatul
Bromoxinil Erbicidul acioneaz asupra enzimelor fotosintetizatoare II. Rezistena la tutun i bumbac
s-a obinut prin transferul unei gene bacteriene, care codific nitrilaz, enzim ce poate
descompune erbicidul
Acizi fenoxicarboxilici (2,4-D
i 2,4,5-T)
Plantele rezistente de bumbac i tutun au fost obinute prin transformare cu gena tfdA de
la Alcaligenes, care codific o dioxigenaz ce degradeaz erbicidul
Glufosinat (fosfinotricin) S-au utilizat pentru transformarea plantelor cu genele bar de la Streptomyces hygros-
copicus, sau gena pat de la S. viridochromogenes. Aceste gene codific fosfinotricin-
acetil-transferaza, enzim detoxifiant
Cianamid Plantele rezistente de tutun au fost obinute prin transformare cu gena cianamid hidrata-
zei de la fungul Myrothecium verrucaria. Enzima face conversia cianamidei la uree
Dalapon Plantele de tutun transformate genetic produc enzima dehalogenaz, pe baza informaiei
genetice a unei gene provenite de la Pseudomonas putida, enzima fiind capabil s
asigure detoxifierea
Plante rezistente la infecii bacteriene i fungi

Fungii fitopatogeni produc an de an mari daune i scderi de
producie la anumite plante de cultur. Se estimeaz c maladiile
fungice ale orezului, de exemplu, produc anual, n fermele din Asia
de SE, Japonia i Filipine, pierderi de peste 5 miliarde de dolari.

Rezolvarea, de regul doar parial, a acestei probleme se face
n prezent prin intermediul administrrii de antifungice, care, din
nefericire, se acumuleaz i persist n mediu, fiind de cele mai multe
ori, periculoase pentru sntatea oamenilor i animalelor.
Cercettorii au constatat c, n rspuns la invazia patogenului,
dar i la unii factori de strs din mediu, plantele sintetizeaz un grup
de proteine, cunoscute sub denumirea generic de proteine corelate
cu patogeneza (PR-pathogenesis related proteins).

Proteinele PR, includ -1,3-glucanazele, chitinazele i proteinele
taumantine-like (proteine similare taumantinei, o mic protein foarte
dulce), precum i proteaze. n scopul obinerii plantelor rezistente la
fungii patogeni, cercettorii au manipulat genomul vegetal n
vederea dobndirii transcripiei i translaiei constitutive (continue) a
genelor proteinelor PR. De exemplu, plantele transgenice pot
produce mari cantiti de chitinaz, enzim ce poate hidroliza
legturile -1,4-glicozidice dintre reziduurile de N-acetil-D-
glucozamin de la nivelul chitinei, componenta major a peretelui
celular al majoritii fungilor.
Caseta rezistentei la
higromicin
Caseta rezistentei la
chitinaz
Vector plasmidial purttor al genelor de rezisten la chitinaz la higromicin
n plus, unele plante manipulate genetic au i capacitatea de a
produce eficient -glucanaz. Aceste organisme dublu transgenice au
fost obinute prin hibridri ntre indivizi productori de glucanaz, pe de o
parte i indivizi productori de chitinaz. Plantele productoare de
chitinaz vor fi mai rezistente la atacul fungic, fa de plantele normale.
Deosebit de interesant este i faptul c plantele astfel manipulate,
dei sunt rezistente fa de fungii patogeni, nu altereaz capacitatea
speciei Glomus mosseae, de exemplu, de a se cupla cu rdcinile
plantei respective, aceasta fiind o interrelaie benefic att pentru plant,
ct i pentru fungul Glomus mosseae.
Acest comportament reflect de fapt diferenele de compoziie a
peretelui celular la diferite specii de fungi.
Un alt exemplu, legat de rezistena plantelor la atacurile bacteriene,
este oferit de cercetrile asupra cartofului i a bacteriei patogene
Erwinia carotovora.
Pierderile anuale n producia de cartof din ntreaga lume,
produse de aceast bacterie, aparinnd microflorei solului, se
cifreaz la peste 100 milioane de dolari. Mai mult, amelioratorii nu au
reuit s gseasc soiuri rezistente, n mod natural la infecia
bacterian.
n acest context, un grup de cercettori americani a reuit s
produc plante de cartof transgenice, care exprim n mod foarte
activ gena lizozimului aparinnd bacteriofagului T4. n plus, secreia
lizozimului a fost astfel dirijat nct enzima s se acumuleze n
apoplast (spaii intercelulare plasate n interiorul plantei), tiut fiind c
aceste spaii sunt folosite de E. carotovora pentru a penetra n
plant i a se rspndi n interiorul plantei.
Experimentele ntreprinse sunt extrem de promitoare, innd
cont de faptul c lizozimul este activ att mpotriva bacteriilor
Gram(+) ct i Gram(-), ceea ce ar putea permite obinerea de plante
rezistente fa de numeroi patogeni bacterieni.
Toleranta fata de stresul produs de mediu: temperatura,
umiditate, salinitate, prezenta metalelor grele

Toleranta fata de stresul biologic: rezistenta la buruieni,
atacul unor insecte, bacterioze, micoze, viroze

Cresterea valorii nutritionale
Cresterea duratei de viata
Male sterility
Modificarea formei, culorii si duratei de viata a florilor
Plasticul biodegradabil (PHB polihidroxibutirat)
Pharming