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CROMATOGRAFA

Determinacin
Separacin
Historia
M. Tswett (1903)
Martin y Synge (1941)
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el
que los componentes de la muestra se distribuyen entre dos
fases, una de las cuales es fija o estacionaria y la otra
mvil.

La velocidad de desplazamiento es funcin del coeficiente de
distribucin de cada componente entre las dos fases.
] [A
] [A
= D
FM
FE
FE
slido
lquido
gel
FM
gas
lquido
fluido sc
Fundamento del proceso
cromatogrfico
Forma de realizar dicho
proceso
tipos de
cromatografas
tcnicas
cromatogrficas
La naturaleza de las fases mvil y
estacionaria y la clase de equilibrios
implicados en la transferencia de los
solutos entre las fases, es decir, el
mecanismo de interaccin


Dispositivo utilizado para
conseguir el contacto entre la
fase mvil y la estacionaria
CROMATOGRAFIA PLANA
a - distancia recorrida por
el analito.
b - distancia recorrida por
el frente
x
b
a
Rf =
a
b
Es muy semejante a la Cromatografa lquida
tanto en aplicaciones como en funcionamiento
La fase mvil se mueve por capilaridad, gravedad
o bajo la accin de un campo elctrico (electro-cromatografa)
Cromatografa en Papel y Capa Fina (TLC)
Sembrado:
Puntiforme
Banda
Forma de sembrado: Manual (capilares jeringas)
x
Cualitativa
x x x x
x
Identificacin Pureza Ausencia
Cuantitativa
x x x x
Preparativa
Cromatografa de capa fina (1)
Fase Mvil
COOH
OH
NH
2

SH
CHO
CO
COOR
OCH
3

Hidrocarburos No Saturados
Hidrocarburos Saturados
Acidos carboxlicos
Alcoholes
Aminas
Tioles
Aldehidos
Cetonas
Esteres
Eteres
Alta
Baja
Polaridad
Agua
Metanol
Etanol
Acetona
Piridina
Eter dietil.
Cloroformo
Benceno
Tetracloruro
de Carbono
Ciloexano
Eter de
petrleo
Polaridad
Compuesto a
Cromatografiar
Tcnica
Compuestos
inicos
Acidos
Fenoles
Alcoholes
Aminas
Esteres
Aldehdos
Cetonas
Nitro deriv.
Halogeno deriv.
Hidrocarburos
alinfticos
Disolventes
Proceso por el cual la FM atraviesa la columna
Eluyente columna eluato
Velocidad de flujo (mL/min)
volumen de disolvente que atraviesa la columna
por minuto
Velocidad de flujo lineal (cm/min)
longitud de columna atravesada por el disolvente
en un minuto
V
0

Representa fsicamente los espacios intersticiales
entre las partculas empaquetadas en la columna que
son accesibles a la FM, e incluye adems los
volmenes internos del sistema
V= tF
volumen que ocupa en la columna la FM
V
0
= t
0
F
volumen de FM necesario para que se
produzca la elucin de un soluto

V
R
= t
R
F
V'
R
= t'
R
F
Representacin grfica de la respuesta del detector en funcin del tiempo,
volumen de eluyente o distancia en el lecho cromatogrfico.
funcionamiento del sistema
cromatogrfico
Informacin analtica
relativa a la muestra
t
0

t
R

Intervalo de tiempo que transcurre desde que el trazador es
insertado al principio del lecho cromatogrfico hasta que sale del
mismo.
El tiempo que tarda el mximo de un pico en ser eluido despus de la
inyeccin.
t'
R
= t
R
- t
o

t
R

Diferencia entre el tiempo de retencin del analito y el volumen muerto
de la columna, es decir, el tiempo que un analito es retenido en la columna
comparado con un compuesto no retenido.
k' = ( t
R
- t
o
) / t
o

Es la relacin entre el tiempo
que las molculas del analito
estn en la fase estacionaria y
el que estn en la fase mvil.
t
R
= t
0
(1 + K')
m m
S S
V C
V C
FM la en pasa soluto el que tiempo
FE la en pasa soluto el que tiempo
K = =
V
R
= V
0
(1 + K')

KPuede ajustarse
modificando la
fuerza de la FM
Define la capacidad de un sistema cromatogrfico para distinguir entre
dos componentes.
Es una funcin termodinmica que depende de las distribuciones relativas
entre las fases mvil y estacionaria.
Se expresa mediante el factor de selectividad o retencin relativa:
o
2,1
= t'
R,2
/ t'
R,1
= k'
2
/ k'
1

Para que una separacin sea posible, es necesario que los valores de Kde
los componentes de la mezcla sean diferentes.
Cuanto ms elevado es el valor de o , mayor es la selctividad de la FE, y
ms fciles las separaciones




No depende de la fuerza de elusin, si no de la afinidad
del soluto por la FM y FE
La variacin de puede lograrse de varios modos:
Modificando el pH de la FM
Empleo de aditivos
Cambio de FE

2
k
k
= o
La longitud de una columna en la que el soluto experimenta
un equilibrio completo entre las dos fases
La eficacia de la columna aumenta cuanto mayor es el nmero de platos
tericos y menor la altura del mismo.
Eficacia de una separacin cromatogrfica
nmero de platos
tericos (N)
altura del plato
terico (H)

N = L/H

Una columna cromatogrfica es ms eficaz cuando menores son
los ensanchamientos de banda que origina
N = t
R
2
/o
t
2

N = 16 t
R
2
/ W
b
2

N = 4 t
R
2
/ W
i
2

= 5,54 t
R
2
/ W
h
2

|
.
|

\
|
+1,25
B
A
1
)
W
/
t
( 41,7
= N
2
0, R
Es un factor que se refiere a la capacidad de un sistema
cromatogrfico para separar dos sustancias, teniendo en cuenta no
slo la separacin entre picos, sino tambin los anchos de la banda
R
s
= 2(t
R,2
- t
R,1
) / (w
b,1
+ w
b,2
)
4
N
k
+ 1
k
1 -
=
R
2
2
s
o
o
Selectividad (o), se relaciona con los valores
de retencin relativa y mide el poder
discriminatorio del sistema cromatogrfico.
Retencin (k'), mide la fraccin de eluito
presente en la FE y expresa el poder de
retencin del sistema cromatogrfico.

Eficacia (N), mide la estrechez relativa de los
picos mediante el nmero de platos tericos
con que funciona la columna
SEPARACIN EN CROMATOGRAFA
ENSANCHAMIENTO DE BANDA
Ensanchamiento de Banda Extracolumnar
Ensanchamiento de Banda Intracolumnar
Caminos multiples
Difusin de Eddy
Difusin longitudinal
Trasferencia de masa

Caminos mltiples Difusin longitudinal
Transferencia de masa
velocidad finita a la cual el soluto alcanza el equilibrio
entre ambas fases
la forma resultante de la banda depende
velocidad de elucin
difusin del soluto a lo largo de la columna
existencia de diferentes caminos que las diversas
molculas de soluto pueden seguir cuando se mueven
entre partculas de la fase estacionaria.
estos efectos dependen de la velocidad con que la fase mvil
atraviesa la columna, y constituyen un mecanismo diferente de
ensanchamiento de banda cromatogrfica.
Ecuacin de van Deemter para la AEPT (H)
Teora cintica: intenta responder la asimetra de los picos
cromatogrficos
Parmetros de eficacia
Ensanchamiento de los picos cromatogrficos: consecuencia de que los distintos
procesos de transferencia de masa durante el desplazamiento de una especie a lo
largo de la columna ocurren a velocidad finita.
Segn esta teora, la forma de los picos depende de los siguientes factores:
* Difusin por turbulencia y trayectorias seguidas por la fase mvil: (A)
* Difusin longitudinal del soluto a lo largo de la columna: (B)
* Equilibrio del soluto entre las fases mvil y estacionaria no es
suficientemente rpido: (C)
y su contribucin al ensanchamiento conduce a la ecuacin de Van Deemter:
Este modelo es clsico y
antiguo, pero es el ms
sencillo.
Multitud de trayectorias que toma la FM cuando fluye a travs de la
columna, que est empacada con partculas irregulares, en lecho
heterogneo.
Trmino A (difusin por turbulencia)
A : independiente de la velocidad
de FM, pero es funcin del tamao
de las partculas de FE, de forma
que:
A = d
p
Donde
: constante que depende de las
dimensiones, geometra y uniformidad del
empaquetamiento de la columna.
d
p
: Dimetro medio de las partculas de FE.
Partculas pequeas y
uniformemente empaquetadas
conducirn a columnas ms
eficaces !!!!
Difusin longitudinal del soluto en la FM.
Se produce porque la [soluto] < en los bordes de la banda que en el
centro, por lo que una banda de soluto que se mueva a lo largo de la
columna, se ensanchar cuando las molculas se difundan hacia las zonas
de menos concentracin, hacia adelante y hacia atrs de la banda.
Trmino B (difusin longitudinal)
Donde
: Factor de impedimento. Depende de las
caractersticas del relleno de la columna
(0.7 para columnas con relleno y 1.0 para
columnas tubulares abiertas)
D
M
: Coeficiente de difusin en FM
B = 2 D
M
En CL : contribucin de B al valor de H es despreciable por los bajos valores de
los coeficientes de difusin de los lquidos. No as en CG.


Relacionado con el hecho de que el equilibrio para la distribucin del soluto entre
FM y FE, se establece tan lentamente que una columna cromatogrfica siempre
opera en condiciones lejos del equilibrio.
Puede descomponerse en CS y CM, segn se considere la transferencia de masa
en FE y FM.
CS : despreciable para fases slidas (la transferencia del analito sobre la
superficie de un adsorbente es muy rpida).
CS para fases estacionarias lquidas, depende del espesor de la pelcula (df) y
del coeficiente de difusin del analito (D
S
).


CM : ensanchamiento de banda originado porque el equilibrio no se produce
instantneamente








Trmino C (resistencia a la transferencia de masa)

modificar o y K: variando la temperatura o la composicin de las fases
cambiar N modificando la longitud de la columna, y H variando el caudal de fase mvil, el
tamao de partcula del relleno, la viscosidad de la fase mvil y el grosor de la pelcula de
lquido adsorbido que constituye la fase estacionaria.


Objetivo
conseguir picos bien definidos y separados en el menor tiempo
posible de anlisis
variando las condiciones experimentales:
velocidad de flujo,
tamao de partculas de soporte,
temperatura de la columna,
seleccin de fase mvil y estacionaria ms adecuada,
aumentando la longitud de la columna, etc
La ecuacin de la resolucin sirve de gua para elegir las condiciones que permitan
una buena separacin: o, K' y N pueden ajustarse ms o menos
independientemente.
Aumento del nmero de platos de la columna mejora la
resolucin:
longitud de la columna, temperatura, tipo de analito,
caudal, tamao de la muestra, tcnica de inyeccin,
etc.
El resultado es un estrechamiento de las bandas con el
consiguiente aumento de la altura de las mismas; el
tiempo de retencin prcticamente no se modifica.

disminuir el tamao de partcula del
relleno
reducir la viscosidad de la fase mvil
lquida
Un aumento de K' generalmente aumenta la
resolucin pero tambin el tiempo de elucin.
Intervalo ptimo de valores de K: 1 a 5.

Con fases mviles gaseosas, K' puede
mejorarse aumentando la temperatura
Con fases mviles lquidas, cambiando la
composicin del disolvente.


Un aumento en el factor de selectividad produce
un desplazamiento relativo de los mximos de las
bandas, con un rpido aumento de la resolucin.
Los procedimientos para aumentar o sin
modificar significativamente K' son, por orden
decreciente de conveniencia:
1. cambiar la composicin de la fase mvil incluyendo cambios en el pH
(en separaciones de cidos o bases ionizables)

2. cambiar la temperatura de la columna, muy til sobre todo en
cromatografa de cambio inico

3. cambiar la naturaleza de la fase estacionaria: disponer de varias
columnas fcilmente intercambiables

4. utilizar efectos qumicos especiales; incorporar a la fase
estacionaria una especia que forme complejos o interaccione de otra
forma con uno o ms componentes de la muestra.
Ejemplo: usar un adsorbente impregnado con una sal de plata mejora la
separacin de olefinas debido a la formacin de complejos entre los
iones plata y los compuestos orgnicos insaturados.
Introduccin a la Cromatografa Liquidad de Alta
Resolucin (HPLC)
INSTRUMENTACIN EN HPLC
SEPARACIN
FASE MVIL
CARACTERISTICAS DEL SOLVENTE
Pureza
Viscosidad
ndice de refraccin
Punto de ebullicin
Toxicidad
Transparente al UV (cutoff)
Solubilidad
CARACTERSTICAS DE LAS BOMBAS
Da un flujo constante y exacto
Exactitud en la composicin de la fase mvil.
Suministra la fuerza necesaria para impulsar
la fase mvil hacia la columna.
SISTEMA DE LIBERACIN DEFASE
MVIL
Sistema de inyeccin
COLUMNAS
F. Normal F. Reversa
Fase estacionaria: polar
Fase mvil: baja polaridad Mediana polaridad alta
polaridad
Orden de elucin ??
Fases polares comunes

Fases no polares comunes

R = (CH
2
)
3
NH
3
Amino R = (CH
2
)
17
CH
3
Octadecilo
R = (CH
2
)
3
C = N Ciano R = (CH
2
)
7
CH
3
Octilo
R = (CH
2
)
2
OCH
2
CH(OH)CH
2
OH Diol R = (CH
2
)
3
C
6
H
5
Fenilo
Fase estacionaria: baja polaridad
Fase mvil: alta polaridad Mediana polaridad baja
polaridad
Si-O-Si-(CH
2
)
17
-CH
3
CH
3
CH
3
S
i
-
O
-
S
i
-
(
C
H
2
)
1
7
-
C
H
3

C
H
3

C
H
3

S i - O - S i - ( C H
2
)
1 7
- C H
3
C H
3
C H
3
S
i
-
O
-
S
i
-
(
C
H
2
)
1
7
-
C
H
3

C
H
3

C
H
3

COLUMNAS EN CROMATOGRAFA
DETECTORES
Caractersticas:
Sensibilidad
Selectividad
Linealidad
Informacin cualitativa
Reproducibilidad
Fcil uso
Universal
Cromatograma Dato de informacin cualitativa
t
R

Sustancia desconocida podemos
identificarla comparando su t
R
con el de un
patrn
dependen de una
variedad de
condiciones
experimentales
dividir la muestra en dos alcuotas: una de
ellas de cromatografa directamente,
mientras que a la otra se le adiciona una
cantidad dada de una sustancia patrn que
se sospecha existe en la muestra, y tambin
se cromatografa.
se obtiene conectando la lnea de base de
cada lado del pico por medio de una lnea
recta y midiendo la distancia perpendicular
entre esta lnea y el pico
precisin razonablemente grande
slo puede usarse cuando los picos son
agudos, estrechos y estn bien separados.

mayor precisin: independientes de los
efectos de ensanchamiento debido a las
variables experimentales
integradores electrnicos digitales
estimacin manual: triangulacin,
planmetro, pesada
Para que este mtodo sea exacto, deben darse las
siguientes condiciones:
1. Todos los analitos deben ser eluidos
2. Todos los analitos deben ser detectados
3. Todos los analitos deben tener la misma
sensibilidad
%A = rea del pico A/Ereas x 100

f
x
= f
s
(A
s
/A
x
) (w
x
/w
s
)

%X = (A
x
f
x
)/E(A
i
f
i
) 100

requiere un mtodo muy reproducible
de introduccin de la muestra
1. Debe eluir prximo a los picos de inters,
pero
2. Debe estar bien resuelto de ellos.
3. Debe ser qumicamente similar a los
analitos y no reaccionar con ningn
componente de la muestra.
4. Como cualquier estndar debe estar
disponible en forma pura.

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