UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
Dr. Luis Alberto Concepcin Urteaga
Profesor Principal Facultad de Medicina UNT
MTODOS DE
AMPLIFICACIN GENTICA
(PCR) EN EL DIAGNOSTICO
DE TUBERCULOSIS
En los ltimos 100 aos la nica prueba rpida para el
Dx de TBC ha sido el examen microscpico en cuanto la
muestra analizada contiene ms de 100,000 bacilos/ml.
Aunque la sensibilidad mejora cuando se trata la
muestra y se usa microscopio de fluorescencia siendo la
muestra (+) con menos de 10,000 bacilos/ml.
Esta sensibilidad es aceptable en TBC pulmonar, pero es
insuficiente en las formas paucibacilares como sucede
en la TBC extrapulmonar (meningitis TBC).
La prueba de oro sigue siendo el cultivo, pero su
limitacin es su lentitud, pero se ha visto parcialmente
resuelta con la incorporacin de nuevos mtodos de
cultivo sobre todo radiomtricos (BACTEC 460).
PCR ayuda a deteccin temprana y la posibilidad de
detectar genes de resistencia a los distintos
tuberculostticos de primera lnea.
TCNICAS DE DIAGNSTICO DE
TUBERCULOSIS
Bk
Cultivo Convencional
Cultivo con tcnicas radiomtricas (BACTEC)
Test de Adenosindeaminasa (ADA)
Inmunoreaccin (PPD)
Patologa (granuloma)
Biologa Molecular
MENINGITIS TBC: Urgencia.
Dx = Lquido mononucleares y ADA aumentado.
Lo que induce a un tratamiento emprico sin
certeza diagnstica.
Dx microbiolgico no es muy til ya que es (+) en
< 10% y el cultivo an siendo (+) tardar > 2
semanas.
En esta entidad clnica PCR
La Sensibilidad : 60-100%
Especificidad: 80-100%
Y debera ser considerada por su rapidez.
Mtodos de Amplificacin Gentica (AG)
Las pruebas de biologa molecular usados para el
Dx de TBC pulmonar:

AMTDT (Gen-Probe) basada en la amplificacin
enzimtica del RNA ribosmico.

AMPLICOR: (Mycobacterium TBC PCR test) basado
en la amplificacin del DNA mediante la reaccin
en cadena de la polimerasa
EL LCx (LCR Mycobacterium). Uso de la reaccin
de la ligasa.
FDA (Food and Drug Administration) ha
aprobado el PCR para muestras respiratorias
BAA (+), pueden tardar 6 8 horas.
PCR (+) y BAA (+) TBC Activa
PCR (-) y BAA (+) Mycobacterium no TBC.
Como las pruebas de PCR tiene una
sensibilidad > 25% que el frotis sta puede ser
til cuando hay sospecha clnica de TBC en
ausencia de BAAR en el frotis. Se prevee la
aprobacin de FDA en pacientes con BAAR (-)
en el futuro.
Utilidad en el Dx = TBC extrapulmonar
(meningitis). Sin embargo PCR (+) no obvia
cultivo ya que no informa sobre sensibilidad.
Autor Mtodo N
muestras
Sensibilidad
(%)
Especificidad
(%)
Tortoli, 1997
Lindbrathen, 1997
Piersimoni, 1998
Gamboa, 1998
Tortoli, 1999
Brown, 1999
Ruiz, 2000
Ruiz, 2000
LCx
LCx
AMTDT
LCx
AMPLICOR
AMTDT
AMTDT
LCx
147
17
184
526
113
21
57
57
71
90
54
78
59
67
53
63
99
97
99
99
99
75
100
100
Comparando con el cultivo los mtodos de AG tienen
menor sensibilidad. Sin embargo en estas
situaciones clnicas (Formas Extrapulmonares) el
mtodo de referencia es el clnico ya que no siempre
cultivo es (+).
Se inici tratamiento / x Patologa: Granulomas
caseificante (hgado, pleura ,ganglio),
xRx = Alteracin de va excretoria en TBC renal.
x ADA aumentado en LCR o pleural.
Aqu es donde los mtodos de Amplificacin gentica
muestra mayor sensibilidad que el examen
microscpico y cultivo.
En pacientes HIV por inmunodepresin
puede presentar TBC atpica (fiebre de
origen desconocido, granuloma no
caseificante).TBC con Rx Trax normal
Coinfeccin con diferentes
microorganismos.
Aqu se puede detectar Mycobacterium x
PCR y interpretndose como enfermedad.
DX DE TBC PULMONAR
Para valorar los mtodos de Amplificacin Gentica (AG).
en el Dx de TBC pulmonar
Tomando como referencia el cultivo. La sensibilidad de
AG en Dx de TBC pulmonar oscila 85 100%.
Si muestras son BAAR (+) sensibilidad de AG llega a
99%.
* 30 60% de BAAR(-) Son AG(+).
BAAR (+) y PCR (+) Confirma Mycobacterium TBC.
* Estudio realizado en 105 pacientes Dx = TBC pulmonar,
se detect 10 pacientes cultivo (-) y PCR (+).
De estos:
5 pacientes contacto de una microepidemia
escolar de TBC y adems PPD (+) y
infiltrados de lbulos superiores.
3 pacientes infiltrados no cavitarios detectados
en contactos de alto riesgo.
1 paciente mujer de 14 aos eritema nodoso.
contacto TBC.
1 Meningitis TBC con Rx trax normal y a la
semana de obtener esputo se observa
TBC miliar en Rx.
ANLISIS DE DISCREPANCIAS
Anlisis de BAAR, cultivo y mtodo de amplificacin gentica
(AG) analizarlos sin olvidar el paciente de donde procede la
muestra.
BAAR (-) y AG (+) Prob. Mycobacterium TBC Pulmonar.
BAAR (+)y AG(-) Prob. TBC atpica.
AG (+) Cultivo (-).
TBC paucibacilar
TBC tratada
Falso (+).
AG (-) cultivo (+) : Tuberculosis, salvo contaminacin
exgena.
Una vez descartado (problemas tcnicos: contaminacin,
procesado correcto de la muestra, presencia de inhibidores
enzimticos), repetir las tcnicas de Dx rpida (BAAR y AG).
VENTAJAS Y LIMITACIONES DE LOS METODOS DE AG (PCR).
Las ventajas que aportan los mtodos de AG respecto a los
mtodos clsicos son:
1. Sensibilidad respecto al examen microscopio y
rapidez respecto al cultivo en TBC pulmonar.
2. En TBC extrapulmonar los mtodos de AG son ms
sensibles que el examen microscpico y que el
cultivo.
3. La AG permite la confirmacin rpida de que el BAAR
detectado en microscopio es M. tuberculosis.
Una limitacin es el costo.
INDICACIONES DE LOS MTODOS DE
AMPLIFICACIN EN EL DIAGNOSTICO DE LA
TUBERCULOSIS
1. Confirmacin de M. Tuberculosis en BAAR(+)
2. Dx rpido en muestras BAAR (-).
3. Dx rpido de casos difciles (meningitis TBC, TBC
diseminada en pacientes con SIDA).
4. Evitar tcnicas cruentas (Biopsia pleural, extirpacin de
adenopata, bx heptica, biopsia sea.)
5. Evitar tratamientos empricos donde los mtodos
tradicionales han sido poco rentables (TBC renal, TBC
intestinal).
An. Fac. Medicina 2006; 67 (1)
30 muestras de bx pleural.
Con Dx AP = Pleuritis crnica, pleuritis tuberculoide y
reaccin granulomatosa.
18 muestras = bx pleurales con Dx negativo de TBC.
PCR vs Tincin de Fluorocromo en muestras histolgicas
de biopsia pleural.
Se evalu especificidad y sensibilidad de los mtodos
comparados con los criterios estndares de Dx
clnico de Tuberculosis.
48 casos
30 casos
Dx clnico 20 (67%) pleuritis TBC
TBC pleural 4 (13%) pleuritis crnica
3 (10%) pleuritis reaccional inespecfica.
2 (7%) pleuritis crnica inespecfica
1 (3%) pleuritis granulomatosa tuberculosa.
Tabla 1. Comparacin de casos por diagnstico histopatolgico,
tincin de auramina y resultados de TB PCR.
Diagnstico histopatolgico
Tincin de auramina TB-PCR
Negativo Positivo Negativo Positivo
Pleuritis crnica
Pleuritis crnica inespecfica
Pleuritis granulomatosa tuberculosa
Pleuritis reaccional inespecfica
Pleuritis tuberculosa
Diagnstico negativo de TB
4
1
1
3
4
18
0
1
0
0
16
0
4
2
1
3
20
18
0
0
0
0
0
18
4
2
1
3
20
0
4
2
1
3
20
18
31 17 48 19 29 48
Tabla 2. Comparacin entre los resultados de TB PCR
y los resultados de la tincin de auramina
TB PCR
Tincin de auramina
Negativo Positivo Total
Positivo
Negativo
17
0
17
12
19
31
29
19
48

Entre los resultados de Dx clnico y los
resultados de PCR se encontr una
Sensibilidad 96.7% y
Especificidad 100%
VPN - 94.7%
VPP - 100%
Para la prueba de PCR
Entre los resultados del Dx clnico y los resultados de la
prueba de AFB Auramina, se encontr:
Sensibilidad - 58.6%
Especificidad - 100%
V PN - 56.7%
VPP - 100%

Se observ una marcada diferencia (40%) entre los
resultados comparativos de la sensibilidad de la prueba
PCR y AFB Auramina y casi 40% entre los VPN de
ambas pruebas.
CASO CLNICO

Paciente mujer de 18 aos de edad, soltera, natural y procedente de
Lima, que acude a la consulta externa de dermatologa refiriendo
enfermedad de un mes de evolucin, de inicio insidioso y curso
progresivo, con la aparicin de un ndulo en el tercio inferior interno
de la pierna izquierda que aumenta de tamao para formar una
placa eritemato-violcea, la cual llega a ulcerarse con salida de
secrecin purulenta amarillenta espesa. Dos semanas despus
presenta otra lesin nodular que evoluciona a una placa de
aproximadamente 4 cm de dimetro, eritemato-violcea, en la cara
posterior y media de pierna derecha; otra lesin parecida en ambos
tobillos y en el muslo izquierdo. La paciente recibi dicloxacilina
como tratamiento sin mejora alguna.
Antecedentes
Como antecedente patolgico de importancia refiere un cuadro de similar
presentacin hace un ao. Adems presenta alergia de contacto a
metales. Niega contacto con enfermos de tuberculosis.
Examen clnico
En la exploracin fsica se observ la presencia de
placas palpables, dolorosas, en la cara
posteroinferior de las piernas derecha e
izquierda (Figuras 1 y 2), ambos tobillos (Figura
3) y muslo izquierdo. Adems se evidencia
salida de secrecin purulenta de la placa
nodular de la pierna izquierda (Figura 2). Resto
del examen clnico general no contributorio.
Exmenes auxiliares
Los examen de laboratorio hematolgicos,
bioqumicos y de orina se encuentran dentro de
los parmetros normales. Velocidad de
sedimentacin globular, 20 mm; PPD, 15 mm.
Radiografa trax: incremento de la trama
fibrointersticial a predominio izquierdo.
El estudio histopatolgico mostr una paniculitis
lobulillar con vasculitis e infiltrado
linfohistiocitario con focos de necrosis (Figuras
4, 5 y 6). Coloracin de Ziehl-Nielsen negativa.
En la histopatologa se observa principalmente una paniculitis
lobular que comparte muchas caractersticas con la vasculitis
nodular(13-15). En estadios iniciales se forman colecciones
discretas de clulas inflamatorias a predominio de neutrfilos,
luego se va produciendo una necrosis extensa de los
adipocitos de los lbulos, los cuales son fagocitados por los
histiocitos, transformndose en clulas de aspecto
espumoso. En las lesiones bien establecidas se observa un
infiltrado granulomatoso compuestos de histiocitos, clulas
epitelioides, clulas gigantes multinucleadas y linfocitos,
adyacentes a las reas de necrosis. Cuando se produce
dao intenso de los vasos, se observa reas extensas de
necrosis caseosa y las lesiones muestran una histopatologa
de tuberculosis( 1,13,14,16,17). Las tinciones de Zielh-
Nielsen no muestran presencia de la micobacteria. Por PCR
se ha detectado con alta frecuencia (25% a 77%) ADN de
Mycobacterium tuberculosis (MTB) en sus lesiones
cutneas(1,3,17-20).
El diagnstico de EIB es hecho sobre la base de las
caractersticas clnicas morfolgicas, test de tuberculina
positivo, evidencia circunstancial de tuberculosis en
cualquier rgano del cuerpo, complementado con los
hallazgos histopatolgicos y deteccin del ADN del
micobacterium por PCR. El diagnstico puede ser
confirmado con la terapia antituberculosa (12).



Dermatol. peru. v.16 n.2 Lima mayo/agosto 2006
CASO CLNICO: SERVICIO
NEUMOLOGA
Hospital Regional Docente de Trujillo
I. ANAMNESIS:
Filiacin: R. d C. M, mujer de 81 aos, proc. de Trujillo
Molestia Principal: Fiebre + disnea
Enfermedad Actual:
TE: 3 semanas FI = Insidioso C = Progresivo

Tres sem. a.i: Sensacin de alza trmica, espordica, asociada a
escalofros. Medico Internista de la familia indica exmenes
auxiliares, diagnosticando ITU e indica ceftriaxona 1g: 1 amp IM
c/24 hr, sin encontrar mejora.
10 das a.i. Fiebre es remitente, (T. axilar 37,3C - 39C. Se
asocia tos con expectoracin amarillenta en escasa cantidad y
dolor torcico que se exacerba durante la inspiracin.
5 das a. i. Se agrega disnea, por lo que debe caminar ms
despacio que antes, acudiendo al mdico tratante, quien
solicita exmenes auxiliares en sangre, orina, esputo, y
radiografa de trax diagnosticando bronconeumona motivo
por el cual paciente es transferida a clnica particular para
manejo y tratamiento especializado.
FB: Apetito: Hiporexia Sed: conservada Peso: sin
variaciones. Deposiciones: conservadas. Sueo: Insomnio
Orina: Conservada
Antecedentes Personales:
Hipertensin arterial en tratamiento regular con enalapril.
Combe (-)
II. EXAMEN FSICO
Signos vitales:
PA=120/80 mmHg FC= 90x FR=20x
T= 38,5C (axilar) Sat. O2 FiO2 = 80%

Apreciacin General: Paciente en DD semifowler preferencial,
quejumbrosa con signos de dificultad respiratoria.

Piel y Anexos: Piel plida +/+++

TCSC: No edemas

Ganglios Linfticos: No palpables.
Trax: Tirajes intercostales y subcostales.
Ap. Resp.: Crepitantes en tercio superior de
ambos campos pulmonares
Ap. Cardiovascular: Ruidos cardiacos
rtmicos regulares, aumentados en
frecuencia. No soplos. RHY(-). Pulsos
perifricos presentes y sincrnicos con latido
cardiaco.
Resto: n/e
III.- EXMENES AUXILIARES
SOLICITADOS
05.01.07
EOC: Se observa algunos bacilos gram negativos.
Urocultivo: E. coli 105,000 colonias/ml
16.01.07
Muestra esputo
Directo (gram): Algunas clulas epiteliales (5-9xc) y
algunos leucocitos (8-12xc). Se observa regular nmero
de cocos gram positivos aislados, agrupados y algunos
en cadenas.
Cultivo: Se aisla e identifica S. aureus coagulasa positivo.
Radiografa de Trax. 18.01.07: Bronconeumona



18.01.07
Hm: 12400(03-71-05-00-04-17)
Hto: 36%
Creatinina: 0,86 mg/dl


PROBLEMAS DE SALUD
1.-Bronconeuma
2.-Cultivo de esputo positivo :S. aureus
coagulasa positivo.

HIPTESIS DIAGNSTICA
1. 1-Bronconeumona por S. aureus .
2. 2.-Neumonia del anciano por S. aureus
III.- EVOLUCION
Paciente ingresa a clnica privada el 19.01.07 con diagnstico de
bronconeumona y recibe el siguiente tratamiento:

- Reposo
- Dieta blanda
- Oxgeno 3l/min x CBN
- Va para antibioticoterapia
Imipenem 500/500 1 amp. VEV c/8 hr

Da 20.01.07
Se agrega atenolol x 100mg tab vaoral c/8hr, rivotril 0.5 en la
noche.

Da 21.01.07
Se agrega nebulizaciones con S.S.F. 4 veces x da.
Da 22.01.07 Se solicita Rx de trax control e intercon. a infectlogo:


Infectlogo sugiere:
- Dx neumona severa del anciano por Staphylococcus
aureus MRSA complicada con sepsis.
- Rotar imipenem a vancomicina 1g c/12 hr con adecuada
hidratacin asociado a rifampicina 300 mg V.O. c/12 hrs
- Debe esperarse mejora clnica en 48-72 hrs, en caso
contrario:
Considerar estudios de hongos
Solicitar PPD
Reevaluacin a solicitud

Da 23.01.07 al 25.01.07
- Reposo
- Dieta completa
- Oxigeno 3 lt/min x CBN
- Nebulizaciones con SSF c/6 hrs
- Va
- Fluimicil x 600 mg: 1 comprimido/da
- Imipenem x 1g EV c/8 hrs
- Rivotril 0.5 mg M/N
- Atenolol x 100 mg 1 comp. c/8 hr
- Colonaid x 6 mg: 1 comp. en la noche
- Vancomicina x 1 g de inicio, luego 500 mg EV c/6hrs. Terminar
imipinem
Da 25.01.07
Se realiza interconsulta a neumlogo quien sugiere:
- Dx: 1. ITRI por Staphylococcus? 2. Neumonitis intersticial
idioptica 3.Anemia
- Hemocultivo en pico febril
- TAC torcica de alta resolucin
- Controles hematolgicos bioqumicos, microbiolgicos,
perfil heptico.
- Broncoscopa si fuera necesario.

TAC torcica: Resultado
- Proceso neumnico bilateral a predominio izquierdo con
derrame pleural bibasal asociado.
- Fibrosis pulmonar
- Ateromatosis artica
Da 26.01.07
Se solicita nueva evaluacin por neumlogo, quien
sugiere:
- HoDx: 1.- Descartar proceso especifico
2.- Bronconeumona bacteriana por grmenes
atpicos.
3.- Fibrosis pulmonar.

- Toracocentesis diagnstica
- AGA y Electrolitos.
- Creatinina, perfil heptico.

GOT / AST = 21 U/L
GPT / ALT = 12 U/L
F ALCALINA = 154 U/L
B. TOTAL = 0.54 mg / dL
B. DIRECTA = 0.20 mg / dL
B. INDIRECTA = 0.34 mg / dL
T P = 12 segundos
PROTEINAS TOTALES = 6.1 gr. / dL
ALBUMINA = 3.5 gr. / dL
GLOBULINA = 2.6 gr. / dL
ALBUMINA/GLOBUL. = 1.3
V. SED = 70
PLAQUETAS = 199.000
HEMOGLOBINA = 13.6

LIQUIDO PLEURAL

Examen Fsico Muestra de color amarillo y aspecto
ligeramente turbio.
Volumen Recepcionado : 10 mL
Examen Ctolgico
- Recuento celular = 500
- PMN = 20%
- MN = 80%
Examen Qumico
- Protenas = 2,3
- Glucosa = 174
- Globulinas (pandy) = positivo
- Rivalta = positiv
Examen Bacteriolgico
- COL ZIEHL NEELSEN = No se observa baar.
- COL GRAM = No se observan bacterias.
- Cultivo para grmenes comunes = negativo

PAP - BLOCK CELL
- No se encuentra clulas neoplsticas.

LDH = 263
ADA = 14.1
INVESTIGACION DE TBC x PCR
- Positivo. Se detecta ADN de M. tuberculosis.

Da 29.01.07
1. Reposo semifowler
2. Dieta blanda + lquidos orales a voluntad.
3. CFV c/ 6 hs.
4. Pulmonale: 1 lata fraccionada en 2 tomas entre comidas
5. Ogastro: 30 mg. 1 caps. 6am 11pm
6. Moxifloxacino (Avelox) : 400 mg: 1 tab. Vo 10am c/24hs
7. Prednisona : 50 mg: 1 tab Vo Stat y luego c/24 hs (9am)
8. Esquema anti TBC diario.
9. Daktarin Gel: 1 medida Vo M-N
10. Amlodipino: 10 mg. 1/2 tab. Vo 8am
11. Cemtrum: 1 tab. en ayunas
12. cido Flico: 0.5 mg 2 tab. En ayunas
13. Combivent: 2 inh. Con aerocmara: 7am 2pm 10pm
14. Fluimicil: 200 mg. 1 sobre diluido en 1/2 vaso de agua M-N
15. Oxgeno x CBN 4 L x minutos permanente.
16. Vendaje de miembros inferiores.
17. Se solicita AGA y Electrolitos.
08.02.07
Hm: 6300(04-78-03-00-01-14)
Hto: 37%
Creatinina: 0,89 mg/dl


Paciente es dada de alta con diagnstico de:
Tuberculosis pleural
Fibrosis pulmonar


GRACIAS