MSc. Csar A.

Guzmn Vigo
Docente Facultad Medicina
UDCH
INTRODUCCIN
Qu es el ADN - Recombinante?
Creacin de nuevas combinaciones de segmentos o de
molculas de DNA que no se encuentran juntas de
manera natural. Trmino reservado a molculas de DNA
producidas por la unin de segmentos que provienen de
diferentes fuentes biolgicas. Asimismo, una secuencia
determinada de DNA se puede aparear con otra
secuencia complementaria ya sea de DNA o de RNA
(hibridar).
Protocolo de construccin de un rDNA
Identificacin del gen de inters
(Organismo donante)


Corte con ER


( DNA no homlogo) Inserto + Vehculo o vector (rDNA quimrico)


Clonacin del gen de inters en bacterias


Modificacin del Donante


Reintroduccin del gen en clulas donantes originales


1. Generacin de fragmentos de DNA con edonucleasas
2. Fragmentos producto de la digestin se unen a vectores, que pueden replicarse de forma
autnoma en la clula husped
3. La molcula de rDNA formada por un vector que lleva el inserto, se transfiere a una
clula husped. Aqu la molcula de rDNA se replica, produciendo docenas de copias:
Clones
4. Al replicarse las clulas husped, las clulas descendientes heredan el rDNA, crendose
una poblacin de clulas idnticas, que llevan todas la secuencia clonada
5. Los segmentos clonados pueden recuperarse del husped, purificarse y analizarse
6. El DNA clonado puede transcribir su mRNA, traducirse y el producto gnico aislarse y
examinarse.


Pasos que incluye los procedimientos bsicos
Fabricacin del rDNA
ENZIMAS DE RESTRICCION: Endonucleasas, aisladas
de bacterias.
1. limitan o previenen infecciones vricas,
degradando el cido nucleico invasor.
2. Reconocen una secuencia de nucletidos
especfica y lo cortan
3. Se denominan segn el organismo en el que se
descubrieron, utilizando un sistema alfanumrico
4. Ejm. EcoRI ( Escherichia coli), HindIII (Hemophilus
influenzae)
G A A T T C


C T T A A G
G


C T T A A
A A T T C


G
Sitio de restriccin
Tratamiento con EcoRI
Colas complementarias
La enzima de restriccin EcoRI reconoce y corta la secuencia palindrmica GAATTC.
El corte en este sitio produce colas de cadena sencilla complementarias. Las colas
de cadena sencilla resultantes pueden unirse con colas complenetarias de otros
fragmentos de DNA para formar molculas de rDNA
G A A T T C



C T T A A G
G A A T T C



C T T A A G
G



C T T A A
A A T T C



G
G



C T T A A
A A T T C



G
G-



C T T A A -
A A T T C



G
Corte con EcoRI Corte con EcoRI
Fragmentos con colas complementarias
Hueco
Hueco
DNA Ligasa
Se forman molculas de rDNA al unirse
por complementariedad de bases. Las dos
cadenas no estn covalentemente unidas
como indican los huecos marcados con el
crculo
La DNA ligasa sella el hueco uniendo
Covalentemente las dos cadenas
Para formar molculas de rDNA, se corta DNA de distintas fuentes de EcoRI y se mezcla para que se unan formando molculas recombinantes.
Despus se utiliza la enzima DNA ligasa para unirlos covalentemente en molculas de rDNA
ENZIMAS DE RESTRICCION.
5. Hay dos tipos de enzimas: I y II
6. Tipo I: cortan las dos cadenas de DNA en posicin
aleatoria a cierta distancia del sitio de restriccin, no
son utilizadas en investigacin de rDNA
7. Tipo II: reconocen secuencia especfica y cortan las
dos cadenas de DNA con precisin.
8. Las secuencias reconocidas por enzimas tipo II son
simtricas: Palindromos
9. EcoRI, corta escalonada, dejando extremos de
cadena sencilla cola pegajosa, otra como SmaI corta
formando extremos romos, necesitando la enzima
desoxinucleotidil transferasa terminal, para crear
extremos de cadena sencilla.
Fabricacin del rDNA
C C C



G G G
G G C



C C C
C C C



G G G T T T
A A A G G C



C C C
C C C



G G G T T T
A A A G G C



C C C
C C C -



G G G T T T -
A A A G G C



C C C
DNA eucaritico
DNA plasmdico
Adicin de colas de poli-dT
Adicin de colas de poli-dA
Desoxinucleotidil
transferasa terminal
Unin de
los fragmentos
Ligacin con DNA ligas
Las molculas de rDNA pueden formarse a partir de DNA cortado con enzimas que dejan extremos romos. La desoxinucleotidil
transferasa terminal crea colas complementarias, mediante la adicin de fragmentos de poli dA y polidT
Digestin del DNA
La Enzima de restriccin de EcoRI corta una molcula
circuar de DNA, con un solo sitio de reconocimiento,
dando lugar a una molcula lineal con extremos
cohesivos
ER como mecanismo de defensa (fagos)
Corte en secuencias DIANA
Eco RI: en escalera:
5G A A T T C 3
3C T T A A G5
Si dos molculas de DNA se cortan con la misma
enzima, ambas producen los mismos extremos
cohesivos complementarios: quimeras
Ligacin del DNA
Amplificacin
del DNA
El tratamiento del DNA
donante y vector con
enzimas de restriccin
permite la insercin de
fragmentos individuales en
el vector. Tras la entrada
de una sola molcula
recombinante en la clula
bacteriana, la replicacin y
la divisin celular producen
un nmero elevado de
copias del fragmento
donante
ELECCION DEL VECTOR DE CLONACIN
* Vectores moleculares pequeos
* Capaz de proliferar
* Que contenga sitios de restriccin
* Que ofrezca mecanismos de identificacin y recuperacin de
molculas recombinantes
Clonacin de un gen especfico
VECTORES
El vector es un vehculo de clonacin, son molculas de DNA
transportadoras, que tiene las siguientes caractersticas:
1. Debe replicarse independientemente junto con el
segmento de DNA que transporta
2. Debe contener sitios de corte, presentes slo una vez en el
vector
3. Debe tener algn marcador de seleccin (normalmente
genes de resistencia) para poder distinguir lasa clulas
husped que transportan el vector de las que no lo contienen
4. El vector de la clula husped debera ser fcil de recuperar
VECTORES: Plsmidos
Molculas de DNA de doble cadena,
extracromosmicas de origen natural, que tiene las
siguientes caractersticas:
1. Origen de replicacin (ori+)
2. Replicacin autnoma en la bacteria
3. Nmero limitado de sitios de restriccin
4. Genes de resistencia a antibiticos especficos
5. Vector pBR322, primero utilizado en rDNA
Gen de resistencia
a ampicilina
Gen de resistencia
a tetraciclina
pBR322
EcoRI ClaI HindIII
BamHI
SphI
Sal I
XmaIII
NruI
Ava I
Bal I
Pvu II
Sna i
Rru I
Pvu I
Pst I
Mapa de restriccin del plsmido pBR322, que muestra las localizaciones de los sitios
de las enzimas de restriccin que cortan el plsmido por un solo sitio.
Tambien se muestran las localizaciones de los genes de resistencia a antibiticos
Plasmido pUC18
Deriva del pBR322 y tiene siguientes
caractersticas:
1. Tiene la mita de tamao que el pBR322, lo que
permite insertar fragmentos de DNA ms largos
2. Se replica produciendo unas 500 copias por
clula, lo que significa unas 5 10 veces ms que
las que produce el PBR322
3. Tiene un gran nmero de sitios de restriccin:
sitio de clonacin mltiple (polylinker)
4. Tiene un fragmento de un gen bacteriano
denominado lacZ, que codifica b-galactosidasa,
enzima que corta molculas de azucar. Cuando el PUC18
se introduce en la clula bacteriana , se produce b-galactosidasa funcional.
Gen de resistencia
a ampicilina
Gen
lacZ
pUC18
Hind IIII
Pst II
Xba II
Sma i
Xma I
Ban II
Sst I
Sph I
Sal I
Hinc II AccI
BamH I
Kpn I
EcoR I
Sitio de clonacin mltiple
Plasmido pUC18 debido a su pequeo tamao, puede aceptar fragmentos de DNA relativamente grandes; se replica hasta un nmero grande de
copias, y tiene un gran nmero de sitios de restriccin en el sitio de clonacin Mltiple, localizado dentro del gen lacZ. Las bacterias que
contienen el pUC18 producen colonias de color azul si crecen en un medio que contenga x-gal DNA insertado en el sitio de clonacin mltiple
interrumpe el gen lacZ, resultando en colonias blancas, lo que permite la identificacin directa de las colonias que tienen insertos de DNA
clonado.
Esquema de la estructura general y sitios de
restriccin de los vectores pBR322 y pUC18
La insercin en pBR322 se
detecta por inactivacin de un
gen de resistencia a
tetraciclina (tet
R
), que
provoca el fenotipo de
sensibilidad tet
S
. La insercin
en pUC18 se detecta por
inactivacin de la funcin b
galactosidasa del gen Z, que
provoca incapacidad para
covertir el sustrato artificial X-
Gal en un compuesto azul
Bacterifagos lamba
El tercio central de su genoma es prescindible y puede
reemplazrse por DNA exgeno sin afectar la capacidad
infectante del fago.
Empaquetan cromosomas de unos 50 kb de
longitud.

El DNA exgeno a ser insertado debe ser cortado con la misma
enzima que la que se utiliza para cortar el genoma viral
Utilizacin de transfeccin para introduccin a clula husped
Otros bacteriofagos utilizados: M13
CLONACION EN COSMIDOS
Se corta el csmido en
un sitio BglII adyacente
en el sitio cos. El DNA
genmico donante se
corta con Sau3A, que
produce extremos
cohesivos compatibles
con BglII. Cuando se
mezclan, se obtienen
molculas de DNA
donante y vector
dispuestas en tandem.
El fago se empaqueta
in vitro mediante la
introduccin de cortes
en los sitios cos. Los
csmidos que
contienen inserto, una
vez dentro de las
clulas bacterianas, se
convierten en
molculas circulares
COSMIDOS : vectores hbridos (Lambda + plsmido); * clonacin de insertos de
DNA 3 veces + grandes que lambda
Muestra DNA
Obtener coleccin Clones (genoteca de DNA) (clonacin en
perdigonada) clon blanco?
Tipos de genotecas:
a. Segn vector utilizado (Plsmido, Fago, Csmidos, YAC,
BAC)
b. Segn origen del DNA
Construccin de genotecas de cDNA (carece de secuencias
reguladoras e intrones) (tr. Inversa)
Una genoteca de cDNA est constituda por regiones que se
transcriben, por lo tanto es ms pequea que una genoteca
completa.
Construccin de una genoteca