CULTIVOS VIRALES

Embrin de pollo
Animales de laboratorio
Daz Mendoza Gabriela
Galindo Martnez Jos Luis
Rodrguez Alcocer Deisy
Sandoval Lorenzo Arturo
CULTIVO CELULAR
Actualmente se entiende como el
conjunto de tcnicas que permiten el
mantenimiento de las clulas 'in vitro',
manteniendo al mximo sus propiedades
fisiolgicas, bioqumicas y genticas.
MTODOS PARA EL CULTIVO DE VIRUS
INOCULACIN AL ANIMAL
Inoculacin: 1) va intravenosa
2)Va intracerebral
3) Va intraperitoneal
4)Va Intranasal
5)Va Intratraqueal
6)Va intradrmica
INOCULACIN AL HUEVO FECUNDADO
INOCULACIN EN CULTIVOS DE TEJIDO
Cultivos primarios y secundarios: De rin de mono, lquido
amnitico de embrin humano, rin, prepucio y embriones de
pollo o ratn
Las Cepas de clulas diploides
Lneas celulares continuas

CULTIVOS VIRALES EN ANIMALES DE
EXPERIMENTACIN (ECP)
UTILIDAD: La inoculacin animal sigue siendo un mtodo de
gran valor para estudiar la oncognesis viral, la patologa de
los padecimientos virales, la respuesta inmune a los virus y el
afecta de los factores ambientales sobre infecciones virales,
as como el asilamiento primario de ciertos agentes.

INOCULACIN: 1) va intravenosa
2)Va intracerebral
3) Va intraperitoneal
4)Va Intranasal
5)Va Intratraqueal
6)Va intradrmica

Va intravenosa


Va intracerebral





3) Va intraperitoneal

5)Va Intratraqueal
6)Va Intranasal
7)Va Intradrmica
Los animales requieren de una casa, alimentacin y manejo
adecuados, para su propio bienestar, as como para la
seguridad de el experimentador.
Los animales inoculados con material potencialmente
infeccioso deben de revisarse diariamente y sacrificar a los
animales enfermos tan pronto como se observan en ellos el
patrn de infeccin esperado.
La inoculacin por la va respiratoria es potencialmente
peligrosa y debe de realizarse en lugares adecuados para evitar
la acumulacin de material infeccioso en el aire.
CUIDADOS Y PRECUACIONES:

El virus de la Hepatitis C se replica solamente en chimpancs.
Los hamster son ampliamente usados en la virologa tumoral,
porque son altamnte sucesibles a desarrollar canceres inducidos por
virus oncognicos y pueden eliminar antisueros muy valiosos
AVES: Se utilizan fundamentalmente como fuente de eritrocitos
para pruebas de hemoaglutinacin, as como para la obtencin de
suero, tejidos para cultivos celulares o preparacin de sueros
hiperinmunes.
RATN ADULTO: Se utiliza para el aislamiento de virus como la
rabia, coriomningitis, linfoctica, arenavirus, etc.
RATN RECIEN NACIDO: Se emplea preferentemente para el
aislamiento de virus como: Coxsackie, herpesvirus y reovitus.
COBAYO: Se utiliza para aislar virus como coriomeningitis
linfoctica, obtencin de suero, tejido para cultivos celulares, fuente
de complemento, etc.
CONEJO: Se utiliza principalmente para la preparacin de sueros
hiperinmunes.
Los virus invaden las clulas causando
normalmente algn tipo de cambio visible en el
crecimiento de las clulas de la monocapa cercanas
al sitio de la infeccin inicial. Este cambio
localizado, denominado efecto citoptico (CPE), es
un deterioro de las clulas del cultivo de tejidos
causado por el virus. La CPE puede tener diferentes
apariencias dependiendo de un virus particular y
del tipo de clulas en el cultivo.
Cambios citopticos
Propios de cada tipo de virus
Virus Respuesta en clula animal
VIH
Herpes simple
Poliovirus
Togavirus
Varicela
Rabia
Reovirus
Adenovirus
Clulas gigantes y multinucleadas
Clulas gigantes y multinucleadas
Lisis celular, no inclusiones
Lisis celular, no inclusiones
Inclusiones o masas en citoplasma
Inclusiones en citoplasma
Vacuolas e inclusiones en citoplasma
Inclusiones nucleares
Una vez lograda a duplicacin del virus, se recogen tejidos
(necropsia) pertenecientes a las zonas correspondientes del
organismo, se selecciona u homogeniza y se almacena
(generalmente a baja temperatura para emplearlas des pues
como fuente de virus.
La naturaleza del rgano o tejido que se va a colectar y
examinar depender de la enfermedad en particular a los
sntomas que exhibe el animal.
CUIDADOS: Cada instrumento para la necropsia debe de ser
puesto en una bandeja o en un lugar adecuado, cubierto con
papel absorbente y envoltura de aluminio, y posteriormente
debe de ser esterilizado. El animal debe de ser incinerado
despus de la necropsia.
EJEMPLOS DE AVANCES EN VIROLOGIA DERIVADOS DE
EXPERIMENTACIN CON ANIMALES
TRATAMIENTO DE LA RABIA
Enfermedad que provoca convulsiones y muerte; afecta a los
animales salvajes y domsticos y se trasmite a los seres
humanos.
Especies experimentales: perros, conejos.
TRATAMIENTO DE LA VIRUELA
Se estima que caus ms de dos millones de muertes.
Especie experimental: vacas.
TRATAMIENTO DEL NTRAX
Enfermedad que causa aumento de la temperatura corporal,
depresin, espasmos, dificultades cardacas y respiratorias,
convulsiones y muerte. Hasta el siglo XX se producan
epidemias devastadoras.
Especie experimental: ovejas.
PREVENCIN DE LA POLIO
Puede provocar parlisis; en 1952 se registraron 58,000 casos en Estados
Unidos; hoy est eliminada en casi todo el mundo.
Especies experimentales: conejos, monos, roedores.
PREVENCIN DE LA RUBIOLA
Enfermedad viral epidmica que puede causar malformaciones fetales en la
embarazadas,
Especies experimentales: monos.

PREVENCIN DEL SARAMPIN
Enfermedad viral contagiosa, antes comn en los nios. Causa erupciones
cutneas y puede ser mortal..
Especie experimental: monos.

CULTIVOS VIRALES EN EMBRION DE POLLO
En huevo embrionado



En embrin de pollo
CULTIVO VIRAL EN HUEVO EMBRIONADO
ANTECEDENTES HISTORICOS:
Rous y Murphy lo utilizaron por primera vez
en 1911 y posteriormente en 1938
Goodpasture publico una interesante revisin
sobre su utilizacin en el estudio de los virus
y esta tcnica fue extensamente desarrollada
por Burnet.
UTILIDAD: Es una fuente de tejido vivo
conveniente y fcil de manipular que se utiliza en la
propagacin, titulacin e identificacin de virus, as
como en la preparacin de lagunas vacunas virales.
VENTAJAS:
No es necesario el espacio ni el cuidado que
requieren los animales.
No es necesaria la destreza tcnica , ni el tiempo
que se emplea en la preparacin y mantenimiento
de los cultivos celulares.

CULTIVO VIRAL EN HUEVO EMBRIONADO
EXTRUCTURA DEL HUEVO EMBRIONADO
EXTRUCTURA DEL HUEVO EMBRIONADO
EXTRUCTURA DEL HUEVO EMBRIONADO
INOCULACIN EN SACO ALANTOIDEO

INOCULACIN EN SACO AMNITICO

INOCULACIN EN SACO VITELINO

INOCULACIN DE MEMBRANA CARIOALANTOIDEA

VIAS DE INOCULACIN
1.-Iluminar con el ovoscopio el embrin y marcar la
cmara de aire y marcar el punto en la cima
2.- Aproximadamente 5mm por arriba de la cmara
de aire localice una zona libre de vasos y de lado
opuesto al embrin marcar en punto de
unoculacin.
3.-Perforara los puntos marcados e inocular con una
aguja del 27 corta
4.- la inoculacin se puede realizar tambin a travs
de la cmara de aire con una aguja del 22 larga.
1.-Iluminar con el ovoscopio el embrin y
marcar la cmara de aire y marcar un punto en
la cima.
2.-Marcar el punto de inoculacin exactamente
donde se ve el embrin (localizar manchas
oculares)
3.- Iluminar el embrin se inocula con a aguja
del 22.
1.-Iluminar con el ovoscopio el embrin y
marcar la cmara de aire.
2.-Coloque el embrin en plano horizontal y
localice el saco vitelino (mancha obscura
densa)
3.-Introducir una aguja del 22 larga vertical a
travs de la cmara de aire y depositar el
inoculo.
INOCULACIN DE MEMBRANA
CARIOALANTIDEA
1.-Iluminar con el ovoscopio el embrin y marcar la cmara
de aire.
2.-Dividir imaginariamente a embrin en tres partes, al final
del primer tercio sealar el punto de inoculacin entre los
vasos sanguneos.
3.-Perforar sobre la cmara de aire y el punto de inoculacin.
4.-Succionar con una boquilla por el orificio de l cmara de
aire. Se debe formar una cmara de ms o menos un cm.
De dimetro.
5.-Con una aguja del 27 corta depositar el inoculo.
Nota: Cuide de no perforara la membrana corioalantoidea.
MEMBRANA VIRUS SIGNOS DE
CRECIMIENTO
Saco vitelino Herpes simple Muerte
Coriolantoides Herpes simple
Poxvirus
Sarcoma de Rous
Varicela

Muerte
Pstulas
Pstulas
Alantoides Influenza Hemaglutinacin
Amnitica Parotiditis
Virus de la gripe
Muerte
OBTENCIN DE MUESTRAS DEL HUEVO
EMBRIONADO.
Algunos virus como el de la influenza, que se duplica en el
sistema respiratorio del embrin y la clulas de la
membrana amnitica, pasa a lquido amnitico, que se
recoge con una jeringa y aguja.

Sin embargo otros virus como por ejemplo el de la viruela
y herpes se duplican en membrana corioalantoidea, por lo
que se recurre extraer el embrin.
CULTIVO VIRAL EN EMBRION DE POLLO
Los embriones de pollo contienen diferentes
tipos de clulas y tejidos en los que varios
virus pueden replicarse.
Por lo que algunas veces, puede inyectarse
directamente el virus en el embrin en
desarrollo, recurriendo a inoculacin
intravenosa, intraperitoneal o intracerebral.
Y una ves que ya se inoculo el virus en el
embrin dentro del huevo este se saca del
huevo y ahora se inicia la experimentacin y
pruebas en el embrin del pollo fuera del
cascaron.
Para ello se utilizarn embriones de los siguientes
estadios de desarrollo aproximadamente:
1. 14-15HH = 50-55 horas de incubacin.
2. 18 HH = 3 das de incubacin.
3. 30 HH = 6.5-7 das de incubacin.
4. 35 HH = 8.5-9 das de incubacin.
HH= Estadios de desarrollo del embrin de pollo
segn los criterios de Hamburger y Hamilton (1951).
IDENTIFICACIN Y ESTUDIO DEL VIRUS AISLADO EN
EMBRION DE POLLO
Despus de observar el avance en el huevo se procede a sacar
a el embrin de la siguiente manera
1.- Desinfectar la cscara del huevo con alcohol 70 en la zona de
la cmara de aire.
3) Romper y sacar la cscara de la zona marcada con una pinza.
4) Con otro instrumento, romper la membrana coclear. Ponerlo
en una caja de Petri estril.
5) Lavar con solucin fisiolgica estril al embrin.
6) Cortar y moler la parte que nos interesa o todo el embrin
descartando algunas parte en solucin salina isotnica ,
logrando liberar los virus.


IDENTIFICACIN Y ESTUDIO DEL VIRUS AISLADO EN
EMBRION DE POLLO
7)Realizar pruebas como:
Deteccin de la partcula viral completa. La aplicacin de tcnicas
de microscopia electrnica
Deteccin de antgenos o protenas virales (inmunoanlisis).
Deteccin de cido nucleico viral.
Electroforesis.
Hibridacin de cidos nucleicos
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
DETECCIN DE ANTICUERPOS ANTIVIRALES.
Reaccin de neutralizacin.
Reaccin de inhibicin de la hemaglutinacin.
Reaccin de fijacin del complemento.


UN EJEMPLO DE APLICACIN DE CULTIVOS VIRALES EN
ANIMALES Y EN HUEVOS EMBRIONAOS
Diagnstico de la Influenza Aviar (IA)
Mariela Brett y Elsy Saume
Sanidad Animal
CENIAP-INIA
Maracay
Las aves acuticas migratorias,
principalmente los patos, constituyen
el reservorio principal de los virus de
la gripe aviar, y son tambin las ms
resistentes a la infeccin. Aunque
todas las especies de aves son
susceptibles de infectarse, las aves de
corral domsticas son especialmente
vulnerables, en particular los pollos y
pavos.
Las cepas de alta patogenicidad
pueden producir congestin y
hemorragia transudativa, con
cambios necrticos en rganos como
trquea, proventrculo, intestinos,
cloaca, vulos ,focos necrticos en
hgado, bazo y rin congestin y
hemorragia subcutnea en muslos y
patas.
Se deben tomar muestras de trquea,
pulmn, intestino y/o contenido
intestinal y cerebro en la fase aguda
de la enfermedad.

Se realiza un macerado de los tejidos
(respiratorio, entrico y nervioso por
separado), agregando solucin de caldo
triptosa buferada o PBS (solucin salina
fosfatada buferada) con antibiticos
(penicilina 10.000 UI/ml, estreptomicina
2000-10000ug/ml, gentamicina 1000ug/ml,
kanamicina 650 ug/ml y anfotericina B 5-20
ug/ml)
El macerado es centrifugado a 1500 xg por 20
minutos, y filtrado con un filtro de membrana
de poro N 0.45 nm, obteniendo de esta
manera el inoculo.
Se realiza control de esterilidad del inculo
sembrando en gelosa simple o agua peptonada
para descartar contaminacin bacteriana.
El inculo se conserva en congelacin a 7
C hasta el momento de la inoculacin.
Se realiza a travs del
aislamiento viral en huevos
embrionados y la deteccin
serolgica de anticuerpos
especficos.
Se realiza en embriones
de pollo de 9 a 11 das de
edad libres de anticuerpos
especficos contra el virus
(SPF), utilizando la cavidad
alantoidea como ruta de
inoculacin
El fluido alantoideo HA
positivo (que contiene el
virus de IA) es centrifugado
a 1500 rpm. por 15 minutos
y filtrado respectivamente, y
ser conservado en
congelacin a 70C hasta
su uso. ste ser
posteriormente caracterizado
mediante pruebas de
Patogenicidad y/o Biologa
Molecular.
Para determinar la patogenicidad
de la cepa es necesario realizar el
ndice de Patogenicidad
Intravenoso (IPIV).
Se inoculan 8 pollos de 6
semanas de edad por va
intravenosa o intramuscular, con
0,1 ml de una dilucin 1/10 del
FA. Se observan diariamente por
10 a12 das y se llevan los
registros de mortalidad, parlisis,
signos y aves normales, a los
cuales se les da un valor de 3, 2,
1 y 0 respectivamente.
BIBLIOGRAFIA
Larski Virologa para Veterinarios
Prensa Mdica Mexicana, 1989.+
Luria, S.F., and Darnell, J.F., Virologa
General 2a ed., John Willer and Sons
N.Y. USA 1968.
Mohanty, S.B.: Virologa Veterinaria.
Interamericana, 1981.