Antibiograma: testarea sensibilitii in

vitro a microorganismelor fa de
antibiotice .

Termenii de antibiotic si chimioterapic se folosesc
ca sinonimi.
Introducerea unui antibiotic in terapie este o
mare responsabilitate medicala, cerind
respectarea unor conditii.

o Antibiograma se face dupa stabilirea
diagnosticului etiologic, prin izolarea in
cultura pura si prin identificarea agentului
patogen.
o In cazuri de extrema urgenta, se poate
administra un antibiotic (inainte de
efectuarea antibiogramei) dar numai dupa
recoltarea produselor patologice.

o Tratamentul se realizeaza in functie de
rezultatele date de antibiograma, alegand
antibioticul cel mai eficace, adica fata de care
bacteria izolata are cea mai mare sensibilitate.

o Antibiograma trebuie repetata daca tratamentul
cu antibiotice este de durata mai lunga; aceasta
deoarece agentul patogen poate sa cistige rezistenta
fata de antibioticul utilizat.

o Apoi in cursul tratamentului datorita
dezechilibrului din populatiile microbiocenozelor,
poate sa se produca o infectie supraadaugata cu o
bacterie din aceste microbiocenoze.

metode calitative
metoda difuzimetrica Kirby Bauer - clasica
metoda cu antibiotic incorporat in mediu semisolid
- moderna
metode cantitative
metoda dilutiilor in mediu lichid - clasica
metoda E test moderna

se bazeaza pe efectul bactericid sau bacteriostatic
al antibioticelor fata de microorganism.
n cazul tuturor bacteriilor semnificative clinic a
cror susceptibilitate nu este predictibil
(condiie:existena standardizrii privind specia,
antibioticul de testat)

se decide de ctre microbiolog n funcie de:
- felul produsului din care s-a izolat germenul,
- specia bacterian
Cnd relevana unui izolat este incert, medicul
microbiolog se consult cu medicul
curant si se ia o decizie n comun pe baza datelor
clinice.

Se testeaz sensibilitatea unei tulpini bacteriene
izolate n cultur pur si identificate.
Este metoda utilizat de rutin pentru testarea
susceptibilitii izolatelor clinice.
Fiind o metod calitativ, nu permite
cuantificarea nivelului de rezisten, rezultatele
fiind exprimate in:sensibil,intermediar si
rezistent.

Aceasta se efectueaza pe medii solide, in placi
Petri, pe care s-a insamintat in panza cultura
bacteriana; apoi pe suprafata mediului se
dispun discuri cu antibiotice astfel ca in jurul
acestora se va realiza un gradient de
concentratie prin difuziunea locala a
antibioticului ( in imediata vecinatate a
discului realizindu-se o concentratie mai mare
de antibiotic care descreste pe masura
indepartarii de acesta ).

Metoda difuzimetrica, cu toate ca nu stabileste
concentratia minima infibitorie (CMI), da
informatii pretioase asupra sensibilitatii speciei
testate fata de antibioticele utilizate si este
folosita mai frecvent in laboratorele clinice.

n efectuarea si interpretarea antibiogramelor
calitative se urmresc standarde internaionale.
n prezent standardul acceptat n cele mai multe
ri (inclusiv Romnia) este cel american,
elaborat de CLSI (Clinical Laboratory Standards
Institute) dar unele laboratoare folosesc
standardul european Eucast.


Mediul de testare universal recomandat este Muller-
Hinton agar.
Acest mediu nesuplimentat a fost ales pentru mai
multe motive:
a demonstrat o bun reproductibilitate de la un lot la
altul
conine puini inhibitori de sulfonamide i
trimetoprim
este un bun mediu de cultur pentru majoritatea
germenilor nepretenioi, patogeni
este folosit cu succes de muli ani, demonstndu-i
calitile.
Formula mediului este:
Extract de carne..300,0g
Hidrolizat de cazein17,5g
Amidon1,5g
AD..1000ml

Germenii pretenioi, cum sunt Haemophilus,
Neisseria i Streptococcus nu pot crete
satisfctor pe acest mediu nesuplimentat, dar ei
pot fi testai prin metoda difuzimetric, prin
suplimentarea mediului de baz Muller-Hinton
cu factori de cretere specifici (adugarea de
snge defibrinat sau chocolatizat, adugarea de
factori X i V), incubarea n atmosfer de CO2 i
prelungirea perioadei de incubaie.
Pt. Mycobacterium tuberculosis se foloseste
mediul Lowenstein Jensen
Grosimea mediului, de 4 mm, este important,
deoarece AB difuzeaz n mediu att n suprafa
ct i n profunzime, deci, o grosime mai mare
duce la false rezistene (zone de inhibiie eronat
mai mici), n timp ce o grosime mai mic de 4 mm
duce la creteri false ale zonelor de inhibiie, deci
false sensibiliti.

Fiecare lot de mediu nou preparat trebuie
testat pentru asigurarea unui pH mediu de
7,2-7,4 la temperatura camerei; valori sczute
ale pH-ului pot altera rezultatele pentru
aminoglicozide i macrolide (false rezistene),
sau ale penicilinelor (false sensibiliti).

Plcile cu mediu pot fi stocate la frigider mai
multe zile, n pungi de plastic pentru a evita
deshidratarea, iar nainte de utilizare vor fi
introduse n incubator (10-30 min) pentru
echilibrare termic i ndeprtarea
condensului format.

se suspensioneaz 2-3 colonii izolate n ser
fiziologic
turbiditatea suspensiei se controleaz
nefelometric sau comparnd cu tuburi etalon
(conin suspensii de particule latex/sulfat de Ba
avnd turbiditate determinat);
se ajusteaz la 0.5 McFarland (1,5x108 ufc/ml).
Inocularea gelozei Muller-Hinton cu aceast
suspensie se va realiza n rstimpul a 15 min. de la
preparare, pentru a preveni modificarea turbiditii
prin nceperea creterii bacteriene.

se alege un mediu corespunztor speciei
bacteriene testate
Mueller-Hinton pentru majoritatea bacteriilor
Mueller-Hinton cu snge pentru preteniosi (de
ex. streptococi)
medii speciale (pentru Haemophilus spp .
neisserii)
se introduce un tampon n suspensia bacterian,
se stoarce pentru ndeprtarea excesului de lichid
se sterge uniform toat suprafaa mediului de 3x

Scopul final al inoculrii mediului este
realizarea unei creteri bacteriene uniforme,
sub form de colonii confluente (sau
semiconfluente dup standardul francez, ce
utilizeaz un inocul mai slab).

se aleg antibioticele care trebuie testate in
funcie de specia bacterian testat si n funcie
delocalizarea infeciei
se depun discurile de antibiotic la l .5 cm distan
de marginea cutiei Petri si la 2.5-3 cm distan
unul fa de cellalt .
15 min. temperatura camerei

Unele antibiotice ncep s difuzeze n mediu
imediat dup aplicare, astfel c odat
aplicate pe mediu ele nu mai pot fi mutate.
Aplicarea discurilor se poate face fie
individual, cu pense sterile, fie cu
dispensere speciale care permit aplicarea
concomitent a 8-16 discuri, n funcie de
mrimea placii Petri utilizate (pe o plac
Petri rotund de 90 mm ncap 6 discuri, pe
una de 100 mm, 8 discuri, pe cea de 150 mm,
12 discuri, iar pe plcile ptrate de 120/120
mm, 16 discuri).

n funcie de specia bacterian: n atmosfera
obisnuit sau in atmosfer de CO2 (de ex.
streptococi, neisserii.)
35C-37C
16-18 ore (n cazul germenilor preteniosi pn la
20-24 de ore)
24 de ore n cazul testrii vancomicinei

apare o cultur bacterian confluent, n jurul
microcomprimatelor apar zone de inhibiie
(lipsa creterii bacteriene)
se citesc diametrele zonelor de inhibiie
se compar diametrele citite cu diametre
standard in funcie de antibiotic, cantitatea de
antibiotic din comprimat, specia bacterian
testat
Diametrul zonei de inhibiie complet este msurat,
incluznd i diametrul discului, cu ajutorul unei rigle
gradate, sau ubler.

Aspectul zonei de inhibitie trebuie sa fie clar
si cu contur net.
In situatia in care se observa chiar si o singura
colonie in interiorul zonei de inhibitie, se va
considera rezistenta la acel antibiotic,
indiferent de diametrul zonei de inhibitie .


rezultatul se raporteaz:
sensibil (S),
intermediar sensibil (IS)
sau rezistent (R) la antibioticul testat
fiecare rezultat de antibiogram se interpreteaz!
nu se comunic diametrele citite (metod
calitativ)

compoziia mediului (coninut de cationi, timidin)
pH (optim: 7,2-7,4)
grosimea gelozei (standard: 4 mm)
inoculul - 0,5 McFarland
microcomprimate (valabilitate, coninut, condiii de
pstrare)
timpul, temperatura de incubare
citirea diametrelor (lumin refractat/reflectat,
colonii izolate, prezena unui vl, margini
crenelate)
loturile noi de medii de cultur se testeaz cu tulpini
de referin.

Principiu
Galeria ATB permite determinarea
sensibilitii microbiene la un set de agenti
antibacterieni / antifungici , incorporate ntr-
un mediu semisolid. Este alctuit din 16
perechi de godeuri, din care 2/4 nu conin
antibiotice/antifungice i sunt martori de
cretere.
Celelalte perechi de godeuri conin diferite
antibiotice n cite dou concentraii (c =
concentratie mai mica i C = concentratie mai
mare) pentru a putea eticheta fiecare tulpin
testat ca fiind sensibil, intermediar sau
rezistent.

Din tulpina de testat este preparat o
suspensie care este transferat n mediul de
cultur cu care este inoculat galeria ATB.
- Rezultatele se citesc vizual sau automat dupa
24-48 ore de incubare la 37C.
Citire si interpretare
Dac nu exist cretere la nici o concentraie
nseamn tulpin sensibil, daca exista
cretere numai n godeul cu concentraia mai
mic c nseamn sensibilitate intermediar,
daca exista cretere n ambele godeuri (c i C)
semnific rezisten la respectivul agent
antimicrobian.
Urmareste derminarea limitei de sensibilitate a
germenului fata de substanta data, indicand cc.
de antibiotic necesara pentru inhibarea
dezvoltarii sale.
Tehnica-la dilutii crescande de AB facute direct in
mediu de cultura lichid, se insamanteaza
cantitati egale de cultura bacteriana , stabilindu-
se dilutia maxima de antibiotic in prezenta careia
tulpina este inhibata.
-pentru fiecare AB se face o dilutie de pornire
- mediul de cultura utilizat este bulionul glucozat
2%

Se utilizeaza 10 tuburi cu bulion glucozat 1 ml in
fiecare tub. In primul tub se adauga 1 ml din sol de
antibiotic , se omogenizeaza si se trece 1 ml in al
doi-lea tub si asa mai departe pana pana in tubul
9 din care se arunca 1 ml.
Se insamanteaza tuburile cu cate o picatura din
cultura de testat.
Tubul 10 este martor
Incubare 18-20 h la 370C

Citire
Ultimul tub limpede reprezinta limita
sensibilitatii germenului fata de antibioticul
utilizat sau CMI= Concentratia Minima
Inhibitorie.
Daca se adauga un indicator de ph cresterea
bacteriana este pusa in evidenta in 4 h prin
virarea culorii indicatorului de ph-ului.

Metoda dilutiilor in medii lichide este tehnica cea
mai precisa de determinare a sensibilitatii
microorganismelor la antibiotice si
chimioterapice si in plus permite determinarea
concentratiilor bacteriostatice si bactericide ale
substantelor testate
Se realizeaza cu analizorul MiniAPI conform
indicatiilor din prospect specifice fiecarui tip
de germene, respectiv utilizandu-se
urmatoarele galerii de antibiograma: ATB
Staph, ATB Strep, ATB GN, ATB Enterococ. Se
urmaresc indicatiile de realizare a inocului, de
incubare si de interpretare specifice, descrise
in inserturi.
Principiul este cel al unei antibiograme prin
microdilutii cu puncte de ruptura.
Citirea se face automat prin softul
analizorului MiniAPI, inclusiv interpretarea
in sistem Expert.

Este varianta perfectionata a metodei
difuzimetrice prin care se determina CMI a unui
antibiotic.
Metoda foloseste in locul microcomprimatelor cu
antibiotic cate un epsilometru pentru fiecare
antibiotic ( fasii de material plastic, gadate,
imbibate cu cate un antibiotic). Gradatiile indica
valorile CMI in mcg/ml. Pe suprafata mediului
insamantat se depun radial la distante
convenabile epsilometrele si se incubeaza.
Zonele de inhibitie apar de-a lungul
epsilometrului si au forma ovalara. Valoarea CMI
se citeste pe epsilometru si corespunde gradatiei
aflate la intersectia cu limita de inhibitie.

Testarea sensibilitii la antifungice este n prezent
standardizat numai pentru metodele cu macro i
microdiluie i respectiv E-test. Deaceea n
laboratoarele clinice obinuite se practic fie
antifungigrama pe galerii automate de tipul
Candifast, ce au ca principiu metoda microdilutiilor,
fie E-testul.

Dozarea chimioterapicelor si antibioticelor
din umorile organismului este necesara
pentru evaluarea in vivo a eficientei unui
tratament cu chimioterapice sau antibiotice.
Astfel se poate stabili daca concentratia
substantei se mentine in umorile
organismului la un nivel activ, permite
controlul modului si ritmului de administrare
ajuta la aprecierea corespondentei intre
eficacitatea in vivo si in vitro a substantei
utilizate, etc.

Antibiograma este una dintre cele mai utile
determinari de laborator care aduce informatii
pretioase privind atitudinea medicului in terapia
cu antibiotice.
Antibiogramele se vor repeta ori de cite ori o
dicteaza evolutia clinica dupa tratamentul cu
antibiotice si eventual se vor utiliza asociatii de
antibiotice pentru a obtine un efect terapeutic
mai promt si prevenirea instalarii rezistentei
bacteriei la antibiotice si chimioterapice.