COLORANTES

De forma genrica, todos los tejidos de

origen animal son incoloros salvo que
contengan algn tipo de pigmento, en
cuyo caso adoptan el color que aqul les
proporciona. As ocurre, por ejemplo, en la
piel, donde la melanina pigmenta de color
ms o menos pardo la epidermis y anejos
cutneos, o en la sangre y en todos los
tejidos vascularizados, a los que la
hemoglobina confiere su caracterstica
coloracin roja o rosada.
La primera utilizacin conocida de un agente
colorante para teir un tejido animal se debe a
Van Leeuwenhoek (1714), que emple una
solucin de azafrn en vino para facilitar la
observacin de las fibras musculares estriadas
en sus preparaciones histolgicas. Ms tarde se
introdujeron como colorantes el carmn (Goppert
y Cohn, 1849) y la hematoxilina (Waldeyer,
1863). A partir de 1856 comienza la gran
expansin mundial de la industria textil motivada
por la fabricacin de los primeros colorantes
artificiales, los colorantes de anilina, que
rpidamente se extienden a los mtodos de
coloracin para cortes histolgicos provocando
un vertiginoso desarrollo de la histotecnologa.
El fundamento de cualquier mtodo de
tincin radica en la propiedad que poseen
todos los tejidos para incorporar y fijar de
modo variable diversas sustancias
coloreadas llamadas colorantes.
La percepcin de los colores por la retina
humana est ligada a la capacidad que
poseen sus fotorreceptores para captar la
radiacin luminosa comprendida entre 400
y 800 nanmetros de longitud de onda y
cuya mezcla homognea se denomina
convencionalmente luz blanca o espectro
visible de la radiacin solar.
Cuando un cuerpo iluminado por la luz refleja en
su superficie toda la radiacin que recibe, la
retina lo percibe de color blanco; si por el
contrario absorbe toda la radiacin emitida, se
percibe de color negro.
En el caso de que se produzca una absorcin
parcial de la radiacin lumnica, los
fotorreceptores retinianos captan el espectro
complementario de la radiacin absorbida,
producindose la percepcin de los colores.
En otras palabras, puede decirse que el color
visible es el complementario del color espectral
absorbido. Por ello y en sentido amplio, un
colorante puede definirse como una sustancia
que, puesta en contacto con un soporte
adecuado, se une a l de forma perdurable
transmitindole su color.
TIPOS DE COLORANTES
En funcin de su origen, se
distinguen dos tipos
fundamentales de colorantes:
naturales y
artificiales
Los colorantes naturales son
relativamente escasos y se obtienen
en forma de extractos a partir de
ciertas plantas o insectos. En la
histotecnologa de rutina son
ampliamente utilizados, siendo los
ms conocidos como colorantes
nucleares la hematoxilina y el carmn,
y como colorantes citoplasmticos, la
safranina y la orcena.
Los colorantes artificiales, en su mayor
parte derivados de la anilina (de rabe an-
nil, azul oscuro) comenzaron a
introducirse en la segunda mitad de siglo
XIX, y hoy da en nmero de varios
centenares, constituyen la base de
numerosas coloraciones histolgicas.
Aunque inicialmente se obtienen a partir
del alquitrn de carbn, en la actualidad
se sintetizan en el laboratorio, por lo que
su gama crece continuamente.
NATURALEZA QUMICA DE LOS COLORANTES:
CROMOFOROS, CROMOGENOS Y
AUXOCROMOS
El soporte qumico fundamental de la mayor
parte de los colorantes naturales y de la
totalidad de los artificiales son anillos
aromticos derivados del benceno. El hecho
de que los dobles enlaces entre los tomos de
carbono de estos anillos no sean fijos y, por
tanto, puedan ser reordenados, es la causa de
la gran diversidad posible de los derivados del
benceno y, en consecuencia, de los colorantes
de anilina.
El benceno, al igual que todos los
hidrocarburos aromticos, es
originariamente una sustancia incolora
aunque susceptible de absorber radiacin
dentro del espectro de la luz ultravioleta.
Si en un momento determinado se
produce la fijacin de los dobles enlaces
dentro del anillo por ocurrir alguna
reaccin qumica sobre ste, el derivado
bencnico que se obtiene puede absorber
radiacin luminosa dentro del espectro
visible y mostrar color.
Los radicales qumicos responsables de
la modificacin molecular a la que se
debe la aparicin del color reciben el
nombre genrico de grupos
cromforos, reservndose la
denominacin de cromgeno para el
conjunto formado por el grupo
cromforo ms anillo aromtico.
CROMGENO
=
grupo
cromforo
+
anillo
aromtico
Debe tenerse en cuenta, sin embargo,
que cromgeno no es sinnimo de
colorante, ya que el primero no siempre
posee apetencia especfica por los
tejidos o, lo que es ms habitual, no se
liga fuertemente a ellos.

En determinadas condiciones, un
colorante puede perder temporalmente
su capacidad para absorber radiacin
lumnica dentro del espectro visible.
Ello ocurre por lo general a travs de un
proceso de reduccin del grupo
cromforo que lo transforma en un
leucoderivado. En estos casos, el color
suele reaparecer tras realizar una
oxidacin que restaura el grupo
cromforo.
Los principales grupos
cromforos conocidos son
los radicales etileno (>C = C<),
carbonilo (>C=0),
tiazlico (>C=S),
imino (>C=N),
azoico (-N = N-),
nitroso (-N = 0),
nitro (-N02)
y en general cualquier anillo
derivado de las quinonas
La conversin de un cromgeno en colorante
est vinculada a la adicin sobre la molcula
aromtica, de otros grupos atmicos que le
confieren la propiedad de disociarse
electrolticamente o de formar sales con los
tejidos. Estos radicales reciben la denominacin
genrica de grupos auxocromos o
potenciadores de color, y por lo comn estn
dotados de carga elctrica, o lo que es igual,
poseen carcter cido o bsico, siendo los
responsables de que el colorante tenga mayor o
menor afinidad por la estructura que se va a
teir.
Los grupos auxocromos de ms
importancia son
los radicales hidroxilo (-OH),
carboxilo (-COOH),
amino (-NH2),
sulfhidrilo (-SH) y
determinados iones metlicos derivados del
hierro, cromo, aluminio, molibdeno, etc.
CLASIFICACIN DE LOS
COLORANTES SEGN SUS
GRUPOS CROMOFOROS
En funcin del grupo cromgeno que
contienen, se distinguen 8 grandes
grupos de colorantes:
a. Colorantes nitrados y nitrosados. Son
nitro (-NO2) o nitrosoderivados (-N = 0)
del benceno o naftaleno con algunos
grupos hidroxilo, amino, etc. El ms
sencillo es el 2,4,6-trinitrofenol o cido
pcrico, obtenido por nitracin del fenol.
La presencia de los tres grupos nitro
incrementa notablemente el carcter
cido del grupo fenlico.
b. Colorantes azoicos, que contienen el
cromforo -N = N- vinculando anillos
adyacentes derivados del benceno o
antraceno. En general, se trata de
colorantes cidos, pero tambin los hay
neutros o bsicos. Pueden ser a su vez,
monoazoicos (orange G, cromotropo 2R,
ponceau de xilidina), o diazoicos (sudan
rojo y negro, rojo Congo, escarlata de
Biebrich, azul tripn).
c. Colorantes derivados de la
antraquinona, obtenidos a partir de la
oxidacin del antraceno para constituir
anillos quinnicos (rojo de alizarina S).
d. Colorantes derivados de la acridina y
que contienen el cromforo >C = N-
(naranja de acridina).
e. Colorantes derivados de iminas
quinnicas, que poseen dos grupos
cromforos y en funcin de ellos se
clasifican en:
a. derivados oxacnicos (galocianina, azul de
Nilo, violeta de cresilo);
b. derivados tiacnicos (tionina, azul de
metileno, azur A, B y C, azul de toluidina,
tioflavina T), y
c. derivados acnicos (rojo neutro, safranina
E, azocarmn
f. Colorantes derivados del difenilmetano
(auramina) y del trifenilmetano (fucsinas,
verde ligero), cuyo cromforo es el grupo
>C=NH. Los colorantes de este grupo pueden
ser cidos o bsicos dependiendo de los
auxocromos vinculados a la molcula.
g. Colorantes derivados del xanteno, con
cromforos variables entre los que se
encuentra la pironina, rodamina y sulfaftalena)
h. Colorantes derivados de las ftalocianinas,
como el azul o amarillo alcin, que contienen
de dos a cuatro grupos de isotiouronio
alrededor de un tomo de cobre para formar
una molcula que recuerda vagamente al anillo
hem- de la hemoglobina.
Por lo comn, junto al nombre de los
colorantes y su designacin de grupo,
figuran algunas siglas y ciertos cdigos
alfanumricos. Las primeras corresponden
a abreviaturas de caractersticas comunes
a diversos colorantes, por ejemplo: B -
azulado; G = verdoso; L = insensible a
la luz; M = mezcla; R = rojizo; S =
soluble; W = soluble en agua; Y =
amarillento, etc.
CLASIFICACION DE LOS COLORANTES
SEGN SUS GRUPOS auxocromos Y
APETENCIA TISULAR
Se distinguen cinco grupos
fundamentales: colorantes bsicos,
cidos, neutros, indiferentes y
metacromticos.
COLORANTES BSICOS
Estn formados por la asociacin de un
cromgeno de baja intensidad y carcter
dbilmente cido, con grupos auxocromos
catinicos fuertemente bsicos que son los
responsables de la carga global del colorante.
Por este motivo se utilizan para colorear
estructuras acidas, principalmente contenidas
en el interior de los ncleos celulares en forma
de cidos nucleicos (lacas de hematoxilina,
fucsina bsica, galocianina, etc.).
COLORANTES CIDOS

Son productos de la unin de un
cromgeno de baja intensidad
dbilmente bsico con grupos
auxocromos cidos que confieren dicho
carcter al colorante. En general, tien
estructuras bsicas contenidas en los
citoplasmas celulares (eosinas, fucsina
acida, pironina, etc.)
COLORANTES NEUTROS
Se producen por la unin de carcter salino
entre colorantes cidos y bsicos para formar
un precipitado, comnmente insoluble en agua y
muy estable en disolucin alcohlica. De esta
forma, siendo su carga global neutra conservan
en parte la propiedad de colorear conjunta o
separadamente diversas estructuras.
Ello depende de que sean o no capaces de
atrapar alguno de los iones generados cuando
la sal se disocia tras ser inestabilizada al
colocarla en disolucin acuosa (tincin de
Giemsa). Las estructuras as coloreadas
adquieren una tonalidad polcroma.
COLORANTES INDIFERENTES

Son aquellos que no poseen un carcter
cido, bsico o salino definido, por lo que
habitualmente colorean los tejidos a travs
de un mecanismo por impregnacin fsica.
COLORANTES METACROMATICOS
En condiciones normales, la mayor parte de los tejidos
tienden a teirse con una tonalidad semejante a la del
colorante utilizado para su demostracin. Esta propiedad
recibe la denominacin de ortocromasia. Sin embargo,
cuando se utilizan ciertos colorantes bsicos derivados
de la anilina, algunas estructuras tisulares se tien con
tonos de color totalmente distinto al que cabra esperar
por el colorante empleado (por ejemplo, grnulos de los
mastocitos de coloracin roja con el azul de metileno o
de toluidina). Este efecto se conoce con el nombre de
metacromasia y las estructuras as teidas,
cromtropas. Los colorantes metacromticos son
sustancias qumicamente puras y no de carcter salino.
Por ello la explicacin ms comnmente aceptada para
este fenmeno es la de que se produce una
polimerizacin entre las molculas de colorante
adyacentes a la estructura que se va a teir.
MECANISMOS GENERALES DE LA
COLORACIN
Segn la naturaleza de la vinculacin
molecular entre los colorantes y los
tejidos, existen tres mecanismos
generales: de carcter fsico, fisicoqumico
o histoqumico.
Estos mecanismos combinados entre s
en distinta medida explican las
particularidades de las principales
tcnicas de tincin en anatoma
patolgica.
Los mecanismos de carcter
puramente fsico estn ligados a las
propiedades de disolucin e
impregnacin del colorante sobre el
tejido.
En el primer caso, el colorante es ms
soluble en el tejido que en el
disolvente que acta como medio de
transporte, de forma que tiende a
pasar desde ste a aqul. Un ejemplo
caracterstico de este tipo lo
constituyen las tinciones para grasas.
En el caso de la impregnacin, el
colorante, por su gran volumen molecular
o por una precipitacin selectiva en forma
de agregados insolubles, queda atrapado
entre la malla de clulas y fibras que
constituyen los tejidos. Ejemplos tpicos
de impregnacin son algunas tinciones
argnticas para clulas nerviosas, as
como las coloraciones diferenciales para
fibras colgenas del tejido conjuntivo.

Las tinciones ligadas a un mecanismo
principalmente qumico estn
basadas en el desarrollo de una
reaccin qumica entre el colorante
(comnmente un leucoderivado) y la
estructura objeto de tincin de forma
que al interaccionar ambos se produce
un nuevo cromgeno responsable del
color obtenido.
Los mecanismos fisicoqumicos de
coloracin tisular estn vinculados a la
formacin de uniones intermoleculares por
atraccin electrosttica o por fuerzas de
tensin superficial. Los primeros se basan
en la propiedad de ligarse entre s que
poseen las molculas de carga elctrica
contraria, de manera que los colorantes
de carcter cido tien las estructuras
bsicas, y viceversa, por electroadsorcin.
Los fenmenos de tensin superficial,
responsables de la interaccin molecular
en los lquidos, son debidos a las fuerzas
de gravitacin generadas al disponerse
las molculas muy prximas entre s.
Este tipo de mecanismo tintorial est
implicado fundamentalmente en
coloraciones que utilizan molculas en
dispersin coloidal para interaccionar con
agregados moleculares dispuestos en la
superficie de la estructura a colorear.
COLORACIONES NUCLEARES

La mayor parte de las coloraciones que se utilizan
habitualmente en histopatologa contienen algn
colorante que tie de manera especfica el ncleo
celular, definiendo su contorno y realzando su
contenido cromatnico.
Con esta finalidad se utilizan generalmente
colorantes de carcter bsico con apetencia por los
grupos fosfricos cidos del ADN. Entre ellos se
encuentran algunos colorantes artificiales como la
galocianina, el verde de metilo, el azul de alizarina
S, la fucsina bsica, el violeta de cresilo o el rojo
nuclear extra, si bien los de mayor importancia son
de origen natural como el carmn, la safranina y
sobre todo la hematoxilina, que es el colorante
nuclear por excelencia.
Hematoxilinas
La hematoxilina es un colorante natural que se extrae
del rbol hematoxylon campechianum, palo de
campeche o palo azul de Centroamrica. Inicialmente
fue utilizado para teir seda y lona, y en 1862 empez a
emplearse en la coloracin de tejidos animales.
En el comercio se encuentra en forma de cristales
rosados o amarillentos solubles en agua y alcohol.
Tradicionalmente se ha mantenido que la hematoxilina
en su forma natural no es un colorante, pero los
recientes progresos de la qumica de los colorantes han
permitido establecer que pese a expenderse en forma
de leucocompuesto, la molcula de hematoxilina se une
especficamente mediante puentes de hidrgeno a
diversos sustratos entre los que se encuentran mltiples
derivados de la celulosa, si bien esta unin no genera
color.