Bioqumica Metablica

Adriana Carneiro de Lima

Brbara Silva Tage de Souza
Flvia Mobili
Izabela Mendes
Mariana Carvalho
Natlia Stein
Uric AStimulates Fructokinase and
Accelerates Fructose Metabolism in the
Development of Fatty Liver*

*PLoS ONE, v. 7, n. 10, 2012.
Miguel A Lanaspa*, Laura G. Sanchez-Lozada, Christina Cicerchi,
Nanxing Li, Carlos A.Roncal-Jimenez, Takuji Ishimoto, Myphuong Le,
Gabriela E.Garcia, Jeffrey B.Thomas,Christopher J.Rivard, Ana
Andres-Hernando, Brandi Hunter, George Schreiner, Bernardo
Rodriguez-Iturbe
4
, Yuri Y.Sautin
5
, Richard J.Johnson

1. Division of Renal Diseases and Hypertension, Departament of Medicine,University of
Colorado Denver, Aurora,Colorado
2. 2. Laboratory of Renal Physiopathology and Nephrology Departament,INC Ignacio
Chavez,Mexico City,Mexico,
3. 3.Cardero Therapeutics,Incorporated,Menlo Park,California,United States of America,
4. 4.Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas-Zulia and Hospital Universitario y
Universidad del Zulia,Maracaibo,Venezuela,
5. 5.Division of Nephrology, Hypertension and Transplantation,Departament of Medicine,
University of Florida,Gainesville,Florida,United States of America.



Situando
Via alimentadora da gliclise










Figura: Lehninger
Fundamentos de Bioqumica - 4.ed.: A Vida em Nvel Molecular pgi 814
Introduo
Diabete tipo 2, obesidade e NAFLD aumentando em toda parte do
mundo.
Associados a adio de aucares os quais tm a frutose como o
maior componente (50% da sacarose,55% do xarope de milho).
A exposio frutose leva a um aumento da expresso da
frutocinase nos hepatcitos humanos e nos de animais e assim
sensibiliza essas clulas ao metabolismo lipognico.
Frutocinase no regulatria e consome todo o ATP,depleo de
ATP induz produo de cido rico.
cido rico parece estimular expresso de mais frutocinase.

Materiais e Mtodos
Cultura celular e silenciamento
HepG2 + polibreno (10g/ml)
Exposio a partculas lentivirais por 24h
Colocadas num meio com puromicina (2g/ml)
Clones analisados por western blot (90% de silenciamento)
Clones colocados em colnias de crescimento em sries de
diluio por 10 vezes + puromicina (2g/ml)
Nas culturas que envolveu alopurinol, probenicida e C75 as
clulas foram expostas substncias previamente por 8h
antes de entrarem em contato com o cido rico e a frutose

Experimento com ratos
Ratos machos adultos (Sprague-Dawley)
Frutose por 10 dias
Sacrificados
Fgado e soro coletados
Colorao com vermelho de leo O e PAS


Grupo controle Grupo Frutose Grupo Frutose e
Alopurinol
18% protena 18%protena 18%protena
6% gordura 6%gordura 6%gordura
- 15% frutose 15% frutose
- - Alopurinol(30mg/kg)
Imunoprecipitao da ChREBP acetilada

J foram demonstrados e descritos por Bricambert os nveis de
acetilao da ChREBP nas clulas HepG2




Ensaio de imunoprecipitao

HepG2 colocada em PBS 10
6
clula/ml
Interao DNA/protena em temp. ambiente por 10min + para
formaldedo
Interao terminada com glicina
Peletizao
Colocadas em tampes de lise( 5mM PIPES, pH 8,0 , 85mM KCl +
0,5 Nonidet-P40+protease inibidora
Extrato do ncleo centrifugado a 2000 rpm durante 5 min
DNA genmico colocado na pasta de A/G agarose
Complexo ChREBP+ anticorpo-ChREBP incubado a 4C durante
a noite e depois colocado em agarose

Esferas de agarose foram levadas com PBS com 1% Nonidet
-P40, 0,5% desoxicolato de sdio, 0,1% SDS seguido de 4
banhos no tampo.
Esferas de agarose foram coletadas e centrifugadas e a interao
foi revertida na incubao noturna a 67C
Os promotores de ocupao relativa foram analisados por PCR
usando primers:
ChORE proximal
5TCTGCGTCGACCTGGTCATG3 frente
5TTCAGCCGACGTAGACACGT3 reverso
ChORE distal
5TGAGGGTGTCTGAACGGT3 frente
5GAGCTGTTAAGGGCACCCAG3 reverso

Ensaio da luciferase-frutocinase

Luciferase utilizada como gene reprter
Primers usados:
5CAGGCTAGCTCAATGACTCACTGAATGAG3 frente
5CAGCTCGAGTCCTCGATCGTTTAGTATGG3 reverso
Regio sublinhada : stios de restrio
A luciferase foi adicionada a esses stios para acompanhar a
atividade do gene ChoRE na regio promotora da frutocinase







Mutagnese stio-direcionada

Foram mutados os stios ChORE
Mudanas no stio distal
CACGTG foram substitudos por TTCCCA
Mudanas no stio proximal
CGCTGT foram substitudos por TTCTCA
A atividade da luciferase foi analisada nas HepG2
HepG2 colocada em 6 placas de crescimento com 80% de acordo
com os construtos transfectados com a B-gal como reprter



Rplicas foram incubadas em condies normais e
expostas a frutose por 12h
As clulas foram lisadas e misturas com o substrato da
luciferase e foram medidas imediatamente
Todas as transfeces foram feitas em triplicata

Resultados
Figure1: Allopurinol prevents the development of hepatic steatosis in adult male rats
drinking fructose.*
Reference: Lanaspa MA, Sanchez-Lozada LG, Cicerchi C, Li N, et al. (2012) Uric Acid Stimulates Fructokinase and
Accelerates Fructose Metabolism in the Development of Fatty Liver. PLoS ONE 7(10):
e47948.doi:10.1371/journal.pone.0047948
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0047948
Figure 2. Allopurinol prevents KHK up-regulation in adult male rats drinking fructose
(n=5 for each group).
Lanaspa MA, Sanchez-Lozada LG, Cicerchi C, Li N, et al. (2012) Uric Acid Stimulates Fructokinase
and Accelerates Fructose Metabolism in the Development of Fatty Liver. PLoS ONE 7(10): e47948.
doi:10.1371/journal.pone.0047948
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0047948

Figure 3. Uric acid up-regulates KHK in human hepatocytes.
Lanaspa MA, Sanchez-Lozada LG, Cicerchi C, Li N, et al. (2012) Uric Acid Stimulates Fructokinase and Accelerates
Fructose Metabolism in the Development of Fatty Liver. PLoS ONE 7(10): e47948. doi:10.1371/journal.pone.0047948
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0047948
Figure 4. Allopurinol prevents fructose-induced CHREBP acetylation and nuclear
translocation in human hepatocytes.
Lanaspa MA, Sanchez-Lozada LG, Cicerchi C, Li N, et al. (2012) Uric Acid Stimulates Fructokinase and Accelerates
Fructose Metabolism in the Development of Fatty Liver. PLoS ONE 7(10): e47948. doi:10.1371/journal.pone.0047948
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0047948
Figure 5. Identification in human hepatocytes of ChoRE sites in khk promoter that are
activated by fructose and blocked with allopurinol.
Lanaspa MA, Sanchez-Lozada LG, Cicerchi C, Li N, et al. (2012) Uric Acid Stimulates Fructokinase and Accelerates
Fructose Metabolism in the Development of Fatty Liver. PLoS ONE 7(10): e47948. doi:10.1371/journal.pone.0047948
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0047948
Figure 6. Allopurinol prevents fructose-induced CHREBP nuclear translocation in adult male
rats drinking fructose.
Lanaspa MA, Sanchez-Lozada LG, Cicerchi C, Li N, et al. (2012) Uric Acid Stimulates Fructokinase and Accelerates
Fructose Metabolism in the Development of Fatty Liver. PLoS ONE 7(10): e47948. doi:10.1371/journal.pone.0047948
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0047948
Figure 7. Uric acid sensitizes human hepatocytes to fructose.
Lanaspa MA, Sanchez-Lozada LG, Cicerchi C, Li N, et al. (2012) Uric Acid Stimulates Fructokinase and Accelerates
Fructose Metabolism in the Development of Fatty Liver. PLoS ONE 7(10): e47948. doi:10.1371/journal.pone.0047948
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0047948
Consideraes finais

A regulao da frutocinase induzida por frutose mediada pelo cido
rico.
A frutocinase tem um gene alvo do fator de transcrio ChREBP
Alopurinol bloqueia a translocao e ativao do ChREBP
Primeira evidncia de que o cido rico pode regular diretamente o
metabolismo de frutose
O metabolismo de frutose pela frutocinase resulta na produo intracelular
de cido rico que tem como feedback a regulao da frutocinase e que
aumenta a sensibilidade da clula ao aumento dos triglicrides em
resposta frutose.