AVALIAO LABORATORIAL

DA HEMOSTASE
Testes de rastreio
Usados primeiramente para avaliar efeitos combinados de
factores que influenciam uma fase particular da hemostase.

Testes especficos
Avaliam o nvel ou a funo de um factor da coagulao ou a
funo plaquetria para que seja estabelecido um diagnstico
definitivo e correcto.
ESTUDO DA FUNO PLAQUETRIA
TESTES DE ROTINA

Contagem e Morfologia das Plaquetas

As plaquetas so observadas em relao quantidade e ao seu tamanho.
A variao normal dos resultados de 150.000-400.000 por L de sangue.
Utiliza-se o mtodo automtico para a contagem das plaquetas que feita
no mesmo canal de contagem das hemcias, sendo que a diferenciao de
ambas se d pelo volume.
Contagens falsamente reduzidas podem ocorrer, por exemplo, pela
presena de agregados plaquetrios ou de plaquetas gigantes, enquanto
que plaquetas falsamente elevadas podem traduzir a presena de
fragmentos de hemlise de glbulos vermelhos ou de leuccitos.

TESTES ESPECIFICOS

Testes de Agregao
Testes de Adeso
Testes de Secreo
Citometria de Fluxo


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AGREGAO PLAQUETRIA

Amostra: plasma em citrato rico em plaquetas

Requisitos de colheita:
Devido a muitos frmacos interferirem in vitro, o doente no deve tomar
qualquer medicao nos 10 dias que antecedem o teste
O doente deve tambm ser avisado para no tomar caf/ch e no comer 4
horas antes da colheita

2 metodologias:
Transmitncia para estudos de agregao
Agonistas: indutores fisiolgicos (colagnio, ADP, epinefrina, cido araquidnico)
no fisiolgicos (ristocetina)

Luminescncia para estudos de secreo
Libertao de serotonina, ATP, Ca2+
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Resposta bifsica
1 fase da agregao reversvel e deve-se ao agonista.
2 fase da agregao irreversvel e deve-se libertao do ADP pelas
plaquetas activadas (as quais produziram tromboxano A2).
Com o uso do colagnio ocorre apenas uma fase de agregao.
A ristocetina um antibitico que induz agregao plaquetria na presena
de FvW.

Os testes de agregao plaquetria so essenciais para o diagnstico de
Anomalias Plaquetrias Qualitativas.


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Interferncias na amostra

Colheita (no pode haver activao plaquetar)
Tempo que ocorre entre colheita e processamento (< 2 horas)
Contaminao do PRP com eritrcitos e lpidos
pH e temperatura da amostra no inicio do teste (37C)

Limitaes

Necessria grande quantidade de amostra
O teste decorre em condies no fisiolgicas
Procedimento limitado em trombocitopnias
Adio exgena de agonistas em quantidade varivel
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ESTUDO DA
COAGULAO
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TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADO (aPTT)

Determinao de deficincias adquiridas ou congnitas de factores das vias
intrnseca e comum (factores XII, XI, IX, VIII, X, V, II)
Pesquisa de anticoagulante lpico
Monitorizao teraputica da heparina no fraccionada


Teste
Amostra plasma citratado

incubao

Activador de superfcie (tromboplastina parcial, incapaz de activar via extrnseca)
Fosfolpidos aninicos
Ies clcio

Regista-se o tempo que o plasma leva a coagular.
A variao normal dos resultados obtidos entre 36-48 segundos.


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Monitorizao da teraputica com Heparina



As heparinas de alto peso molecular
(no-fraccionadas) potenciam a ligao
da AT trombina e ao factor Xa




As heparinas de baixo peso molecular
(heparinas fraccionadas) apenas
potenciam a ligao da AT ao factor Xa.
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O aPTT pode estar prolongado em situaes como:
Deficincia dos factores I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII;
Doena heptica, coagulao intravascular disseminada
(DIC) e transfuses sanguneas macias;
Teraputica com heparina, anticoagulantes orais (doses
altas) e trombolticos.


O aPTT pode estar diminudo em qualquer estado de hipercoaguabilidade.

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TEMPO DE PR-TROMBINA (PT)

Determinao de deficincias adquiridas ou congnitas de factores das vias
extrnseca e comum (factores VII, X, V e II)
Monitorizao da teraputica anticoagulante oral (AO).



Teste
Amostra plasma citratado

incubao

Factor tecidular exgeno (tromboplastina completa)
Ies clcio

Regista-se o tempo que o plasma leva a coagular.

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Monitorizao da anticoagulao oral

O valor do TP pode apresentar variaes, dependendo da sensibilidade do
reagente utilizado.
A OMS props que as tromboplastinas fossem padronizadas e criou o
International Sensitivity Index (ISI). Aps a determinao do ISI da
tromboplastina, os resultados podem ser referenciados como International
Normalized Ratio (INR).




O valor do ISI deve ser prximo de 1
A variao normal do INR entre 0.9 e 1.2.

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Um INR prolongado pode traduzir:
Deficincia dos factores I, II, V, VII e X;
Deficincia de vitamina K;
Teraputica com anticoagulantes ou com heparina em doses
elevadas;
Doena heptica grave, Sndrome nefrtico, DIC,
transfuses sanguneas macias.


O INR pode estar diminudo em estados pr-trombticos (como nos
perodos ps-parto ou ps-cirrgico).
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Testes de mistura com plasma normal

Estudo de TP e/ou APTT prolongados
Permite diferenciar um dfice de factor da presena de um inibidor
Mistura da amostra com plasma normal na proporo 1:1
Repetio do PT e/ou APTT aps mistura
Nova repetio ao fim de 2 horas de incubao a 37C (inibidores do FVIII
e FV so dependentes do tempo e temperatura)

Interpretao
Corrige: deficincia de factor No corrige: presena de inibidor
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ANLISE DOS FACTORES DA COAGULAO
A anlise funcional dos factores da coagulao baseia-
se nos testes de rastreio como o tempo de pr-trombina
e o aPTT. O plasma a estudar adicionado a plasmas
congenitamente deficientes em factores especficos da
coagulao. Determina-se o PT ou o aPTT, conforme o
factor utilizado.
Finalmente, compara-se o grau de correco do tempo
de coagulao com o de plasmas de referncia normais.
A distino entre Hemofilia A e B um exemplo da
necessidade de utilizar este tipo de testes especficos.
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TEMPO DE TROMBINA (TT)

Adio de trombina diluda ao plasma citratado.
O tempo de formao do cogulo depende apenas da quantidade de
fibrinognio presente na amostra, que convertida em fibrina.
A variao normal dos resultados obtidos entre 15-18 segundos.






TT prolongado:
a) Inibio da trombina (heparina, produtos da degradao da fibrina)
b) Fibrinognio anormal.


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TEMPO DE REPTILASE

TT aumentado avalia-se Tempo de Reptilase.
Adio de reptilase ao plasma citratado (enzima do veneno de uma
serpente insensvel heparina).
O tempo de formao do cogulo depende apenas da quantidade de
fibrinognio presente na amostra, que convertido em fibrina.
A variao normal dos resultados obtidos entre 15-20 segundos.






Teste prolongado na presena de fibrinognio alterado e dos produtos fibrinolticos.

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FIBRINOGNIO

Tempo de Trombina modificado
Adio de excesso de trombina ao plasma citratado
Tempo de coagulao proporcional concentrao de fibrinognio na
amostra
A variao normal dos resultados obtidos entre 150-400 mg/dl.


Nveis baixos:
- Deficincias adquiridas (protelise intravascular do fibrinognio pela trombina
coagulopatia de consumo). Deficincias adquiridas moderadas (produo reduzida,
perda no espao intravascular ou aumento de degradao).
- Deficincias congnitas

Nveis temporariamente elevados so encontrados devido ao comportamento do fibrinognio como
uma protena de fase aguda:
Transitrias: aps operaes, traumas, enfarte do miocrdio e infeces
Persistentes: neoplasias e doenas inflamatrias crnicas
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Tempo
Trombina
Tempo
Reptilase
Doseamento
do Fibrinognio
Avaliam a mesma reaco
Fundamento idntico
Informao distinta: alteraes qualitativas
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ANTICOAGULANTE LPICO

Constitudo por autoanticorpos (IgG, IgM, IgA) contra os fosfolpidos ou
complexos fosfolipidos-2-glicoprotena 1 ou factores de coagulao como
a protrombina.

Ocorre especialmente nas doenas autoimunes

Testes de coagulao para anticoagulante lpico
DRVVT (Dilute Russells Viper Venom Time)

Testes ELISA para anticorpos:
Anticardiolipina
Anti-2-glicoprotena
Antiprotrombina
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Teste de rastreio - Reagente simplificado DRVV (LA1)

Veneno da vbora de Russel activa directamente
o factor X na presena de Ca+

Anticorpos-antifosfolpidos

prolongam o tempo de coagulao

Teste no influenciado por deficincias dos factores de contacto, via intrnseca
ou anticorpos anti-FVIII, FIX ou FXI


Teste confirmatrio - Reagente DRVV rico fosfolpidos (LA2)

VVRd,
fosfolpidos em excesso saturao do inibidor
Ca+ (pretende-se corrigir tempo de coagulao)

Presena de anticoagulante lpico teste confirmatrio corrige
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Teste mistura plasma

Excluir deficincia de FII, FV e FX que prolongam o resultado do teste de
rastreio (LA1) e do teste confirmatrio (LA2)

Misturar plasma normal com plasma de teste
Se tempo coagulao prolongado presena inibidor (como o LA)




LA1 LA2 LA1 LA2 Diagnstico
amostra amostra amostra+plasma normal amostra+plasma normal
N N N N IL no detectado
N N Presena IL
N N Deficincia factor
N IL+ deficincia factor
Outro inibidor
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Variao normal de resultados:
reagente de rastreio LA1: 31 44 seg
reagente de confirmao LA2: 30 48 seg


Se tempo de coagulao de LA1 for prolongado faz-se o teste confirmatrio e
o resultado final expresso atravs da relao:

Ratio LA= tempo de coagulao do LA1 (0,8 1,2)
tempo de coagulao do LA2


1,2 1,5 presena LA fraca
1,5 2,0 presena LA moderada
> 2,0 presena LA forte
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ANTIGNIO DO FvW

Glicoprotena envolvida na adeso e agregao plaquetria.
Importante na hemostase primria com a formao de um tampo
hemosttico e no processo de coagulao pela estabilizao do FVII

Deficincia qualitativa e/ou quantitativa de vWF provoca a sndrome de von
Willebrand, um dos distrbios hereditrios mais comuns da coagulao.
3 tipos principais de vWFS:
Tipo 1: diminuio do vWF Ag
Tipo 2: deficincia qualitativa da actividade de vWF
Tipo 3: ausncia total de vWF

Partculas de polistireno covalente com Ac. especficos
+
Amostra contendo o Ag vW Agregao

detectada turbidimetricamente pelo aumento na turvao
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AVALIAO DOS
MECANISMOS
REGULADORES DA
COAGULAO
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ANTITROMBINA

Principal inibidor fisiolgico da coagulao sangunea.
Inibe irreversivelmente diferentes factores, tendo como enzimas-alvo
primrias a trombina e o factor Xa inibio acelerada na presena de
heparina (co-factor da heparina).
Utiliza-se um substrato cromognico para quantificao da AT
funcionalmente activa


FX complexado e inactivado
AT (amostra)
+
Reagente
(Heparina + FXa excesso)
FXa residual substrato produto reaco
(405nm)

Absorvncia inversamente proporcional actividade inibidora da AT

Diagnosticar deficincias congnitas ou adquiridas, associadas a um risco elevado de trombose.
Monitorizar a teraputica de substituio com concentrados de AT.

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PROTENA C

Inibidor da coagulao dependente da vitamina K.
Regula a actividade dos factores V e VIII
Utiliza-se um substrato cromognico para determinar a quantidade de PC
funcionalmente activa


PC amostra + Activador (veneno de serpente)

incubao

PC activada substrato produto reaco
(405 nm)

Deficincia Congnita de PC
- homozigtica (manifestaes trombticas graves)
- heterozigtica: clinicamente dominante (mais rara e com um risco aumentado
de trombose venosa); clinicamente recessiva (muito comum que raramente se
manifesta por trombose)


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PROTENA S

Protena plasmtica dependente da vitamina K.
Actua como co-factor da PCa na inactivao dos factores Va e VIIIa.
Circula no plasma sob a forma livre activa e sob a forma inactiva ligada
protena de ligao C4b.


Deficincia Congnita da PS:
- homozigtica (semelhante deficincia homozigtica da PC)
- heterozigtica (risco desenvolvimento da trombose venosa em jovens)
A deficincia em PS um factor de risco para a trombose arterial.
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Xa
V Va

Protrombina Trombina

Fibrinognio Fibrina solvel
XIII XIIIa
Fibrina Insolvel
PCa (reagente) PS (amostra)
liga-se
degradao
Pho
Ca2+
acelera a reaco de inactivao
Adio de plasma
deficiente contendo
fibrinognio, FV e
outros factores de
forma suficiente
Activador do FX (RVV)
Deteco da formao do cogulo
1 passo
2 passo
3 passo
aumento tempo de coagulao proporcional actividade da PS
Princpio do teste
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RESISTNCIA PROTENA C ACTIVADA (PCa)


Resposta anticoagulante diminuda do plasma PCa.

Causada pela mutao de um ponto no gene do FV (p. ex. FV de Leiden,
FV Cambridge e FV Hong Kong)

A capacidade de inactivao do FVa pela PCa retardada, levando a um
risco aumentado de trombose.


Princpio do teste:

- Incubao do plasma com o activador da PC (veneno da serpente Agkistrodon contortrix
contortrix)
- Adiciona-se reagente com DRVV (activador do FX) e determina-se o
tempo de coagulao.
33

Interferncias:

- Actividades dos factores II e V inferiores a 10% e do factor X
inferior a 20%
- Concentraes de PC inferiores a 50% pode conduzir a ratios baixos


Determinar a relao entre o tempo de coagulao com o activador e o
tempo de coagulao sem activador:

Inferior ou igual a 1,5 indica a variante do FV Leiden
Entre 1,5 e 2,1 pode derivar de concentraes baixas de PC

Em indivduos normais o resultado do teste com o activador prolongado 2
a 3 vezes comparado com o resultado do teste com tampo. Nos indivduos
com FV de Leiden, a activao da PC pelo veneno de serpente provoca
apenas um prolongamento insignificante em relao ao teste com tampo.

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PLASMINOGNIO

Proenzima da plasmina
Convertido em plasmina pelos activadores internos (uroquinase) ou pelos
activadores externos (estreptoquinase)
Utiliza-se um substrato cromognico para determinar o plasminognio
biologicamente activo.
Avaliao de desordens fibrinolticas e para controlo da terapia

Plg (amostra) + Estreptoquinase (reag)

incubao
actua
[plasminognio-estreptoquinase] substrato produto reaco
plasmina (405 nm)


Nveis diminudos ( sntese ou consumo): DIC, doenas hepticas, fibrinlise teraputica
Actividades elevadas: carcinomas, diabetes mellitus

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2-ANTIPLASMINA

Inibidor da plasmina, forma um complexo inactivo irreversvel e existe no
plasma sob duas formas principais: ligado ao plasminognio e no ligada
ao plasminognio.

2-antiplasmina amostra + Plasmina excesso


Plasmina residual substrato produto reaco
plasmina (405nm)


Nveis elevados: complicaes trombticas.
Nveis reduzidos: deficincias congnitas ou adquiridas, como na teraputica tromboltica, na
DIC, em doenas hepticas.

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D-Dmeros

Aps o processo de coagulao, o sistema fibrinoltico activado
resultando na converso de plasminognio em plasmina, o que cliva a
fibrina nos fragmentos D e E.

Produtos de degradao de fibrina ligados transversalmente gerados por
fibrinlise reactiva.

Partculas de polistireno covalente com Ac. monoclonal
+
Amostra contendo D-Dmero Aglutinao

detectada turbidimetricamente pelo aumento na turvao


Teste importante na excluso de eventos tromboemblicos como, por exemplo, trombose venosa
profunda ou embolismo pulmonar
Nveis aumentados associados ao risco de eventos tromboemblicos recorrentes aps
interrupo da teraputica anticoagulante oral.

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38
37C 15 25C 2 8C - 20C
LA1 e LA2 8h 1 dia 2 dias 1 ms
Thromborel 8h (aberto) 2 dias (aberto) 5 dias (fechado)
Trombina 8h 2 dias 1 semana 1 ms
Protena C 8h (Act)
1 semana (Subst)
2 semanas (Act)
6 semanas (Subst)
4 semanas (Act)
6 meses (Subst)
Plasminognio 1 semana 2 semanas 4 semanas (Reag)
6 semanas (Subst)
6 meses (reag podem
ser congelados 10x)
Antitrombina 8h 4 semanas
Pathromtin 2 semanas
Multifibren 8h 1 dia 5 dias 2 meses
ProC Ac R 6h 12 dias 2 semanas 2 semanas
Protena S 4h (Act) 8h 2 dias (Reag e Act) 2 meses
2-antiplasmina 3h (Reag)
1 semana (Subst)
2 dias (Reag)
2 semanas (Subst)
1 semana (Reag)
6 semanas (Subst)
1 ms (Reag)
6 meses (Subst)
D-Dmero 4 semanas 4 semanas
vWF Ag 1 semana 2 semanas
vWF Reagent 8h 2 dias
Estabilidade dos Reagentes
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