EXTRAO E ANLISE DE DNA

Dra. Adriana Dantas

UERGS Bento Gonalves
Objetivos

Mobilizar conhecimentos adquiridos sobre Estruturas
celulares e funo de DNA e de enzimas
Familiarizar os alunos com os procedimentos
envolvidos na extrao de DNA;
Exemplificar que a extrao de DNA o primeiro
passo de muitas aplicaes biotecnolgicas:
PCR
Clonagem-transfernciade genes
Tipagem molecular
Marcadores moleculares
O que DNA?

Aonde se localiza o DNA numa clula ?

Do que so formadas as membranas celulares ?

Qual a estrutura do DNA?

DNA determina as caractersticas de todos os seres
vivos.

DNA composto de um alfabeto de 4-letras
(nucleotdeo/ molcula) referido como A, T, C, and G.

A ordem do alfabeto determina as caractersticas
do organismos, como as letras de nosso alfabeto
determinam as palavras.

Cada clula do corpo humano contm >3 BILHES de
letras.
Cloroplasto
Mitocndria
Vacolo
Membrana celular
Parede celular
Citoplasma
Ncleo
(DNA)
A nica diferena entre
os organismos vivos a
quantidade e ordem do
alfabeto de DNA.


Componentes do DNA

DNA um polmero, sendo os monmeros os nucleotdeos,
chamado ento de polinucleotdeo.

Cada nucleotdeo consiste de um acar de 5 carbonos
(desoxiribose), uma base nitrogenada ligada ao acar e um
grupo fosfato.

Quatro nucleotdeos, que diferem somente na base
nitrogenada.

A = adenina
G = guanina
C = citosina
T = timina

Definies

A combinao de uma desoxirribose e uma base
constitue um desoxinucleosdeo.

A combinao de um fosfato, de uma desoxirribose
e uma base constitue um desoxinucleotdeo.


http://www.blc.arizona.edu/Molecular_Graphics/DNA_Structure/Purines_BS_Labels.GIF
Adenina e Guanina so Purinas.
As Purinas so as maiores bases.
9 tomos cada
http://www.blc.arizona.edu/Molecular_Graphics/DNA_Structure/Purines_BS_Labels.GIF
Timina e Citosina so chamadas Pirimidinas.
6 tomos cada


A Hidroxila do carbono-3 da
pentose do primeiro
nucleotdeo se liga ao grupo
fosfato ligado hidroxila do
carbono-5 da pentose do segundo
nucleotdeo atravs de
uma ligao fosfodister (ligao
covalente)
http://www.universitario.com.br/celo/topicos/subtopicos/genetica/dna/Image27.gif



Com base na estrutura de dupla hlice do DNA e nas
caractersticas de hidrofobicidade das molculas, a
estrutura do DNA fica da seguinte forma:

O grupo fosfato e o acar (parte hidroflica)
esto localizados na parte externa da molcula.
As bases nitrogenadas (parte hidrofbica)
esto localizadas na parte interna da molcula.



http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/c/c8/FirstSketchOfDNADoubleHelix.jpg
Primeiro rascunho do Francis
Crick da estrutura do DNA


Pontos importantes


Por conveno, um polinucleotdeo lido da extremidade
5para a 3.

As orientaes das duas fitas antipararela: suas
direes 5' - 3' so opostas.

As duas fitas so mantidas unidas pela energia de
muitas pontes de hidrognio (A=T e G=C) e interaes
hidrofbicas.

cidos Nucleicos
Extrao e Quantificao
DNA Eletroforese
Extrao
Purificao
Separao
Extrao
O DNA pode ser extrado de diferentes materiais, desde
fsseis e amostras herbarizadas a tecidos frescos:
razes, folhas, sementes, embries, endosperma, plen,
cultura de calos ou de clulas em suspenso
O objetivo de qualquer protocolo de extrao consiste em
obter DNA de alta qualidade, em quantidade, de forma
rpida e eficiente.
Os protocolos de extrao devem evitar a degradao do
DNA pelas DNAses.
Eliminar os polissacardeos que inibem a ao de enzimas
Eliminar as substncias fenlicas ou outros compostos
secundrios que podem danificar o DNA.
Isolamento e purificaao
Para o isolamento e purificao de cidos nuclicos,
necessrio separ-los efetivamente dos outros
constituintes celulares.
No caso especial dos cidos nuclicos, tambm
fundamental manter a integridade das molculas, que
devem permanecer inalteradas durante o procedimento
de extrao, pois as informaes contidas tanto no DNA
quanto no RNA dependem da sua sequncia.
Existem vrios mtodos descritos na literatura, e a
escolha depende do balano entre a praticidade,
qualidade requerida a finalidade de uso do cido nuclico
DNA na minha comida???

DNA na minha comida???


CURIOSIDADE:
Cada clula contm cerca de 3 metros de
DNA.
Refeio = 55.000.000 clulas ou
Cerca de 150.000 km de DNA.

O processo de extrao de DNA vegetal consta inicialmente, do
rompimento da parede celular e membranas celulares, liberando
a molcula de DNA.
O rompimento da parede celular e membranas celulares de
grande quantidade de material pode ser feito por macerao aps
o congelamento do tecido em nitrognio lquido ou diretamente
no tampo de extrao em tubo de microcentrfuga, quando a
quantidade de tecido pequena.
Todavia, junto molcula de DNA, molculas de protenas,
polissacardeos, RNA e outras so extradas.
Para que o DNA possa ser considerado de boa qualidade, essas
molculas devem ser eliminadas, utilizando tampes de extrao,
que so compostos por elementos que as eliminam da amostra
de DNA.
Processo de extrao
Ruptura dos tecidos
Detergentes
CTAB, Sarcosil e SDS so utilizados para auxiliar na liberao
de componentes celulares por lise das membranas celulares.
Juntamente com NaCl, esses detergentes ajudam na
precipitao do DNA ao final do processo e reduzem a
contaminao da amostra com polissacardeos.

Rompimento da membrana
Ao das DNAses
Para manter o pH em um valor que impea a ao das nucleases que
degradem o DNA, utiliza-se um tampo especfico (geralmente Tris-Cl),
para manter o pH em torno de 8,0.

A adio de EDTA inibe a ao das DNAses, pois esse composto um
quelante de ctions bivalentes, como o Mg+2 e o Ca+2, que so
cofatores das enzimas.

A desnaturao de protenas e eliminao de polifenis oxidantes da
molcula de DNA feita pela adio de 2-mercaptoetanol e
polivinilpirrolidona (PVP) ou polivinilpolipirrolidona (PVPP),pois possuem
efeito antioxidante, assim como a eliminao dos polissacardeos pela
adio de PVP, PVPP ou soroalbumina bovina (BSA) e o RNA
eliminado pela adio de RNAse.
Recuperao dos cidos nuclicos

A adio de clorofrmio:lcool isoamlico 24:1 (CIA) promove a
extrao de lipdios, protenas e polissacardeos, que so dissolvidos
nesse solvente orgnico (inferior), enquanto o DNA permanece na
fase aquosa (superior), fases estas separadas aps centrifugao.
Essas duas fases so ento separadas por centrifugao e o
sobrenadante contendo o DNA retirado do tubo.
Alguns protocolos incorporam ainda fenol ou proteases (proteinase
K) para facilitar a separao do DNA das protenas da cromatina.
Recuperao dos cidos nucleicos totais por precipitao em lcool
(isopropanol e/ou etanol) desidratam a molcula de DNA e na
presena de NaCl permitem sua precipitao ao final do processo,
formando um sedimento visvel na fase lquida do tubo.
Precipitao do DNA
A eliminao do RNA obtida por digesto com RNAse,
ou separao de RNA e DNA por solubilidade diferencial
em sais. Sob condies de alta concentrao de sais (ex.:
7,5 M de Acetato de sdio), DNA e os RNA pequenos
permanecem em soluo, enquanto que o RNA (> que 60
bases) precipita.
Os cidos nuclicos so polinicos solveis em gua.
Os sais de sdio e potssio de cidos nucleicos so
insolveis na maioria dos solventes orgnicos, incluindo
numa mistura de etanol e gua, mas eles no so
desnaturados por solventes orgnicos.
O detergente catinico CTAB solubiliza membranas
celulares, e dependendo da concentrao de NaCl no
tampo, CTAB forma um complexo com o DNA, e
utilizado para precipitar DNA seletivamente.
Anlise do DNA
Para a anlise de DNA, com a utilizao da digesto por enzimas de
restrio (ex. RFLP, AFLP), existe a necessidade obter-se DNA de boa
qualidade.
Contaminantes (polifenis, polissacardeos, etc.) interferem na atividade
dessas enzimas, reduzindo a eficincia das mesmas.
A contaminao por polissacardeos consiste na principal contaminao
afetando a pureza do DNA extrado de plantas.
Esses carbohidratos podem inibir a atividade de vrias enzimas usadas
em manipulaes biolgicas de DNA, tais como ligases, polimerases e
enzimas de restrio.
A maioria dos mtodos de extrao empregados no separam
eficientemente o DNA dos polissacardeos provavelmente devido a
similaridade estrutural entre esses dois tipos de polmeros.
A contaminao de polissacardeos depende da espcie, tecido, condies
fisiolgicas da planta. Certas espcies produzem um DNA muito
contaminado por polissacardeo, tomando difcil a ressuspenso do
pellet. (DNA precipitado).

Quantificao de DNA
20 50 100
Quantificao DNA (gel agarose 0,8%)
Protocolos
A maior parte dos protocolos de extrao disponveis
derivam basicamente do mtodo descrito por Dellaporta
et al. (1983) e aqueles que utilizam CTAB (brometo de
hexadeciltetrametilamnio) (Doyle e Doyle, 1987, 1990)
onde o DNA solvel sob altas concentraes de sal.
Para maiores detalhes consultar Brasileiro e Carneiro
(1998).




PROTOCOLO CTAB (DOYLE E DOYLE, 1987)

Este protocolo mais utilizado em espcies vegetais,
pois possibilita a extrao de DNA a partir de
pequenas amostras de tecido, no exige preparao
prvia do tecido e adaptvel a vrios tipos de
materiais.

O CTAB um detergente catinico (cationic hexadecyl
trimethyl ammonium bromide) que solubiliza as
membranas celulares, formando um complexo com o
DNA, que facilita uma posterior precipitao
diferencial desse complexo
Pode-se extrair o DNA, preparando-se uma
soluo de banana tratada com sal, gua
destilada, e shampoo (detergente) .

O detergente quebra a membrana celular,
dissolvendo os lipdeos (molculas de gordura)
e protenas da clula, alm de quebrar as
ligaes que mantm a membrana celular
intacta.
Introduo
O detergente forma ento um complexo com
os lpdeos e protenas, permitindo que
sejam filtrados para fora da soluo com um
filtro de caf.

O DNA das clulas ficam no filtrado.

O sal permite que o DNA precipite com a
adio de lcool (ons Mg e Cl).


Introduo
Em um liquidificador,
misturar uma banana
com um copo de gua
destilada (250ml).
Extrao de DNA

Bater por for 15-
20 segundos, at a
soluo virar uma
mistura.

Extrao de DNA
Num copinho de
caf, fazer uma
soluo contendo
1 colher de ch
de shampoo ou
detergente e 2
pitadas de sal de
cozinha.
Extrao de DNA
Adicionar 20 ml (4
colheres de ch) de
gua destilada.

Dissolver o sal e o
shampoo/ detergente
mexendo devagar para
evitar fazer espuma.
Extrao de DNA
soluo do passo
2, adicionar 3
colheres cheias da
soluo de banana
do passo 1.

Misturar a soluo
com a colher por 5-
10 minutos.
Extrao de DNA
Enquanto uma pessoa
mistura a soluo de
banana, outra coloca um
pedao (cone) de filtro de
caf dentro do outro copo
de plstico. Dobre as
abas do filtro para fora
para que no encoste no
fundo do copo.
Extrao de DNA
Filtre a mistura no
filtro e deixe a
soluo drenar por
vrios minutos at ter
cerca de 5 ml
(cobrindo o fundo do
copo) do filtrado para
testar.
Extrao de DNA

Pegar um tudo com
lcool gelado. Para
melhores
resultados, o lcool
deve estar o mais
gelado possvel.
Extrao de DNA

Encher a pipeta de
plstico com a
soluo de banana.
Extrao de DNA
Adicionar a
soluo ao lcool.
Deixe descansar
por 2 a 3 minutos
sem mexer o
tubo. muito
importante no
agitar o tubo.
Extrao de DNA
Voc pode assistir
o precitado branco
de DNA na camada
de lcool. O DNA
tem uma aparncia
de um muco
esbranquiado e
como se fosse uma
nuvem.
Extrao de DNA
Fenol usado para desnaturar e
remover protenas de solues que
contm cidos nuclicos.
1. Homogeneizao do material (nitrognio lquido
ou banho de gelo seco e etanol), com tampo.
2. Adicionar o mesmo volume de fenol amostra,
colocar no vortex ou agitar.

3. Centrifugar para separar 2 fases (de fenol
embaixo e aquosa acima). Transferir fase aquosa
para novo tubo.

Repetir 2 e 3.
Extrao com Fenol
Pontos Importantes
O fenol usado para remover protenas e
outros contaminantes da soluo aquosa do
DNA.




O clorofrmio ajuda desnaturar protenas e a
remover o fenol residual.

O lcool isoamlico geralmente adicionado
ao clorofrmio para reduzir espuma.
Material + Tampo de Lise: Tris, EDTA,
SDS, NaCl e proteinase K.
Digesto a 37 C (clulas, 2-3 hs) ou 55
C (tecido, overnight) sob agitao.
Precipitao com isopropanol
Resgatar o precipitado (nuvem) e
ressupender em gua ou TE.
Extrao simples
Extrao de DNA plasmidial
Plasmdeos: pedaos de DNA
extracromossmicos,
covalentemente fechados;
Codificam genes de resistncia
antibiticos ou metais pesados, produo
de pigmentos, de virulncia, etc.
Tambm possuem genes para sua prpria replicao
1-20 kb x ~ 5000 kb em E. coli, sendo fcil a separao
dos DNAs
Extrao de DNA plasmidial
Depois de crescer o plasmdeo recombinante em bactria, temos
que nos livrar dos outros componentes das clulas bacterianas
(membranas, parede celular, ribossomos, RNA e DNA cromossomal
Ento adicionamos uma soluo com NaOH
(que aumenta o pH e desnatura o DNA
cromossomal e no o do plasmdeo) e SDS (que
vai solubilizar as membranas e causar a lise
das clulas).
Centrifugar cultura e ressuspender pellet em
tampo Tris EDTA (que liga divalentemente a
ctions Ca e Mg e com isto ajuda a
desestabilizar a membrana de E. coli).
5 min 6000 rpm
Extrao de DNA plasmidial
Decrescemos o pH com acetato de potssio (o DNA cromossomal no
poder a voltar a sua estrutura original e sair de soluo)
Purificar o DNA com extrao com fenol e clorofrmio, seguido
de precipitao com etanol ou com uma membrana de slica gel
(o DNA vai se ligar membrana sob altas concentraes de sais
e se desligar com a reduo da concentrao de sais, ao contrrio
das protenas e sais que passaro direto. Aps lavagem com etanol
para lavar os sais o DNA pode ser eludo
Ao centrifugarmos, o DNA cromossomal precipitar e o plasmidial ficar
em soluo junto com protenas e sais.

O DNA pode se livrar do RNA pelo tratamento com RNAse A
Extrao de RNA
Soluo Desnaturante:
Tiocianato de Guanidina 4M
Citrato de Sdio 25 mM
0.5% Sarcosil
Beta-Mercaptoetanol 0.1 M
Envolve lise das clulas, desnaturao das
protenas da membrana celular e depois os passos
normais como em DNA
Envolve desnaturante forte para quebrar clulas,
solubilizar seus componentes e desnaturar
RNAses endgenas simultaneamente.
Extrao de RNA em tecido
foliar liofilizado
A extrao de RNA realizada em tecido foliar
liofilizado
Utiliza-se 300 mg de tecido liofilizado.
O tampo de extrao:
100 mM Tris HCl pH 7,5;
10 mM EDTA pH 8,0;
1 M NaCl;
0,1% SDS ;
1% Mercaptoetanol (colocado na hora de uso) e 1
mM ATA (solvel em etanol).
Completado o volume com gua ultra-pura DEPC.

Quantificaao do RNA
Espectrofotmetro em leitura de 260-
280nm.
Corrida em gel de agarose 1,5% com 1L
brometo de etdeo (10 mg/mL)
Eletroforese em 200 Volts por 15
minutos.

O RNA est INTACTO???
Gel de agarose
desnaturante: para
desfazer a estrutura
secundria do RNA
Revelao da extrao de RNA


G0 Gp F0 F p
DNA
RNA 28S
RNA 18S
RNA mensageiro
(nuvens)
Gel de agarose 1,5% com 1 L brometo de etdeo (10 mg/mL)
G0 - Gala sem inculo; Gp - Gala com inculo (pool de perodos);
F0 - Fuji sem inculo; Fp - Fuji com inculo (pool de perodos)
RNA 5.8S
mRNA
Extrao de RNAm

Eucariotos: usa-se colunas de celulose e oligo
dT ou magnetic beads e oligo dT (uma cadeia
sinttica de 20-30 timinas)
Usada para RNAm raros, para fazer sondas
ou para bibliotecas de cDNA.
1,5 a 5% do RNA celular


G0 Gp F0 F p
DNA
RNA 28S
RNA 18S
RNA mensageiro
(nuvens)
Gel de agarose 1,5% com 1 L brometo de etdeo (10 mg/mL)
G0 - Gala sem inculo; Gp - Gala com inculo (pool de perodos);
F0 - Fuji sem inculo; Fp - Fuji com inculo (pool de perodos)
RNA 5.8S
mRNA
Quantificao
Mais usada com Espectrofotmetro
A260 d estimativa da concentrao
Leitura da absorbncia a 260 e 280 nm




OD
260
= 1.0, dsDNA = 50 g/mL;
RNA = 40 g/mL
Desvantagens: interferncia com material para
extrao, inabilidade de diferenciar entre DNA e
RNA, sensibilidade: 50-250 ng DNA/ mL


RNA e pH (>7,5): pH cido afeta a absoro com
A260, ajustar com Na
2
HPO
4
(conc. final de1mM)
Tabela 2. Diluies com gua DEPC para 2 g / L de mRNA para as reaes de cDNA
0,54 4 2,16 3,12 Gala pool (inoc)
0,54 8 4,32 6,2 Gala zero
0,54 18,7 10.08 14 Fuji pool (inoc)
0,54 12 6,48 9 Fuji zero
[ ] (g/ 1
L)
Diluies (L) mRNA (g/L) RNA total (g /L)
Amostras
0,54 4 2,16 3,12 Gala pool (inoc)
0,54 8 4,32 6,2 Gala zero
0,54 18,7 10.08 14 Fuji pool (inoc)
0,54 12 6,48 9 Fuji zero
[ ] (g/ 1
L)
Diluies (L) mRNA (g/L) RNA total (g /L)
Amostras
Tabela 3. Quantificao do RNA total
3,12 1,69 0,23 0,39 Gala pool
(inoc)
6,2 1,73 0,45 0,78 Gala zero
14 1,82 0,96 1,75 Fuji pool (inoc)
9 1.76 0,64 1,13 Fuji zero
g / L 260/280 280 nm 260 nm
Amostras
3,12 1,69 0,23 0,39 Gala pool
(inoc)
6,2 1,73 0,45 0,78 Gala zero
14 1,82 0,96 1,75 Fuji pool (inoc)
9 1.76 0,64 1,13 Fuji zero
g / L 260/280 280 nm 260 nm
Amostras
Tabela 4. Anlise de pureza do RNA (livre de polissacardeos)
Sem resduo 2,0 0,34 0,68 Gala pool
(inoc)
Sem resduo 2,0 0,51 1,03 Gala zero
Sem resduo 1,94 0,19 0,37 Fuji pool (inoc)
Sem resduo 2,0 0,33 0,66 Fuji zero
Resultado 260/280 280 nm 260 nm
Amostras
Sem resduo 2,0 0,34 0,68 Gala pool
(inoc)
Sem resduo 2,0 0,51 1,03 Gala zero
Sem resduo 1,94 0,19 0,37 Fuji pool (inoc)
Sem resduo 2,0 0,33 0,66 Fuji zero
Resultado 260/280 280 nm 260 nm
Amostras
Tabela x. Calculo do RNA total no tubo e do mRNA
2,16 g / L 0,12 124,8 40 x 3,12 Gala pool
(inoc)
4,32 g / L 0,24 248 40 x 6,2 Gala zero
10,08 g / L 0,56 560 40 x 14 Fuji pool (inoc)
6,48 g / L 0,36 360 40 x 9 Fuji zero
mRNA (1,8%) mg g / 40 L 40 x g / L
Amostras
2,16 g / L 0,12 124,8 40 x 3,12 Gala pool
(inoc)
4,32 g / L 0,24 248 40 x 6,2 Gala zero
10,08 g / L 0,56 560 40 x 14 Fuji pool (inoc)
6,48 g / L 0,36 360 40 x 9 Fuji zero
mRNA (1,8%) mg g / 40 L 40 x g / L
Amostras
Clculos
DNA [ ] (g/L) =
OD
260
x F. D. x 50 (g/mL)
1000
F.D. = fator de diluio
Ex.: 3l de DNA + 97l H
2
0; OD
260
=0,0157
DNA [ ]= 0,0157 x 33,33 x 50 / 1000 = 26,16 ng/ l
Pureza
DNA: Razo A260/A280 >= 1,75 - 1,80

< 1,75 contaminao com lipdeos ou protenas
RNA: Razo A260/A280 ~ 2,0

< 2,0 contaminao com guanidina (da extrao)
> 2,0 contaminao com fenol ou clorofrmio
OUTROS MTODOS
Fluormetro: utiliza material fluorescente
que se liga ao cido nuclico sem
problemas com protenas (picoGreen;
sondas de cianina). Seletivos para dsDNA.


Vantagem maior a sensibilidade: 0,5 ng/
mL (100 a 1000 vezes maior que o
espectrofotmetro)

OUTROS MTODOS
Gel de agarose:
aplicando-se as
amostras de DNA
juntamente com
padres de
concentrao
conhecida
100 a 300 ng de plasmdeo
http://www.neb.com/nebecomm/productfiles/778/images/N3231.gif
Por meio de
corrida junto
a um marcador
de DNA
cidos Nuclicos
Estabilidade DNA versus RNA

Nucleases

Cuidados: autoclavagem de materiais e
tampes; estocagem (DNA e RNA).

TE (10 mM tris-HCl, pH 8,1, 1 mM EDTA) x
nucleases e DEPC x RNAses
Armazenagem de DNA e RNA
DNA: 4C (em TE) ou -
20C (maior tempo)
RNA: manter sempre no
gelo quando manipulado e a
-70C (maior tempo)

Pontos Importantes
Maioria das nucleases precisam de Mg para
atividade, o EDTA ajuda na inativao delas.



RNA normalmente armazenado em ddH
2
0 que foi
previamente tratada com DEPC (0,1%) para inativar
as RNAses.
Muitas RNAses sobrevivem autoclavagem ento
DEPC deve ser usado tambm para solues.
Importante inativar DEPC antes de usar pois pode
modificar o RNA e inativar enzimas (RT e quinases)

DEPC altamente txico para humanos !!!
DEPC incompatvel com TRIS !!!

ANIMAO
http://gslc.genetics.uta
h.edu/units/biotech/ext
raction/

Extrao de comida






Extrao dos fungos: meio BDA slido
Repicagem dos fungos: meio BD lquido
Liofilizao dos fungos:
Schfer and Wstemeyer (1992) e modificada por
Junghans et al. (1998)
Desestruturao das
membranas celulares
1.5
0.5
0.1
1.0
1.5
0.5
0.1
1.0
Ressuspenso
do Pellet
1.5
0.5
0.1
1.0
Adio de
Etanol
1.5
0.5
0.1
1.0
Precipitao dos
cidos nuclicos
Precipitao das
protenas e
polissacardeos
1.5
0.5
0.1
1.0
Ruptura dos
tecidos
Material
Quantificao do DNA: gel de agarose 0,8%
Quantificao do DNA extrado:
50 100 200 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 7 8 8 9 9 10 11 11 12 12 14 14 15 15 16 16 18 18 19
g/L
A
Figura 3. Gel de agarose 0,8% para quantificao do DNA micelial dos
isolados de Colletotrichum spp. A DNA extrado ainda com
impurezas; B DNA extrado limpo e j diludo para a concentrao
desejada (10g).
20 50 100 200 5 8 9 34 38 1 2 3 4 6 7 8 10 11 12 13 15 16 17 18 19 24 26 27 29 30 31 32 37 C1 C2 G9
g/L
B
Amplificao do rDNA:
Figura 4. A e B Produto do
PCR resultante da utilizao
dos iniciadores ITS1 e ITS4, em
gel de agarose 2% (M ladder
100 pb e CN controle
negativo).
A
B
M 37 38 39 40 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10C1 C2 C3 CN
100 pb
200 pb
300 pb
400 pb
500 pb
600 pb
100 pb
200 pb
300 pb
400 pb
500 pb
600 pb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
Quantificaao em gel de
agarose

Amostras padro
(20; 50; 100; 200 ng / L)
Amostras de DNA
Aplicar DNA - 2 L
Aplicar TC - 3 L
MTODO MTODO MINIGEL MINIGEL
Carregamento em gel de agarose 0,8%

COMPARAR A INTENSIDADE DE FLUORESCNCIA DA AMOSTRA PADRO E
ESTIMAR A QUANTIDADE DE DNA DA AMOSTRA

Amostras padro
(50; 100; 200 ng/L)
Amostras de DNA
bandas
50 100 200 1 2 3 4 5
Estimativa ( ng/L)
Amostra 1
Amostra 2
Amostra 3
Amostra 4
Amostra 5
300
50
50 - 100
mais de 300
200
Process Common procedure
Cell lysis
Protein removal
DNA precipitation
SDS, sarcosyl
CTAB
Proteinase K
Lysozyme
Freezing
Sonication
Grinding
Chemical
Enzymatic
Mechanic
Alcohol Ethanol
Iso-propanol
Phenol
chloroform
Sodium chloride
Sodium acetate
Membrane
Beads
Organic solvents
Salt
DNA binding
Process Common procedure
Cell lysis
Protein removal
DNA precipitation
SDS, sarcosyl
CTAB
Proteinase K
Lysozyme
Freezing
Sonication
Grinding
Chemical
Enzymatic
Mechanic
Alcohol Ethanol
Iso-propanol
Phenol
chloroform
Sodium chloride
Sodium acetate
Membrane
Beads
Organic solvents
Salt
DNA binding
Cell lysis
Protein removal
DNA precipitation
Cell lysis
Protein removal
DNA precipitation
SDS, sarcosyl
CTAB
Proteinase K
Lysozyme
Freezing
Sonication
Grinding
Chemical
Enzymatic
Mechanic
SDS, sarcosyl
CTAB
Proteinase K
Lysozyme
Freezing
Sonication
Grinding
Chemical
Enzymatic
Mechanic
Alcohol Ethanol
Iso-propanol
Alcohol Ethanol
Iso-propanol
Phenol
chloroform
Sodium chloride
Sodium acetate
Membrane
Beads
Organic solvents
Salt
DNA binding
Phenol
chloroform
Sodium chloride
Sodium acetate
Membrane
Beads
Organic solvents
Salt
DNA binding
Phenol
chloroform
Sodium chloride
Sodium acetate
Membrane
Beads
Organic solvents
Salt
DNA binding