Equipo 6

Bez Ramrez Oliveria Araceli

Osorio Garca Alexander
Prez Saucedo Salvador

Estos se basan en la
determinacin de cidos
nucleicos (AN) por medio de la
coloracin de los azcares que
los forman. Para el ADN es la
desoxirribosa y para el RNA la
ribosa.

Determinacin de
desoxirribosa

Determinacin de
ribosa.

Reaccin de Dische.
Formacin de color azul al calentar
el ADN extrado y purificado
previamente con difenilamina en
disolucin acida.
Se detecta ms fuertemente el
azcar reactiva en nucletidos de
purinas que en los de piriminas.
Se aade acetaldehdo para inhibir
la interferencia de otras molculas
Se cuantifica en el
espectrofotmetro a 595nm.

Se determina el RNA por medio de la
formacin de furfurano, producido
por la hidrlisis de la ribosa por
accin de HCl, y una posterior
reaccin con orcinol producen una
coloracin verde botella.
Se cuantifica mediante la medicin
espectrofotmetro a longitud de onda
de 665 nm

Reaccin de pentosas con
orcinol.
MTODOS RADIACTIVOS.

Estos se realizan por marcaje radiactivo o isotpico,
aadiendo al medio de cultivo un precursor marcado
que se incorpore a la clula de inters, en este caso
el ADN o ARN; aunque en algunos casos tambin se
pueden unir a molculas no deseadas.
La deteccin de la seal producida por los istopos
se realiza mediante la autorradiografa.

ADN
ARN
32
P (
32
PO
4
-3
)se une
tanto al ADN como al
ARN y a todas las
clulas que contengan
fosforo. Tiene una
vida media de 14.2
das por lo que
dificulta su
utilizacin.
Tambin se utilizan
el
3
H.
125
I o
14
C

Puede emplearse
ribosoma marcado
(por accin del
metabolismo es
transformada y puede
marcar a todas las
clulas que contengas
carbono)
Uracilo



Autorradiografia.

Se pone en contacto el
material hibridado con
una pelcula de
fotografa (para
radiografas),
formndose una
imagen que muestra la
presencia de la
radiactividad. Esta va a
depender de la
intensidad de la
radiacin emitida por
los istopos
empleados y el tiempo
de exposicin.

Fluorometra.

Se basa en la utilizacin de fluoroforos o
fluorocromos que tiene la capacidad de absorber
energa de radiacin magntica (U.V o Visible de
longitud de onda corta), emitiendo despus cierta
radiacin magntica (longitud de onda larga).
Se utilizan en el marcaje de las clulas, en biologa
molecular, son utilizados como agentes intercalantes
que se unen a cidos nucleicos para detectarse en
electroforesis, gradiente de densidad, o unidos a
sondas de hibridacin y cebadores de PCR.

Tipos de marcadores fluorescentes.

MARCADOR DESCRIPCION
Yoduro de propidio Se une a clulas daadas y emite una
fluorescencia intensa color rojo.
Naranja de acridina
Se adhiere tanto a clulas daadas
como a sanas. Emite una coloracin
segn se encuentre unido al tipo de AN.
Verde : cadena doble de ADN
Amarillo: ADN parcialmente
desnaturalizado
Rojo: ADN de una cadena o ARN.
Bromuro de etidio Es un agente intercalante.
ELECTROFORESIS.
Es un mtodo de separacin y de identificacin de
los AN. Los cuales se separan en geles de
poliacrilamida o agarosa, cuya movilidad de la
molcula depender de la masa molecular (numero
de pares de bases) y no de su carga ya que el ADN
tiene carga negativa y se dirigirn igualmente hacia
el nodo.

Tipos de geles y revelado.

Fragmentos de ADN de ~1000pb se separan en
geles de poliacrilamina (horizontal)
Fragmentos de ADN de ~20kpb se separan en geles
de agarosa (vertical)
Ya separados los fragmentos de ADN, se tien con
fluorocromos, que se deslizan entre los pares de
bases apilados provocando un desenrrollamiento
local produciendo fluorescencia.

Cuantificacin.
En uno de los posillos de gel,se vierte una mezcla
de fragmentos de ADN conocidos (patrn o escalera
de ADN). Se dejan separa y se revelan. A cada
banda formada se representa grficamente como
log del tamao de pb & log de la movilidad en mm.
Se forma una grafica lineal, en la cual se extrapolan
la distancia de cada una de las bandas obtenidas en
el problema y de determina el tamao de cada ADN.

Electroforesis en campo
pulsante.
Se emplea con fragmentos de ADN mayor de 20-40
kpb. El aparato consta de una placa de agarosa de
aprox. de 1%, y 2 o ms pares de electrodos. Estos
electrodos se activan secuencialmente durante
tiempos de 0.1-1000 seg, depende del tamao del
ADN. Las molculas de ADN avanzan a travs de
los poros del gel en forma extendida.
No se utilizan ADN previamente segmentados.
ULTRACENTRIFUGA.
Las molculas se separan en funcin de su densidad.
Se prepara un gradiente de sedimentacin con cloruro
de cesio (CsCl) que posee una alta solubilidad y baja
viscosidad, que su densidad varia de 1.8g*cm3 en el
fondo del tubo de ensayo a 1.55g*cm3 en el borde de la
superficie.
Puede durar desde horas hasta das para que se
establezca el equilibrio de sedimentacin.
La densidad de flotacin ()del complejo formado por
Cs+ DNA de doble cadena, depende de la composicin
de las bases.
Se forman bandas
dispuestas en tndem
dependiendo de la
densidad.

El ARN no suele formar
bandas en disoluciones
con CsCl, pero si en
soluciones de sulfato de
cesio (Cs
2
SO
4
) o
gradientes de sacarosa
que hacen que se
separen por su tamao.
Se utiliza para la
clasificacin del rARN

CROMATOGRAFA.
Asla a mARN, por poseer una secuencua de poli adenina en
el extremo 3 de la cadena
Agarosa o celulosa + poli uracilo
La secuencia de poli A se unen a la secuencia de poli U a altas
concentraciones y bajas temperaturas.
Por afinidad.
Tiene el mismo principio que la cromatografa po columna
de hidroxipatito.
Se tiene la columna en un bao Mara.
Conforme se valla desnaturalizando la doble cadena del
ADN, ira eluyendo con la solucin tapn.
Trmica.
muestra de ADN la cual si es de doble cadena queda ms
fuerte ligada que la de una cadena.
Se hace pasar soluciones tapn de fosfatos de bajas
concentraciones hasta altas concentraciones.
Se eluyendo primero ADN de una cadena y ARN y
posteriormente ADN de doble cadena.
Por hidroxipatito
(fosfato de calcio).
Descripcin. Cromatografa.
Efecto hipercrmico
A 260nm, la absorbancia de cualquier
polinucleotido se debe a sus bases
componentes.
El DNA de cadena sencilla absorbe en
magnitud similar a los nucletidos libres
mientras que el DNA de doble hebra
absorbe menos (efecto hipocrmico).


La desnaturalizacin del DNA va
acompaada de un aumento del 20-30%
de absorbancia a 260nm a medida que
este se funde, a esto se le conoce como
efecto hipercrmico
23
HIBRIDACIN ENTRE
SECUENCIAS
Se basa en la especificidad de la interaccin
entre las bases nitrogenadas de distintas
cadenas, de manera que se favorezca su
asociacin. Hay que contar con una secuencia
de diana dentro de un fragmento de DNA y con
una sonda, que es un fragmento pequeo de
DNA de secuencia conocida y complementaria a
la secuencia de diana. Cuando la sonda y la
diana se encuentran, el dplex se identifica con
radiactividad, fluorescencia o colorante.
HIBRIDACIN ESPECFICA POR
SOUTHERN BLOT
Mtodo de biologa molecular para
detectar una secuencia de ADN en una
mezcla compleja del mismo. Emplea
la electroforesis en gel de agarosa para
separar los fragmentos de ADN de
acuerdo a su longitud y, despus, una
transferencia a una membrana en la cual
se efecta una hibridacin con una
sonda.
24
1) Se extrae el DNA total de los leucocitos u
otras clulas.

2)El DNA se asla y se corta con una enzima de
restriccin.

3)Los fragmentos se ordenan por tamao en
un gel en un campo elctrico.

4)Los fragmentos ms pequeos migran ms
rpido del ctodo al nodo; los ms grandes
migran ms lento.
HIBRIDACIN ESPECFICA POR SOUTHERN
BLOT
25
4) Se transfieren los fragmentos a una membrana de
nitrocelulosa de nylon. El DNA se desnaturaliza (en
cadena simple) con un lcali y se fija a la membrana por
calentamiento moderado (80 C) o por un ligamiento
cruzado con UV.

5) Prehibridacin con sondas de ADN inespecfico para
bloquear los lugares de unin inespecficos que pudiera
haber en la membrana.

6) Marcaje de la sonda de DNA de cadena simple (DNA
genmico o cDNA) con nucletidos radioactivos (
32
P).
HIBRIDACIN ESPECFICA POR SOUTHERN
BLOT
26
HIBRIDACIN ESPECFICA POR SOUTHERN BLOT
5) Hibridacin de la sonda con los fragmentos de
ADN fijados a la membrana, y lavado de la
membrana para eliminar el exceso de sonda o
aquellas que hayan hibridado mal.

6) Revelado. El fragmento se identifica poniendo
en contacto una pelcula de rayos X con la
membrana. Aparece una banda negra en la
pelcula (autorradiografa), su tamao depender
de la longitud del fragmento de ADN, se
cuantifica en kilobases.

27
28
HIBRIDACIN ESPECFICA POR
SOUTHERN BLOT
29
Una sonda es un fragmento de ADN
del que se conoce la secuencia de
nucletidos, lo que permite
construir una cadena de ADN
complementara a sta en la cual se
marca uno de los 4 nucletidos (A,
T, C G).


30
31
TIPOS DE SONDAS

1) Sondas mono-locus (SLP): son especficas para
una regin de un determinado cromosoma. Se
unen a secuencias largas de nucletidos. Se
observan 1 2 bandas por individuo, segn sea
homocigoto heterocigoto. Son exclusivas para
ADN humano.

2)Sondas multi-locus (MLP): hibridan con
secuencias minisatlites presentes en varios loci
de diferentes cromosomas. Son sondas de 10-15
nucletidos que se repiten mltiples veces, y se
observan 10-20 bandas por persona. Se usan
para ADN humano y animales superiores.
32
Sondas multilocus Sondas unilocus
INCONVENIENTES DEL ANLISIS SLP EN LA CRIMINALSTICA
Se necesitan 20-100 ng de ADN, cantidad difcil
de conseguir cuando los indicios biolgicos son
mnimos.

Es difcil encontrar en estado no degradado toda
la cantidad de ADN para un anlisis con sondas
mono-locus.

El tiempo requerido es de 2-3 das.

Con el 1er. anlisis se consume la totalidad de la
muestra.
33
PCR
En 1983 Kary Mullis que amplifica fragmentos de
ADN especficos .Esta reaccin se conoce como
Reaccin en cadena de la polimerasa .
En proceso que permite copiar millones veces una
secuencia de ADN.
Otra gran ventaja es que la secuencia por copiar
puede estar en peas cantidades o una sola
molcula


Fundamento
La PCR se basa en el mecanismo usual de la
replicacin del ADN , de sus propiedades de
hibridacin y en la presencia de enzimas de
sntesis de ADN (polimerasas)
La PCR utiliza una Polimerasa de ADN termo
estable llamada Polimerasa Taq que se aisla del
Thermus aquaticus que es archae que vive en
manantiales calientes con temperaturas mayores a
90C.

La muestra de ADN que va ser copiado se coloca
en un micro tubo de 0.5 mL .
Se utiliza un buffer de MgCl
2
a pH 8.3 y los 4
desoxinucleotidos a que incorporan al nuevo
ADN(dCTp,dATP,dGTP y dTTP) .
Se agrega una escasa cantidad de polimerasa
termorresistente Taq y dos pequeos
oligonucleotidos (18-25 bases ) que sirven como
cebadores .


Las mezcla se coloca en el Termociclador .
95C para desnaturalizar el ADN
60C para hibridar.
72C para incrementar la longitud del nuevo ADN

Al calentar a 95C se preparan las dos cadenas
del ADN templado
Al enfriar a 60C cada cadena se puede hibridarse
en su secuencia especifica , con el primero y
delantero o trasero .
Al Calentar a 72C la polimera Taq empieza a
extender ,desde el extremo de un primero, una
nueva cadena unida al primero esta cadena va
copiando la secuencia del templado .

En el siguente ciclo a 95C se separan templados y
cadenas nuevas y ahora cada una sirve de usando
otros primeros .
De esta manera cada ciclo se duplica la cantidad
de ADN y en 30 ciclos es posible en teoria realizar
22
9
.


Aplicaciones de la PCR

Secuenciacin de ADN
Criminalstica
Diagnostico de enfermedades


RFLP ( Polimorfismo de la
longitud de los fragmentos de
restriccin)
Para detectar las variabilidades genticas a nivel
ADN es favorecida por existencia de enzimas
bacterianas conocidas como endonucleasas de
restriccin o enzimas de restriccin .

Estas enzimas de restriccion son producidas por
varias especies bacterianas para restringir la
entrada de Adn extrao en interior de las
bacterias dirigiendo o cortando el ADN en las
secuencias especificas recocidas .
A secuencias obtenidas se denominan sitios de
restriccin o sitios de reconocimiento
Por ejemplo la E.Coli produce la enzima
destruccin Eco RI que reconoce la secuencia
de ADN GAATTC cada vez que encuentra esta
secuencia corta en G y la A lo cual produce
fragmentos de restriccin.
Estos fragmentos especficos del ADN ser
mayor en el individuo que carezca del sitio
de restriccin que el que lo tenga .

Enzimas de rectriccion
mecanismo

Estas diferentes longitudes se pudieran visualizar
directamente seria posible observar las
diferencias en la secuencia del ADN entre los
individuos (polimorfismo del ADN).

Se ha ideado una serie de pasos para visualizar
estos polimorfismos .
Se extrae el ADN de una muestra de tejido por
lo general sangre .
El ADN se expone a una enzima de restriccin a
este proceso se le llama digestin de restriccin.

Para valorar variabilidad de la longitud se realiza
una electroforesis en gel con los fragmentos
obtenidos .
Los fragmentos migran en funcin de tamao .
El ADN se desnaturaliza al ponerlo en contacto
con soluciones alcalinas para fijar permanente la
posicin de los fragmentos
Los fragmentos se transfieren del gel a membrana
solida como la nitrocelusa .


Esta membrana contiene miles de fragmentos
ordenados por tamao.
Se disea una sonda que consiste un pequeo
fragmento ADN humano de cadena simple
insertado en un vector .
La sonda se marca radioactivamente .
La sonda identifica una porcion especifica del
ADN por lo general uno o dos fragmentos .


Para identificar la posicin de la sonda la
transferencia se expone a una pelcula de rayos x
que se oscurece en la posicin de la sonda por
emite partculas radioactivas .
Estas posiciones oscurecidas se denominan bandas
y la pelcula se denomina autor radiografa.