OBSERVACIN DE

MICROORGANISMOS A TRAVS
DEL MICROSCOPIO

MICROSCOPIO PTICO
Entorno de trabajo del microscopio ptico
UNIDAD
1
Los microscopios
Tipos de microscopios
Las clulas que componen los organismos no son visibles a simple vista,
por lo que, para poder estudiarlas, es necesario emplear instrumentos que
aumenten las imgenes.
Estos instrumentos son los microscopios, que son, principalmente, de dos
tipos:
MICROSCOPIO PTICO MICROSCOPIO ELECTRNICO
Microscopios
Estereoscpicos
o lupas
Compuestos

M. ptico,
fotnico
o corriente

M. contraste
de fases
M. de
fluorescencia
M. Electrnico
M. E. de transmisin

M. E. de barrido

TIPOS DE MICROSCOPIOS

Microscopio estereoscpico o lupa
Aparato simple que forma una imagen
aumentada. (app. 540 veces)
Mayor poder de penetracin que el
microscopio de luz
Microscopios Compuestos
Poseen dos lentes que producen una imagen
ampliada, vertical e invertida al objeto
Microscopio ptico, fotnico o corriente
Es de campo claro ya que la luz
que llega perpendicular a la
preparacin, la atraviesa y
penetra el sistema ptico,
permitiendo un campo bien
iluminado.
Clula de Pisum,
coloracin: safranina-fast-greenTraqueidas del leo de Pinus

El microscopio ptico tiene
un lmite resolucin de
cerca de 200 nm (0.2 m).
Las clulas observadas
bajo el microscopio ptico
pueden estar vivas o fijadas
y teidas.
UNIDAD
1
Los microscopios
El microscopio ptico
Est formado por un sistema de lentes y emplea para iluminar un haz de
luz. Aumenta las imgenes hasta 1000 veces.
Sus principales componentes son:
Oculares. Lentes a travs de las que se
observa la preparacin ampliada.
Objetivos. Lentes que aumentan el tamao
de la imagen.
Platina. Sobre ella se coloca la
preparacin, que se sujeta con una pinza.
Tornillos de enfoque. Mueven la platina arriba
o abajo para enfocar la imagen.
Iluminacin. Espejo o lmpara que ilumina la
preparacin.
Aumento
Ninguno
Imagen
visualizada
ojo
Lente ocular
Imagen intermedia
(invertida respecto
a la muestra)
Lente objetivo
Muestra
Condensador
Fuente de luz
Microscopio ptico
Recorrido
de la luz
MICROSCOPIO PTICO
Los aumentos del objetivo en uso
se multiplican
...por los aumentos del ocular
MICROSCOPIO PTICO
Dependiendo del objetivo escogido obtendremos mayor o menor campo de visin y, en
correspondencia, mayor o menor profundidad de campo
Objetivo menor mayor campo,
mayor profundidad de campo o
de enfoque
Objetivo mayor menor campo, menor profundidad de
campo o de enfoque
Si cerramos el diafragma
mayor profundidad de
campo, pero menos luz
Si abrimos el diafragma
menor profundidad de
campo, pero ms luz
MICROSCOPIO PTICO
Moviendo el tornillo micromtrico (nunca ms de una vuelta)
alternativamente hacia delante o hacia atrs, podremos apreciar
nuevos detalles en la preparacin
Aqu, por ejemplo, logramos ver los cloroplastos de
estas clulas vegetales al mover ligeramente hacia
atrs o hacia delante el tornillo micromtrico
UNIDAD
1
IMGENES OBTENIDAS CON EL MICROSCOPIO PTICO
Este tipo de
microscopio permite
observar clulas vivas y
los movimientos que
realizan mantenindolas
en su medio.
Protozoos
UNIDAD
1
Tambin permite observar tejidos en
finos cortes, pero en este caso hay
que fijar las muestras, de manera que
las clulas estn muertas.
Para ver mejor las muestras pueden
teirse con colorantes especficos que
destaquen estructuras como el ncleo
o la pared celular.
CLULAS ANIMALES
CLULAS VEGETALES
IMGENES OBTENIDAS CON EL MICROSCOPIO PTICO
Microscopio de Hooke
(1665)
UNIDAD
1
Los primeros microscopios datan de 1610.
Fueron inventados por Galileo Galilei.
Algunos cientficos de la poca, como
Malpighi o Hooke, los utilizaron.
HISTORIA DEL MICROSCOPIO PTICO
UNIDAD
1
A mediados del siglo XVI, el
holands Anton van Leeuwenhoek
fabric microscopios con lentes
esfricas. Con ellos realiz
numerosas observaciones.
Algunos de aquellos microscopios
superaban los 200 aumentos.
Microscopio de
Leeuwenhoek
HISTORIA DEL MICROSCOPIO PTICO
Poco a poco, los microscopios fueron
sufriendo mejoras que permitieron
hacer nuevos descubrimientos en el
campo de la biologa celular.
Microscopio del
siglo XIX
HISTORIA DEL MICROSCOPIO PTICO
UNIDAD
1
Los microscopios pticos modernos
permiten aumentar la imagen ms de
mil veces
Microscopio
actual
HISTORIA DEL MICROSCOPIO PTICO
Microscopio ptico de campo oscuro
El microscopio de campo oscuro utiliza un haz enfocado de luz
muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el
espcimen.
El objeto iluminado dipersa la luz y se hace as visible contra el
fondo oscuro que tiene detrs, como las partculas de polvo
iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitacin
cerrada.
Las porciones transparentes del espcimen quedan oscuras,
mientras que las superficies y partculas se ven brillantes.
Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos
biolgicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con
iluminacin normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla.
Tambin es bastante utilizado en la observacin de muestras
metalogrficas para la observacin de detalles en superficies
con alta reflectancia.
Microscopio de contraste de fases
Se usa principalmente
para aumentar el
contraste entre las
partes claras y oscuras
de las clulas sin
colorear. Es ideal para
espcimenes delgados,
o clulas aisladas
Phase contrast image of cultured
epithelial cells using a 20X objective
Microscopio de contraste de fases
Es un microscopio ptico modificado que permite
contrastar sustancias de diferente grosor o densidad.
Mediante un condensador y un objetivo especial se
controla la iluminacin de tal manera que vaya en
diferentes rutas a travs de las distintas partes de una
clula.
El resultado es una imagen con diferentes grados de
brillo y oscuridad.
Con este mtodo, el material denso aparece brillante,
mientras que las partes de la clula que tienen una
densidad cercana al agua (citoplasma) aparecen oscuras.
Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin
necesidad de usar colorantes o matar microorganismos.
Microscopio de contraste de fases
Microscopio de fluorescencia
Usa luz U.V. con una longitud de onda
(100 y 380 nm) menor que la luz blanca
(380 a 750 nm). Esta luz excita ciertas
sustancias que emiten radiaciones
(mayor a 380 nm) que las hace visibles.
Algunos materiales no requieren
colorantes pues tienen fluorescencia
propia y otros deben ser teidos con
colorante fluorescente, es estimulado
por un haz de luz, emitiendo parte de la
energa absorbida como rayos
luminosos.
Clulas epiteliales , triple coloracin: ncleo
(azul), microtubulos (verdes), actina (rejo).
Microscopa de Fluorescencia
El microscopio de fluorescencia es una variacin del
microscopio ptico, dotado de luz ultravioleta en el que
los objetos son iluminados por rayos de una determinada
longitud de onda.
La imagen observada es el resultado de la radiacin
electromagntica emitida por las molculas que han
absorbido la excitacin primaria y reemitido una luz con
mayor longitud de onda.
Para dejar pasar slo la emisin secundaria deseada, se
deben colocar filtros apropiados debajo del condensador
y encima del objetivo.
Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia
(vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos.
Diagrama de Microscopio de
Fluorescencia
Est formado tambin por un sistema de
lentes complejo pero emplea para iluminar
un haz de electrones en vez de luz.
Aumenta las imgenes hasta un milln de
veces.
Sus principales componentes se
encuentran en el interior del sistema y son:
Objetivos. Lentes que aumentan el
tamao de la imagen (internos).
Iluminacin. Can de electrones que
genera un haz que puede atravesar la
muestra o rebotar en ella (interno).
Oculares. Lentes a travs de las que
se observa la preparacin ampliada
(externos).
EL MICROSCOPIO ELECTRNICO
UNIDAD
1
Este tipo de microscopio slo permite observar clulas muertas, pero la
ventaja es que permite estudiar las estructuras internas de los orgnulos
celulares y por tanto de las clulas.
En este caso las muestras deben ser muy finas para que puedan ser
atravesadas por los electrones y tambin tienen que estar deshidratadas.
ESTRUCTURA INTERNA DE UNA MITOCONDRIA ESTRUCTURA INTERNA DE UNA CLULA
IMGENES OBTENIDAS CON EL MICROSCOPIO ELECTRNICO
Microscopio electrnico
Posee mejor poder de resolucin y aumento
que los microscopios antes mencionados.
Permite visualizar la ultraestructura celular
El microscopio electrnico de
transmisin (MET) tiene un limite de
resolucin de cerca de 2 nm.
Un MET permite observar
profundidades despus de haber sido
fijadas y teidas con iones de metales
pesados.
Los electrones son dispersados cuando
pasan a travs de una fina seccin del
espcimen, y luego detectados y
proyectados hacia una imagen sobre
una pantalla fluorescente.
El microscopio electrnico de barrido
(MEB) tiene un limite de 2nm.
El MEB permite observar la
superficies de las muestras, despus
de haber sido fijadas y teidas con
iones de metales pesados.
Con esta tcnica los electrones son
reflectados sobre la superficie del
espcimen.
Microscopios electrnicos:

Estos microscopios son grandes y complejos.
Utilizan electrones en vez de luz y aumentan
los objetos hasta 250.000 veces.
Las imgenes que se producen son en blanco y
negro y muchas veces tienen colores falsos.

Microscopio Electrnico
Transmisin
Barrido
Microscopio electrnico
En el Microscopio Electrnico la luz se
sustituye por un haz de electrones que pasan
por un tubo (con vaco para mejorar el paso
de los electrones).
Permite la observacin de las estructuras
interiores de las clulas.
Sirve para visualizar virus.
Tiene una resolucin de 10 A (se pueden ver
objetos muy pequeos, incluyendo algunas
molculas).
Microscopio electrnico
Un haz de electrones es lanzado por un can en el que se
establece una diferencia de potencial, entre el ctodo y el
nodo.
El chorro de electrones pasa a travs de la muestra a observar,
que est colocada en una rejilla.
Los electrones chocan con la muestra y se desvan, y estas
desviaciones son recogidas por la pantalla.
Observamos la imagen a travs de una pantalla que es
excitada por los electrones que llegan a ella (mecanismo
similar a la televisin). Las imgenes las recogemos mediante
una placa fotogrfica que es impresionada directamente por
los electrones.
El Microscopio Electrnico de Transmisin(MET)

El microscopio electrnico de transmisin (MET)
tiene un limite de resolucin de cerca de 2 nm.
Un MET mira a replicas de clulas muertas ,
despus de haber sido fijadas y teidas con
ones de metales pesados. Los electrones son
dispersados cuando pasan a travs de una fina
seccin del espcimen, y luego detectados y
proyectados hacia una imagen sobre una
pantalla fluorescente.


El microscopio electrnico de transmisin (MET)
trabaja iluminando, un ejemplar en la platina con un
haz de electrones y enfocando y aumentando la
imagen con lentes magnticas. Esta imagen
electrnica, que es invisible, se transforma en una
imagen normal, visible mediante una pantalla
especial.

MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN
El Microscopio Electrnico de Barrido (MEB)

El microscopio elctrnico de barrido (MEB)
tambin tiene un limite de 2nm. Al igual que
el MET, el MEB permite mirar a clulas
muertas, despus de haber sido fijadas y
teidas con ones de metales pesados. Con
esta tcnica los electrones son reflectados
sobre la superficie del espcimen.

El microscopio electrnico de barrido (MEB)
sirve para examinar la superficie de los objetos. Produce
imgenes de gran aumento (ms de cien mil veces) y muestra
la forma real de los objetos. Adems de mostrar increbles
figuras, el microscopio electrnico investigador muestra
detalles que pueden ser de vital importancia para cientficos en
muchas reas, como la medicina. Trabaja examinando la
superficie de un objeto con un delgado haz electrnico.


MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO
Microscopio de
Campo Claro
Alga verde
(eucariota)
Microscopio de
Fluorescencia

Bacteria filamentosa
Teida con naranja
de acridina
Microscopa
Confocal por Lser

Cianobacteria
filamentosa
Microscopio de Contraste
de Fases
Saccharomyces cerevisiae
Observa detenidamente las siguientes fotos tomadas mediante microscopio
(micrografas) y seala qu tipo de microscopio se utiliz en cada caso. Justifica
a. Ameba, organismo
formado por una sola
clula (unicelular), que
mide cerca de 50
micrones
b. Clulas del interior de una
trompa de Falopio. Cada uno
de los pelitos que se ven
mide 10 micrones de largo y
se llaman cilios
c. Espermio
acercndose a un
vulo. El vulo
humano es una
clula que mide
poco ms de 100
micrones
d. Ncleo de una
clula animal, de
alrededor de 5
micrones de
dimetro
e. Corte transversal de una
hoja
f. Poros de salida de
glndulas gstricas.
Por una de ellas sale
un chorro de jugo
gstrico
Para obtener el mximo aprovechamiento de la
observacin microscpica, debe poder
relacionarse el comportamiento tintorial con la
estructura y composicin qumica de las diferentes
partes de la anatoma bacteriana.

Los colorantes utilizados en Microbiologa son
compuestos orgnicos que contienen grupos
cromforos y auxocromos unidos a anillos
aromticos.
TINCIONES :COLORANTES
TINCIONES :COLORANTES
Los colorantes son un cuerpo coloreado que puede
comunicar su color a otro cuerpo
Segn su origen;
Naturales
Sintticos, o artificiales
Segn sus propiedades qumicas:
cidos
Bsicos
Neutros Indiferentes
La distincin entre colorantes cidos y bsicos depende de
la carga de la parte de la molcula responsable del color.

Si es negativa se trata de un colorante cido y si es positiva
se trata de un colorante bsico.

Esta diferencia es importante debido a que, segn sean
cidos o bsicos, los colorantes tendrn afinidad por
diferentes zonas de la anatoma celular.

Algunos colorantes utilizados comnmente en Microbiologa
son fucsina bsica, cristal violeta, safranina, azul de
metileno, etc.
COLORANTES
En algunas coloraciones se utilizan sustancias
capaces de formar complejos insolubles con los
colorantes y que ayudan al proceso de
coloracin: los mordientes.
Ejemplos de mordientes comnmente usados
son el Lugol, el cido tnico y algunas sales.
MORDIENTES
VENTAJAS DE LOS COLORANTES
Facilitan la identificacin de clulas, bacterias y
objetos microscpicos en general

Los colorantes tien de forma parcial, total o gradual
las diferentes estructuras que integran los objetos y
principalmente los productos que se desea observar
PREPARADOS PARA MICROSCOPIA OPTICA.
PROCEDIMIENTO GENERAL.

Los pasos fundamentales previos a una coloracin son: extendido,
secado y fijado.
a) Extendido: se coloca una pequea porcin de la muestra en un
portaobjetos y se extiende con el asa en forma de valo. Para muestras
provenientes de medios slidos, debe colocarse previamente una gota de
agua sobre el portaobjetos.
b) Secado: puede dejarse secar el extendido a temperatura ambiente, o
colocar a 30-40 cm sobre la llama del mechero.
c) Fijado: la fijacin tiene como finalidades evitar el desprendimiento del
preparado durante la coloracin as como tambin preservar la forma original
de los microorganismos.
El procedimiento ms comn es pasar el preparado 3 veces por la llama
del mechero. Sin embargo, esta tcnica no es conveniente para ciertas
coloraciones para las cuales deben utilizarse procedimientos ms suaves.
Algunos agentes fijadores utilizados son etanol, metanol, formol, sales de
mercurio, tetrxido de osmio, cido pcrico, etc.
Debe tenerse en cuenta que, luego del procedimiento de coloracin, los
preparados pueden contener microorganismos viables, en especial si hay
esporos. Por consiguiente siempre deben considerarse como
potencialmente riesgosos y manejarse con precaucin.


Observacin en fresco y coloracin vital.

Cuando se desea observar bacterias sin afectar su viabilidad,
puede realizarse una observacin en fresco (sin colorear) o
utilizar colorantes diluidos como por ejemplo cristal violeta
1/5000. Con esta tcnica podr observarse la morfologa y
agrupacin de las bacterias as como tambin la movilidad.

Observacin en fresco.
Tcnica.
1- Sobre un portaobjetos colocar con el ansa una gota de agua
y realizar una suspensin de la muestra en estudio. No
extender.
2- Colocar un cubreobjetos.
3- Observar con poca luz.

Coloracin vital.

El procedimiento es similar al de la observacin en fresco pero en el paso 1, se
coloca una gota de solucin diluda de colorante en lugar del agua.
Existen portaobjetos especiales para realizar estas observaciones en los cuales
es posible colocar una mayor cantidad de lquido. Son los portaobjetos de
Boettcher y de Ranvier.

Coloracin simple.

Esta coloracin permite la observacin de la morfologa y agrupacin de los
microorganismos. Se realiza con un solo colorante. Entre los colorantes ms
utilizados para realizar coloraciones simples podemos nombrar el cristal violeta y
el azul de metileno. En general se utilizan en soluciones acuosas al 1 %.

Tcnica.
1- Extender, secar y fijar por calor.
2- Aplicar solucin de colorante durante alrededor de 2 minutos. En general, el
tiempo de la coloracin depende de la concentracin y del colorante utilizado.
3- Lavar con agua corriente.
4- Secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersin.
Tincin de clulas para
la observacin microscpica
Extensin de una fina capa
de clulas sobre el porta
Secado al aire
Fijacin por flameado del porta
Adicin del colorante
lavado y secado
Se coloca una gota de aceite
de inmersin sobre el porta y
se observa con el objetivo de
100X
TINCIN SIMPLE
Tincin negativa.

Para esta coloracin, se utilizan sustancias que no penetran en la clula y por lo
tanto se tie el fondo quedando los microorganismos incoloros. Normalmente el
tamao de las bacterias observadas por esta tcnica es mayor que el real y no
debe utilizarse para la medicin de microorganismos.
Los agentes ms utilizados son la nigrosina y la tinta china y los microorganismos
quedan incluidos en el colorante que forma una capa relativamente gruesa. Con
este mtodo pueden observarse morfologa y agrupacin as como tambin
estraucturas extracelulares como la cpsula.

Tcnica.
1- Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de un ansa, una gota de una
solucin acuosa de nigrosina al 10 %.
2- Tomar una porcin del cultivo, suspender en la gota de nigrosina y extender en
forma de valo.
3- Dejar secar (no exponer al calor) y observar con objetivo de inmersin.

COLORACIONES ESPECFICAS.

Coloracin de Gram.

Esta coloracin fue ideada por el bacterilogo dans Christian Gram en el ao 1883
y ha demostrado ser de suma utilidad. Permite separar los microorganismos en
Gram (+) y Gram (-) lo cual reviste especial importancia taxonmica.
En esta tcnica, el preparado fijado por calor se trata primeramente con cristal
violeta, luego se agrega Lugol como mordiente, se decolora con alcohol-acetona y
finalmente se contracolorea con fucsina o safranina. Las bacterias Gram(+) sern
las que resulten violetas luego del procedimiento de coloracin de Gram mientras
que las Gram (-) se vern rojas.
La explicacin de las diferencias en el comportamiento tintorial entre bacterias G(+)
y G(-), debe buscarse en la estructura y composicin de la pared celular bacteriana.

TINCIN DE GRAM
Paso 1
Paso 2
Paso 3
Paso 4
Tincin del frotis
Previamente fijado al calor,
con cristal violeta
Durante 1 minuto.
Todas las clulas se tien
de color azul-violeta.
Aadir Lugol,
dejar actuar 2 minutos

Todas las clulas siguen
de color azul-violeta.
Decolorar con alcohol
Las clulas Gram +
siguen de color azul-violeta.
Las Gram negativas
se decoloran.
Tincin de contraste
Con safranina 2 minutos.

Las clulas G+
se ven azul-violeta.

Las G- rosas o rojas.

Gram +
Gram -
TINCIN DIFERENCIAL