ENZIMAS

INTRODUCCION
Cada organismo produce una gran variedad de enzimas, la mayora de
las cuales slo se fabrican en pequeas cantidades y estn implicadas en
procesos celulares en cantidades ms grandes y en lugar de mantenerlas
dentro de las clula, las excretan al medio.
Las enzimas extracelulares son capaces de digerir materiales nutrientes
insolubles tales como celulosa, protena y almidn, siendo transportados
los productos de digestin al interior de la clula, donde son utilizados
como nutrientes para el crecimiento.
Estas enzimas extracelulares se utilizan en las industrias alimentaria,
farmacutica y textil y se producen gran cantidad, por sntesis
microbiana. Actan sobre un solo grupo qumico funcional, distinguen
fcilmente entre grupos funcionales de una misma molcula y, en
muchos casos, catalizan reacciones de forma estereoespecfica,
produciendo solamente uno de los enantimeros (por ejemplo: un D-
azcar o un L-aminocido).
INTRODUCCION
Comercialmente, se producen enzimas, procedentes tanto de bacterias
como de hongos.
El proceso de produccin es usualmente aerbico, y los medios de
cultivo similares a los empleados en las fermentaciones para producir
antibiticos.
La enzima se forma en pequeas cantidades durante la fase activa de
crecimiento, pero se acumula en grandes cantidades durante la fase
estacionaria del crecimiento.
Las enzimas inducidas se producen solamente cuando en el medio est
presente un inductor adecuado.
El potencial para la produccin industrial de enzimas ha aumentado
notablemente en los ltimos aos dada la facilidad con que se pueden
manipular los genes.
PRODUCCIN COMERCIAL DE
ENZIMAS
Las ventas mundiales globales para enzimas fueron de 450 millones
de dolares. Comercialmente se producen las siguientes enzimas:
.Enzimas utilizadas en la industria, como amilasas, proteasas,
catalasas, isomerasas y penicilina acilasas.
.Enzimas utilizadas con propsitos analticos como la glucosa
oxidasa, la alcohol deshidrogenasa, hexoquinasa, muramidasa y
colesterol oxidasa.
.Enzimas utilizadas en medicina, como: proteasas, lipasas y
estreptoquinasas.
Estas tres reas de aplicacin requieren niveles variables de calidad y
cantidad.
Diferencias en la calidad de las
enzimas
Enzima industrial Enzima analtica Enzima clnica
Escala de Toneladas Miligramo-gramo Miligramo-gramo
Produccin
Grado de Cruda Cristalina pura Pura cristalina
purificacin
Actividades Presente Generalmente ninguna, Slo isoenzima
secundarias

Origen Microbiano Microbiana, animal de Microbiano, animal
generalmente plantas, generalmente o de plantas, general
extracelular intracelular intracelular
Mltiples Parcialmente Posible en parte No posible todava
aplicaciones posible
Coste de Bajo Medio alto Alto
Produccin
PRODUCCIN COMERCIAL DE
ENZIMAS
En base a toneladas las ms importantes son las enzimas comerciales
(1,200 toneladas de protena pura/ao). Los E:U:A: y Europa
Occidental producen aproximadamente 40-45% del mercado

Las enzimas industriales son producidas en fermentadores de 120m
3
,
mientras que las enzimas con propsitos analticos o mdicos pueden
ser producidas frecuntemente en fermentadores de planta piloto.
Produccin de enzimas
industriales
Enzima Preparacin de enzima Ventas
(toneladas/ao) (%del total)
Proteasas de bacilos 6,200 45
Glucoamilasas 4,500 13
Amilasas de bacilos 4,200 5
Glucosa isomerasa 1,900 6
Renina (microbiana) 1,500 10
Amilasa (fngica) 800 4
Pectinasas 100 3
Proteasas (fungicas) 100 2
Otros --- 12

Porcentaje de las enzimas
industriales que se
utilizan en varios
mercados
El mayor porcentaje de las
enzimas industriales esta
dado por las industrias del
detergente y la industria del
almidn con ms de un
30%; siguindoles en 2do
lugar las industrias lcteas,
de destilacin y la de frutas
y zumos con un 10%; por
ltimo con un 8% la de
cerveceria y panaderia.
MEJORAMIENTO DE CEPAS
Las perspectivas para la aplicacin de las enzimas han mejorado
debido a la mejora en las siguienes reas:

1.Gentica microbiana
Pueden obtenerse altos rendimientos mediante manipulacin gentica.
Por ejemplo, la levadura Hansenula ha sido modificada genticamente
de forma que el 35% de su protena total consista en la enzima alcohol
oxidasa.

2.La optimizacin de las condiciones de fermentacin
Mediante induccin de la produccin de enzimas, uso de nutrientes de
coste inferior, utilizacin ptima de los componentes en la solucin
nutritiva e introduccin de fermentacin discontinua alimentada.

3.Liberacin de las enzimas
A partir de clulas mediante nuevos mtodos de ruptura celular.
MEJORAMIENTO DE CEPAS
4.Procesos modernos de purificacin
Como distribucin en contracorriente, cromatografa de intercambio
inico, cromatrografa de filtracin, cromatografa de afinidad y
precipitacin.

5.El desarrollo de procesos para la inmovilizacin de las enzimas y
su reciclamiento.
La cantidad de enzima que se necesita por cantidad de substrato
convertido aumenta considerablemente de esta forma. La proporcin
del coste de la enzima en algunos procesos ha llegado a ser solamente
un bajo porcentaje.

6.La produccin continua de enzima en reactores especiales
Los costes de inversin para un sistema nuevo pueden ser minimizadas
en una operacin continua, ya que se utiliza un equipo de tamao
menor.
Reduccin en el coste de la produccin del cido
L-asprtico mediante
el uso de tcnicas de inmovilizacin de clulas
PROTEASAS Y AMILASAS
Las enzimas microbianas que se
producen en mayor cantidad
industrialmente son las proteasas
bacterianas, utilizadas como
ADITIVOS EN LOS DETERGENTES
para lavar la ropa.
La mayora de estos detergentes para la
ropa contienen hoy da enzimas,
especialmente proteasas, pero tambin
amilasas, lipasas, reductasas y otras.
Muchas de estas bacterias se aislan de
bacterias alcalfilas, principalmente
especies de Bacillus como Bacillus
licheniformis. Estas enzimas que tienen
el pH ptimo entre 9 y 10, permanecen
activas al pH alcalino de las soluciones
de los detergentes.
Bacillus
AMILASAS
Las amilasas y glucoamilasas se usan
para la produccin de glucosa a partir
del almidn.
La glucosa producida puede ser
atacada por la glucosa isomerasa para
producir fructuosa (es ms dulce que
la glucosa o sacarosa) resultando un
edulcorante rico en fructuosa,
procedente de almidn de maz, trigo
o patata.
La utilizacin de este proceso en la
industria alimentaria ha ido
aumentando, especialmente para la
produccin de BEBIDAS
REFRESCANTES.

AMILASAS
.La enzima -amilasa lleva a cabo el ataque
inicial del polisacrido almidn, acortando la
cadena y reduciendo la viscocidad el polmero.
Esto se llama reaccin de clarificacin.
.La enzima glucoamilasa produce monmeros
de glucosa a partir de los polmeros acortados,
proceso llamado sacarificacin.
.La enzima llamada glucosa isomerasa realiza
la conversin final de la glucosa en fructuosa,
proceso llamado isomerizacin.
En la conversin de almidn de cereales en el producto final llamado JARABE
DE CEREALES RICO EN FRUCTUOSA, tienen lugar tres reacciones
sucesivas, cada una de ellas catalizada por una enzima.
Las tres enzimas se producen industrialmente por fermentacin microbiana.
El producto final es un jarabe que contiene partes iguales de glucosa y de
fructuosa, el cual se aade a las bebidas refrescantes y productos alimenticios
como edulcorante.
.EXTREMOENZIMAS: ENZIMAS DE
PROCARIOTAS QUE HABITAN EN
AMBIENTES EXTREMOS
El trmino extremozima se refiere a enzimas que funcionan a temperaturas
extremadamente altas o enzimas que funcionan de forma ptima bajo cualquier
condicin ambiental extrema.
Ejemplo: en fro, elevada concentracin salina, o a pH muy cido o muy alcalino y a los
organismos que las producen se les denomina extremfilos, para indicar que son
organismos que crecen mejor bajo condiciones inapropiadas para la mayora de los
microorganismos.

Los procariotas hipertermfilos,
crecen de forma ptima a
temperaturas muy altas, en algunos
casos por encima del punto de
ebullicin del agua porque producen
enzimas estables al calor
.EXTREMOENZIMAS: ENZIMAS DE
PROCARIOTAS QUE HABITAN EN
AMBIENTES EXTREMOS
Las extremozimas procedentes de termfilos estn
hacindose cada vez ms atractivas como
biocatalizadores para las aplicaciones industriales y
de investigacin que requieren enzimas.
En los hipertermfilos se han aislado y
caracterizado proteasas, celulasas pululanasas y
xilanasas extremadamente termoestables.
La pululunasa del hipertermfilo Thermococcus
litoralis que est relacionada con el organismo
Pyrococcus woesei es catalticamente ms activa a
una temperatura de 118C y la ferredoxina (una
protena ferro-sulfurada implicada en reacciones de
transferencia de electrones) de Pyrococcus furiosus
es activa a temperaturas similares y no se
desnaturaliza hasta los 140C.
.EXTREMOENZIMAS: ENZIMAS DE
PROCARIOTAS QUE HABITAN EN
AMBIENTES EXTREMOS
Estos biocatalizadores resistentes a la
temperatura as :
Las extremoenzimas que son activas en fro
de Psicrfilos.
Activas en presencia de elevadas
concentraciones salinas de halfilos.
Activas a pH muy alto o muy bajo de
alcalfilos y acidfilos
La gran especificidad de las enzimas y su
capacidad para distinguir entre ismeros
quirales, permite que stos funcionen
tambin en condiciones ambientales
extremas en la industria qumica.
Enzimas Microbianas Y Sus
Aplicaciones
ENZIMA FUENTE INDUSTRIAL INDUSTRIA

Amilasa Hongos Pan Panadera
Bacterias amilceos Papelera
Hongos Fabricacin de jarabe y glucosa Alimentaria
Bacterias Almidonado en fro de la ropa Almidn
Hongos Ayuda digestiva Farmacutica
Bacterias Eliminacin de revestimientos Textil
Bacterias Eliminacin de manchas, detergentes Lavandera


Enzimas Microbianas Y Sus
Aplicaciones
ENZIMA FUENTE APLICACIN INDUSTRIAL INDUSTRIA
Proteasa Hongos Pan Panadera
Bacterias Eliminacin de manchas Limpieza en seco
Bacterias Ablandador de la carne Crnica
Bacterias Limpieza de las heridas Medicina
Bacterias Eliminacin de revestimientos Textil
Bacterias Detergente domstico Lavandera
Invertasa Levadura Relleno blando de caramelos Confitera

Enzimas Microbianas Y Sus
Aplicaciones
ENZIMA FUENTE APLICACIN INDUSTRIAL INDUSTRIA
Glucosa Hongos Eliminacin de glucosa, Alimentaria
Oxidasa eliminacin de oxgeno
Papeles para la prueba de diabetes Farmacutica
Glucosa Bacterias Jarabe de cereales rico en glucosa Bebidas refrescante
isomerasa
Pectinasa Hongos Prensado, clarificacin vino Zumos de fruta
Renina Hongos Coagulacin de la leche Quesera
Enzimas Microbianas Y Sus
Aplicaciones
ENZIMA FUENTE APLICACIN INDUSTRIAL INDUSTRIA
Celulasa Bacterias Suavizante y abrillantador de tejidos; Lavandera
detergente
Lipasa Hongos Degradar la grasa Lechera, lavandera
Lactasa Hongos Degradar la lactosa a glucosa y Lechera, alimentos
galactosa
DNA Bacterias Replicacin del DNA en la Investigacin
polimerasa Archaea reaccin en cadena de la biolgica
forense

ENZIMAS INMOVILIZADAS
Para su utilizacin en procesos industriales, es deseable, pasar una enzima
soluble a un estado en el que de alguna forma quede inmovilizada.
La inmovilizacin hace ms fcil realizar la reaccin a gran escala,
adems estabiliza la enzima frente a la desnaturalizacin.
Existen tres formas fundamentales de abordar la inmovilizacin.

1.Formacin de enlaces transversales con glutaraldehido (polimerizacin)
de las molculas de la enzima.

2.Unin de la enzima a un soporte (portador).

3.Inclusin de la enzima
A. Encapsulacin en gel
B.Microcpsulas
C.Inmovilizacin en polmeros fibrosos

1.Formacin de enlaces transversales
(polimerizacin) de las molculas de la enzima.
La unin de las molculas de enzima
entre s se suele hacer mediante reaccin
qumica con un agente bifuncional
formador de enlaces transversales, tal
como el glutaraldehido.
La formacin de los enlaces transversales
en las enzimas implica la reaccin
qumica de grupos aminos de la protena
enzimtica, con el glutaraldehido.
Las molculas de enzima pueden unirse
de tal manera que se mantiene la mayor
parte de la actividad enzimtica.
Procedimientos de los enlaces
transversales con glutaraldehido
2.Unin de la enzima a un
soporte (portador)
La unin puede ser por adsorcin, por
enlaces inico o enlaces covalentes.
Entre los soportes utilizados tenemos:
Celulosas modificadas
Carbn activado
Minerales de la arcilla
Oxido de aluminio
Perlas de vidrio.
La estructura del portador
El tipo de sitio de unin funcional
La relacin de grupos hidroflicos a
hidrofbicos
El tamao de la partcula y la relacin
superficie/volumen deben ser adecuados
para cada enzima individual y para su uso
comercial final.

3.Inclusin de la enzima
La incorporacin de la enzima a una membrana
semipermeable.
Las enzimas pueden encerrarse en:
Microcpsulas
Geles
Membranas de polmeros semipermeables
Polmeros fibrosos como el acetato de celulosa.
Deben existir poros que sean lo suficientemente
pequeos para que las molculas de enzima no
sean arrastradas, pero lo suficientemente grandes
para permitir la difusin libre de substratos y
productos de bajo peso molecular a travs de la
barrera.
Pueden existir prdidas considerables en el
rendimiento durante la produccin de una enzima
encapsulada pero los productos terminados son
muy estables.
A. Encapsulacin en gel
Para rodear a la enzima pueden ser utilizados polmeros entrecruzados,
insolubles en agua, como la poliacrilamida, el alcohol polivinlico o el
almidn.
El mtodo utilizado implica:
La incorporacin de poliacrilamida en el gel.
La acrilamida y la enzima se polimerizan en minutos a temperatura
ambiente en un gel mediante un compuesto que facilita el
entrecruzamienteo (ej: N-N-metilen-bisacrilamida)
Un iniciador (persulfato sdico)
Un catalizador (-dimetilaminopropinico).
El gel puede entonces ser cortado y utilizado en un proceso discontinuo o
en un proceso en columna.
B.Microcpsulas
La inmovilizacin de las enzimas
utilizando preparaciones de
microcpsulas es que la enzima libre o
las clulas pueden ser rodeadas por
una membrana semipermeable del
polmero.
La produccin tiene lugar mediante
una reaccin de polimerizacin en la
superficie de gotitas acuosas de la
enzima que estn suspendidas en una
fase orgnica no soluble en agua.
Las enzimas microcpsuladas parecen
ser prometedoras para usos analticos
y clnicos.
C.Inmovilizacin en polmeros fibrosos
Este mtodo de inmovilizacin es similar al mtodo utilizado en las
microcpsulas.
Una emulsin de enzima en solucin acuosa y solventes inmiscibles en
agua se extruyen en un bao de precipitacin en el que se forma un
polmero fibroso que rodea a la enzima.
El triacetato de celulosa y otros derivados de celulosa actan como
polmeros adecuados.
CELULAS INMOVILIZADAS
En algunos casos no es necesario usar la enzima
purificada. Por el contrario, las propias clulas
ricas en enzima pueden ser inmovilizadas y el
proceso industrial funcionar de forma continua.
La inmovilizacin de las clulas de Bacillus
coagulans que contienen glucosa isomerasa,
para la produccin del jarabe de cereales rico en
fructuosa.
El jarabe de glucosa se pasa a travs de
columnas que contienen las clulas
inmovilizadas y se produce el jarabe de
fructuosa.
Para estos procesos de flujo continuo,
generalmente se necesitan instalaciones mucho
ms pequeas.

Utilizacin De Clulas Inmovilizadas Y
Enzimas Para Bioqumica Analtica
Puede utilizarse un sistema inmovilizado para el desarrollo de un
ensayo bioqumico preciso y sensible.
El principio bsico consiste en que la enzima acta sobre el substrato y
el descenso en la concentracin del substrato, el aumento en la
concentracin de producto o cambios en la concentracin de cofactor
pueden ser seguidos utilizando muchos mtodos de ensayo.
La reaccin puede ser seguida espectrofotomtricamente,
polarimtricamente, fotomtricamente.
La reaccin puede ser seguida calorimtricamente midiendo la
produccin de calor con un termistor, o midiendo la diferencia de
potencial con un electrodo.

Ensayos bioqumicos mediante un mtodo
enzima/termistor

SUBSTRATO ENZIMA CONCENTRACION
(mMol/l)
Acido ascrbico Acido ascrbico-oxidasa 0.05-0.06
ATP Hexoquinasa 1-8
Colesterol Colesterol oxidasa 0.03-0.15
Cefalosporina Cefalosporinasa 0.005-10
Etanol Alcohol oxidasa 0.01-1
Galactosa Galactosa oxidasa 0.01-1
Glucosa Hexoquinasa 0.5-25
Lactosa Lactasa/Glucosa oxidasa/catalasa 0.05-10

Electrodos sensores que utilizan enzimas o
clulas inmovilizadas

SUBSTRATO CEPA/ENZIMA BASES DE LA MEDIDA

Sacarosa Invertasa/Mutarotasa/Glucosa-oxidasa Aumento de Oxgeno
Monoamina Monoamina oxidasa Disminucin de Oxgeno
Colesterol Colesterol oxidasa Disminucin de Oxgeno
Acido actico Trichosporon brassica Disminucin de Oxgeno
Etanol Trichosporon brassica Disminucin de Oxgeno
Nistatina Levaduras Aumento Oxgeno como
resultado de la muerte
celular
Cefalosporina Citrobacter con cefalosporina Medida de pH

En algunos casos pueden ser empleadas una serie acoplada de reacciones.
Como ejemplo, la medida de la sacarosa puede ser unida a la medida de la
toma de oxgeno mediante la siguiente cadena de reacciones:
.Sacarosa + H
2
0 Invertasa -D-Glucosa + D-Fructuosa
.-D-Glucosa Mutarotasa -D-Glucosa
.-D-Glucosa + O
2
+ H
2
O Glucosa oxidasa D-Glucosa--lactona
+H
2
O
2

Este electrodo de enzimas que contiene invertasa, mutarotasa y glucosa
oxidasa funcion en ms de 85 determinaciones diferentes durante un
perodo de 10 das.

Las alfa-amilasas
Son enzimas extracelulares que hidrolizan enlaces alfa-1,4 glicosidicos.
Estas enzimas son endoenzimas, que cortan los substratos en el interior
de la molcula.
Su accin no es inhibida por enlaces alfa-1,6 glicosdicos, que por otra
parte no son hidrolizados por ellas.
Las alfa-amilasas son formadas por muchas bacterias y hongos. Se
clasifican de acuerdo con sus efectos de licuefaccin del almidn o
sacargenicos, su pH ptimo, rango de temperatura y estabilidad. Las
amilasas sacarognicas producen azucares libres mientras que las
amilasas lican el almidn no producen azcares libres.
Las bacterias que producen alfa-amilasas: Bacillus subtilis, B. Cereus,
B. Coagulans, B. Polymyxa, B. Acidocaldarius, B. Licheniformis,
Lactobacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Arthrobacter, Escherichia,
Proteus, Thermomonospora y Serratia.
Algunos hongos que producen alfa-amilasas: Aspergillus, Penicillium,
Cephalosporium, Mucor, Candida, Neurospora, Rhizopus.

Aplicaciones de las alfa-amilasas
Industria Origen Aplicacin
Bacillus Aspergillus
Del almidn + Licuefaccin del almidn para producir glucosa,
fructuosa, maltosa

Harinera + Modificacin de harina deficiente en alfa-amilasa

Del alcohol + + Licuefaccin del almidn previa a la adicin de
malta para sacarificacin

De panadera + Aumento en la proporcin de azcares fermentables

De cervecera + Preparacin de la cebada, licuefaccin de aditivos
+ Mejora de la fermentabilidad del mosto,
modificacin de las caractersticas de la cerveza.
Aplicaciones de las alfa-amilasas
Industria Origen Aplicacin
Bacillus Aspergillus
Del papel + Licuefaccin del almidn sin produccin de
azcar para el acabado del papel

De piensos + Mejora de la cebada tratada enzimticamente para
su utilizacin en la produccin de aves para carne
y la cra de terneras.

Azcar + Mejora de la filtrabilidad de las melazas de azcar
por degradacin de las partculas de almidn
contenido en las mismas.

Lavandera y detergentes + Aumento de la capacidad de limpieza de las
prendas manchadas con almidn, adicin a los
detergentes de las maquinas lavadoras.