CLONACION MOLECULAR

Tema 7.4
Presenta: Maritza Payan Parra
197446
RESULTADOS DE APRENDIZAJE
Comprende y explica los elementos y
fundamentos de la clonacin molecular.
Explica los procedimientos bsicos
para la clonacin molecular.
Conocer y discutir aplicaciones de la
clonacin molecular en diferentes
campos y actividades humanas.
ERRORES FRECUENTES

Confundir la accin de las enzimas
que participan en la clonacin.

No comprender el procedimiento de la
clonacin molecular.
CLONACION DEL DNA
Comporta la separacin de un gen
especifico o de un fragmento de DNA
de un cromosoma mucho mayor y su
unin a una pequea molcula de
DNA portador, para despus replicar
este DNA modificado miles o millones
de veces, mediante el aumento del
numero de clulas y la creacin de
mltiples copias del DNA clonado en
cada clula.
ELEMENTOS
Segmento de DNA
Vector
- Plasmido
- Porcin del genoma de un virus
bacteriano (l)
Clula
Enzimas
ENZIMAS UTILIZADAS EN LA
TECNOLOGIA DEL DNA
RECOMBINANTE
ENZIMA FUNCION
Endonucleasas de restriccin tipo II Cortan el DNA en secuencias especificas
DNA ligasa Une dos molculas o fragmentos de DNA
DNA polimerasa I (E. coli) Rellena los huecos en el DNA duplex por adicin
secuencial de nucletidos en los extremos 3`
Transcriptasa inversa Hace una copia del DNA a partir de una molcula de
RNA
Polinucleotido quinasa Aade un grupo fosfato al grupo OH del extremo
5`de un polinucletido para marcarlo o para permitir
su ligacin
Transferasa terminal Aade colas homopolimericas al grupo OH del
extremo 3`de un duplex lineal
Exonucleasa III Elimina nucletidos de los extremos 5`de una hebra
de DNA
Exonucleasa del bacterifago l Elimina nucletidos de los extremos 5`de un duplex
para exponer los extremos 3`monohebra
Fosfatasa alcalina Elimina fosfatos terminales tanto del extremo 5`como
del 3`(o de ambos)
TIPOS DE
ENDONUCLEASAS
- Las del tipo I cortan el DNA al azar.*
- Las de tipo III cortan el DNA a unos 25 pb de
la secuencia de reconocimiento.*
- Las de tipo II no necesitan ATP y cortan el
DNA en la misma secuencia de
reconocimiento.
* Se mueven a lo largo del DNA mediante un
mecanismo que requiere ATP

ESQUEMA BASICO
Vector + Fragmento de DNA

DNA Recombinante

Replicacin del DNA recombinante dentro de
las clulas husped

Aislamiento, secuenciacin y manipulacin del
fragmento de DNA purificado
CLONACION EN E. coli
E. coli fue el primer organismo utilizado y
todava es la clula husped mas comn.
Tiene muchas ventajas:
- Se conoce bien el metabolismo de su DNA.
- Muchos vectores de clonacin que se
encuentran asociados de manera natural,
estn bien caracterizados
- Se dispone de tcnicas efectivas para la
transferencia de DNA de una bacteria a
otra.
INTERACCION DE LA ENDONUCLEASA
DE RESTRICCION EcoRV CON SU
SECUENCIA DIANA
Se muestra la enzima unida a los productos de corte de DNA
en la secuencia reconocida por la endonucleasa.
La protena se ha eliminado y el DNA se ha rotado 180. La
enzima crea extremos romos. tomos de Mg en naranja.
1. Cortar el DNA en lugares
determinados. Las endonucleasas
especificas de secuencia
(endonucleasas de restriccin)
hacen las veces de tijeras
moleculares.
2. Seleccin de una pequea molcula
de DNA capaz de autoreplicarse.
Vectores de clonacin (plsmidos o
DNA vrico).
3. Unin covalente de dos fragmentos
de DNA: La ligasa une el vector de
clonacin y el DNA que se desea
clonar.
4. Traslado del DNA del tubo de
ensayo a una clula husped que
proporcionara la maquinaria
enzimtica necesaria para la
replicacin.
5. Seleccin o identificacin de las
clulas husped que contienen DNA
recombinante.

CORTE DE MOLECULAS DE DNA MEDIANTE
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION.
Los
fragmentos
pueden
ligarse a un
plasmido
CORTE DE MOLECULAS DE DNA
MEDIANTE ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCION
Un fragmento sinttico de
DNA que contenga las
secuencias de
reconocimiento de
varias endonucleasas
de restriccin se
puede insertar en un
plsmido tratado
previamente con una
endonucleasa de
restriccin
DISEO DEL PLASMIDO
pBR322
1. Posee un origen de replicacin,
en el cual las enzimas celulares
inician la replicacin (10-20
copias por clula)
2. Contiene dos genes que
confieren resistencia a
antibiticos.
3. Varias secuencias nicas de
reconocimiento para diferentes
endonucleasas suministran los
sitios donde cortar para insertar
las secuencias de DNA forneo.
4. Su pequeo tamao facilita su
entrada en la clula y la
manipulacin bioqumica del
DNA.
CLONACION E IDENTIFICACION
DE DNA FORANEO EN E. coli
1. pBR322 se corta en el elemento de
resistencia a ampicilina.
2. El DNA forneo se liga al pBR322
cortado. Si tiene xito, el elemento
de resistencia a la penicilina es
inactivado.
3. Se transforman las clulas de E.
coli. Despus se cultivan en placas
de agar que contienen tetraciclina
para seleccionar aquellas que han
incorporado el plsmido.
4. Las colonias individuales se
transfieren a posiciones
equivalentes de placas adicionales.
Una placa contiene tetraciclina y la
otra ampicilina.
Los plasmidos recombinantes se agregan a
un cultivo bacteriano que se trato antes con
iones de calcio.
Se someten a un breve golpe de calor y las
bacterias se estimulan para que capten el
DNA del medio.
El plasmido se replica en forma autnoma
en la clula receptora y se pasa a la
progenie durante la divisin celular.

CLONACION DE DNA EUCARIOTA EN
GENOMAS DE FAGOS
El DNA digerido se
fracciona por
electroforesis en gel
o centrifugacin con
gradiente de
densidad y los
fragmentos de 20 kb
de largo (aprox) se
incorporan
EL FRAGMENTO LAMBDA
1. El DNA se empaca bien en una forma
que es facil de almacenar y extraer.
2. Todo paquete que contenga un DNA
recombinante es capaz de infectar
una celula bacteriana.
3. Una caja Petri puede contener mas
de 100,000 placas diferentes.
EL CROMOSOMA
ARTIFICIAL BACTERIANO


Puede aceptar
grandes fragmentos de
DNA (hasta 500 kb)
Son plasmidos
bacterianos
especializados
EL CROMOSOMA
ARTIFICIAL DE LEVADURA
Puede aceptar
segmentos de DNA
de hasta 1000 kb
Son versiones
artificiales de un
cromosoma
artificial de
levadura
APLICACIONES
El 24 de febrero de 1997 el Instituto Roslin, de Escocia, se
anuncia la reproduccin con xito de la oveja "Dolly".
En julio de 1997 los mismos cientficos que haban clonado a
"Dolly" produjeron el cordero "Polly" que porta genes
humanos.
En noviembre de 2001 la empresa Advanced Cell Technology
(ACT) consigui clonar el primer embrin humano de la
historia, aunque su desarrollo se detuvo de forma natural
cuando slo contaba con seis clulas, mucho antes de
alcanzar la fase de blastocito, necesaria para obtener las
llamadas clulas madre. El objetivo era el de obtener clulas
madre para la investigacin de terapias gnicas.
En enero 2002, la empresa escocesa PPL Therapeutics
anuncia el nacimiento de unos cerditos, a los que se les pudo
eliminar el gen que causa que el sistema inmunolgico del ser
humano rechace transplantes de los rganos del cerdo.
En enero de 2002, los creadores de la oveja Dolly, anuncian que el
animal sufre artritis, por el envejecimiento prematuro que padece, a
sus cinco aos de edad.
En febrero de 2002 un equipo investigador que haba clonado una
docena de ratones inform de que ninguno de ellos logr sobrevivir.
Adems un equipo investigador japons llam la atencin sobre la
mayor frecuencia de abortos, deformidades, sobrepeso y muertes
prematuras entre otros animales que haban sido clonados.
Tambin en febrero de 2002, la Universidad A&M de Texas
present el primer gato clonado del mundo, un cachorro de dos
meses de edad al que llamaron "CC", siglas de "copia al carbn".
Segn los cientficos "los gatos tienen una forma felina del sndrome
de inmunodeficiencia humana que es un buen modelo para el
estudio del sida humano".
En noviembre de 2002 el experto italiano en fertilidad Severino
Antinori dice que espera que una paciente d a luz un beb clonado
en enero de 2003.

RATONES TRANSGENICOS
Se muestra un par de
hermanos de la misma
camada de 10 semanas
de edad.
El mas grande se
desarrollo con un huevo
inyectado con DNA + GH.
El mas grande pesa 44 gr,
y el pequeo 29 gr.
El gen GH se transmiti a
los descendientes.
BIBLIOGRAFIA
Nelson, D; Cox, M. LEHNINGER PRINCIPIOS DE
BIOQUIMICA. 4 edicion. Edit. Omega. Pags. 306-
317.
Alberts y cols. BIOLOGIA MOLECULAR DE LA
CELULA. 4 edicion. Ediciones Omega. Pags. 500-
504.
Lodish y cols. BIOLOGIA CELULAR Y
MOLECULAR. 5 edicion. Ed. Medica
Panamericana. Pags.
Karp, G. BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR. 4
edicion. Edit. Mc Graw Hill. Pags. 822-835
http://laguna.fmedic.unam.mx/lenpres/CH29.ppt#286
http://cultura.terra.es/cac/articulo/html/cac1321.htm