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Anlisis Instrumental:
Electroforesis en gel de
poliacrilamida.
Electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE,
PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis en ingls)
tcnica ms ampliamente
utilizada para separar
molculas biolgicas
especialmente ADN, ARN
y protenas.
Es un mtodo conveniente,
rpido y econmico a nivel de
muestra, pues se requieren
slo cantidades del orden de
microgramos de protena.
La poliacrilamida es un
soporte empleado
frecuentemente en
electroforesis en gel, es
qumicamente inerte, de
propiedades uniformes,
capaz de ser preparado
de forma rpida y
reproducible.
Ventajas
transparentes y estables en
un amplio rango de pHs,
temperatura y fuerza inica.
Para el estudio de cidos
nucleicos, el gel de
poliacrilamida se suele
emplear en situaciones donde
se dispone de fragmentos de
bajo tamao molecular (de
menos de 1000 pares de
bases).
En la tecnica de SDS-PAGE,
se mezclan las
protenas con el detergente
aninico SDS para formar
complejos desnaturalizados,
cargados negativamente.
Qu es la agarosa?
es un agente fuertemente gelificante, neutral, no
inico considerado como un polmero lineal cuya
unidad bsica es un disacrido.
Tampn de electroforesis
Concentracin de agarosa
ADN marcador
Tampn de carga
Aplicaciones:
Separar protenas
Determinar peso molecular de una protena
Separar protenas oligomricas
SDS-PAGE
Electroenfoque
Electroforesis 2D
Western Blot
Soporte: (restrictivo)
* Geles de Agarosa molculas grandes (0.1-60 kpb)
* Geles de Poliacrilamida molculas pequeas (6-2000 pb)
Aplicaciones:
Geles de agarosa
Geles poliacrilamida
Southern Blot
Northern Blot
muestra (-)
+
Campo elctrico (DV)
1.
2.
3.
4.
Preparar el gel.
Aplicacin de la muestra.
Electroforesis.
Deteccin por tincin con
Bromuro de Etidio (BrEt): se
intercala en el DNA y al irradiarlo
con luz UV emite fluorescencia.
inters
2. Transferencia a membrana
molculas
de DNA
molculas
de DNA
5. Resultado
e-
32P
Gel Agarosa
Southern BLOT
Todas los
DNA
DNA
de inters
32P
TAACGT
ATTGCA
DNA
inters
RNA
inters
2. Transferencia a membrana
molculas
de RNA
molculas
de RNA
Resultado
e-
32P
Gel Agarosa
Northern BLOT
Todas los
DNA
RNA
de inters
32P
TAACGT
AUUGCA
RNA
inters
Marcadores de peso
molecular:
* Mezcla de diferentes
protenas pre-teidas de las que
conocemos el peso molecular.
* Por comparacin y
extrapolacin podemos
averiguar el PM de nuestra
protena.
Preparacin de la Muestra
6. Coloque 15 l de la muestra de DNA cortado con las
endonucleasas de restriccin en un microtubo de 500 l.
Aada 5 l de amortiguador de la muestra (loading buffer).