Bsqueda de antibiticos: Rastreo

ANALISIS DE GENOMAS
MICROBIANOS
Virulencia, adaptacin al hospedador
y evolucin

ANALISIS DE GENOMAS
MICROBIANOS
Virulencia, adaptacin al hospedador
y evolucin

Secuencia Genmica
Implica la secuenciacin de una librera compuesta
por fragmentos aleatorios redundantes que abarcan
todo el genoma y se genera por cortes aleatorios
(Shotgun). Se secuencia entre 6 y 10 veces.
Tras la secuenciacin se ensambla, se rellenan huecos,
se anota y se localizan y predicen los posibles genes
La disponibilidad de la secuencia completa ofrece un
repertorio de todos los factores de virulencia e
inmungenos potenciales

Anlisis de la diversidad
Variable contenido cromosmico:
las bacterias contienen un nico cromosoma circular y ocasionalmente plsmidos circulares
Vibrio Cholerae: 2 chrom. circulares (2,69 y 1,07 Mb)
Borrelia burgdorferi: 1 cromosoma lineal (0,91 Mb) y 17 plsmidos lineales y circulares

Variable contenido G +C:

Borrelia burgdorferi: 29 % G+C

Mycobacterum tuberculosis: 65% G+C

Descripcin gentica muy limitada:

Escherichia coli: 40% de sus genes sin funcin conocida

Mecanismos de diversidad y virulencia:

Transferencia lateral de genes causantes de virulencia.

Decaimiento genmico y adaptacin al hospedador
Variacin de fase y antignica.

Transferencia lateral de genes

Mecanismo de diversificacin de la virulencia: muy
documentada entre patgenos entricos.
Mecanismos:
Transformacin
Conjugacin (transposones, plsmidos)
Transduccin (bacterifagos)
Recombinacin genmica.
La transferencia implica grupos de genes (de 5 a 100 kb)y
puede convertir un organismo benigno en otro patgeno.
Si contribuyen a la virulencia se denominan PI
(pathogenicity islands).
Ejemplos de PI: sistemas de secrecin tipo III y tipo IV

Transmisin lateral de genes de virulencia:

Sistemas de secrecin bacterianos tipo III y tipo IV

Codifican estructuras especializadas que

actan como jeringuillas moleculares para
introducir molculas efectoras (generalmente
toxinas) en la clula hospedadora
Presentes en bacterias patgenas Gram
negativas
Los genes que codifican estas estructuras
estn muy conservados entre bacterias y se
piensa que se han transmitido por
transferencia lateral
Las molculas efectoras que inyectan son
especficas de cada tipo de bacteria.
Tipo III en: E.coli, Slamonella enterica,
Bordetella bronchiseptica, Pseudomonas
areuginosa, Chlamydia, Shigella y Yersinia
spp.
Tipo IV en : H. pylori, E. coli, B. pertusi
Legionella pneumophila.

Transmisin lateral de genes de virulencia:

Deteccin de las Islas de patogenicidad por anlisis
genmico.

Base terica:

Los loci adquiridos por transmisin lateral poseen un contenido de G+C relativo distinto del resto
del genoma.
Este hecho permite el anlisis informtico de la secuencia total de un genoma para localizar picos
de variacin en el contenido de G+C
Se puede as medir y comparar el efecto de la transmisin lateral de genes entre patgenos.

Primeros estudios:

Confirman que las bacterias han sufrido frecuentemente transferencia de genes.

Muchos de estos genes pueden ser determinantes de la virulencia.
Helicobacter pylori (26695) presenta 30 picos de variacin G+C y Campylobacter jejuni muy
poca evidencia de transferencia lateral de genes. Sus genes housekeeping son muy similares
mientras que los genes responsables de su patogenicidad son muy divergentes. Helicobacter pylori
(26695) y Helicobacter pylori (j99) poseen un 7% de genes diferentes agrupados en una regin
hipervariable del genoma denominada zona de plasticidad.
Neisseria meningitidis serotipo B es una bacteria naturalmente competente con un genoma de
2.23Mb y una gran evidencia en su genoma de mltiples sucesos de transferencia lateral de genes:
1.910 seales de captacin de DNA. Tres grandes regiones de variacin en G+C (dos con genes de
patogenicidad.
Vibrio Cholerae. Se ha sugerido que su segundo cromosoma es un megaplsmido

Decaimiento genmico:

Generalizaciones:
La perdida de genes se incrementa con la adaptacin al hospedador.
Incremento del uso de los procesos celulares del hospedador
Fenmeno muy evidente en parsitos intracelulares.
Primeros estudios:
Ricktessia prowazeki (genoma de 1.11 mb). Pose muchos pseudogenes y la
mayor proporcin de DNA no codificante entre procariotas (> 24%). sPerdida de
genes no necesarios para su vida intracelular. Genoma sorprendentemente
similar al mitocondrial. F
Mycobacterium leprae presenta numerosos pseudogenes. Metabolismo muy
restringido y rango de hospedadores muy estrecho.
Mycobacterium genitales Mnimo numero de genes entre los seres vivos con el
mnimo nmero de genes (Micobaterias). Genoma de 0.58Mb
Yersina pestis se encuentra en una situacin intermedia. Por un lado aumento del
genoma por transferencia vertical. Adquisicin de tres plsmidos (uno genera
virulencia: sistemas de secrecin de tipo III). Por otra parte sufre reduccin del
genoma por decaimiento. Al menos presenta 100 genes interrumpidos.

Variacin de fase/Variacin antignica:

Definiciones:

Mecanismos:

Variacin de fase: la perdida o ganancia reversible de caractersticas

fenotpicas como resultado de cambios de expresin de uno o varios
genes.
Variacin antignica: la variacin de las estructuras superficiales del
microorganismo patgeno.
Ambas son estrategias de supervivencia comunes en bacterias patgenas.
Deslizamiento de una cadena por mal apareamiento de bases en zonas se
secuencia repetida durante la replicacin.
Genes de contingencia: genes con variaciones en secuencias repetidas
simples de uno hasta cinco nucletidos.
Casi exclusivos de patgenos de mucosas con genomas relativamente
pequeos
Generalmente asociados con sntesis de estructuras de la superficie
celular o con genes del sistema de restriccin/modificacin del DNA
Tracts homopolimricos: unidades repetitivas de un nucletido.
Mecanismo alternativo de variacin antignica es la duplicacin de
genes.

Consecuencia:

La alteracin de la longitud de estas zonas inmediatamente antes de

secuencias codificantes puede situar a los genes fuera de fase y afectar a
su expresin
Se producen cambios fenotpicos en bacterias individuales dentro de una
poblacin en crecimiento clonal.
Escape de los mecanismos de defensa inmunitaria del hospedador

Variacin de
fase/Variacin antignica:

H. influenzae:

H. Pylori:

Presenta veintisiete genes de contingencia potenciales.

Dos de ellos son genes para la a-3-fucosiltranferasa, enzima
responsable de la expresin variable de los antgenos de
superficie Lewis X y Lewis Y.

N. Meningitidis:

Una docena de genes de contingencia con tracts

homopolimricos.
Cuatro de ellos implicados en la sntesis de lipopolisacridos
Cuatro implicados en la captacin de hierro.

Serotipo B lnea MC58: 65 genes de contingencia potenciales.

La mayora de ellos implicados en procesos de interaccin con el
hospedador (protenas de membrana, pili, lipopolisacridos,
cpsulas)
Serotipo A lnea Z2491: Contiene cientos de elementos
repetidos, desde cortos tracts homopolimricos hasta
duplicaciones completas de genes. Extrema fluidez genmica

C. Jejuni:

25 genes de contingencia agrupados en tres zonas del genoma

donde se localizan los genes responsables de la sntesis de
lipopolisacridos (LOS), de la sntesis de la cpsula y de la
sntesis del flagelo.
Ejemplo: sntesis de la -1,3 galactosiltransfereasa responsable
de la sntesis del ganglisido GM1

Objetivos de agentes microbianos y vacunas

Perspectivas:

- Los

anlisis de genomas completos producirn un inventario completo de los genes que

codifican cada uno de los factores de virulencia y cada uno de los agentes inmunognicos
susceptibles de ser atacados.

Vacunas de DNA:
- El DNA es un atractivo agente inmunognico: Es estable y fcil de producir.
- ELS o GI (expression library screening or genomic immunization): Inmunizar animales con
mezclas de fragmento de DNA y re-examinar los que den respuesta inmunitaria fuerte para
identificar el DNA causante.
- La disponibilidad de genomas completos permite el diseo racional de vacunas por este
mtodo. Ejemplo: Mycoplasma pulmonis.

Identificacin de antgenos de superficie:

- N. Meningitidis tipo B MC58
2158 secuencias de protenas.
570 antgenos de superficie potenciales, excluidos los genes de contingencia.
Expresin de los 570 en E. Coli. Solo 350 pudieron expresarse
Inmunizacin de ratones con los 350 expresados
85 protenas dieron una respuesta inmunognica fuerte y se evalu la respuesta bactericida de los anticuerpos in vitro.
Evaluacin de su conservacin entre serotipos mas comunes de N. meningitidis: 7 candidatos.
Los siete candidatos son antgenos de superficie cuya eficacia como vacuna est en evaluacin.

Generacin de patgenos, atenuados por ingeniera gentica, como vacunas:

Inmunizacin Gentica

Inmunizacin Genmica

Librera de expresin (EL)

Seleccin de los
antgenos ms
inmunognicos

Genmica funcional:
Localizacin de genes importantes en el
proceso patolgico
La adquisicin y el anlisis de las secuencias genmicas no
es el objetivo final, sino un punto de partida.
Las Homologas dan pistas , pero no demuestran la
funcin de los genes.
Un nmero elevado de genes existentes en los patgenos
codifican protenas de funcin desconocida.

Es preciso volver al laboratorio hmedo

Tcnicas de alto rendimiento-Genmica funcional:

Anlisis por mutagnesis.

Hibridacin de cidos nucleicos
Qumica de protenas.
Bioinformatica

Genmica funcional
1) Anlisis de la activacin de genes (Mutagnesis)

IVET: In vivo expression technology

DFI: Differential fluorescence induction
STM: Signature -tagged mutagenesis
GAMBIT: Genomic analysis and mapping by in vitro
transposition

2) Anlisis de Transcriptomas
DNA chips o micro-arrays
SAGE: Serial analysis of gene expression
DD:Differential display

3) Anlisis de Proteomas
2D PAGE
Espectrometra de masas
Protein micro-arrays

Genmica funcional:
Localizacin de genes importantes en el
proceso patolgico
Principio bsico
El grupo de genes que expresa un organismo
patgeno en su reservorio ambiental difiere
sustancialmente del grupo de genes que expresa
durante su etapa patgena.
Resulta probable que algunos genes inducidos in vivo (en
el hospedador) jueguen un papel crtico en el proceso
patognico.
Es posible disear tcnicas de captura de dichos genes?

IVET
In Vivo Expression Technology

Tecnologas de expresin in vivo

IVET

Mtodo de seleccin positiva:

Sistema de seleccin de promotores de genes activados

durante el proceso infectivo y que estn poco o nada activos
en el periodo no infectivo

Proceso:
1.
Dos genes marcadores situados en tandem se fusionan
aleatoriamente con fragmentos del genoma del
microorganismo a estudiar generando una librera de
fragmentos genmicos
2.
Se transforman las cepas a estudiar con la librera de
fragmentos genmicos.
3.

Se infecta al animal y se extraen las clulas supervivientes.

Principio:
El primer gen del tandem permita la supervivencia in vivo si es
expresado.
El segundo gen del tandem (lacZY) permite distinguir las cepas
que se expresan in vitro: Color azul.
Interesan los clones supervivientes que no se expresan in vitro:
Colonias blancas extradas del animal infectado.
Genes testigo:
purA, seleccin auxotrfica
Genes de resistencia a antibiticos

Tecnologas de expresin in vivo

IVET

Mtodo de seleccin negativa:

Permite la deteccin de actividad de

promotores durante un perodo muy
corto de la infeccin
Principio:

Si el promotor esta activo la

resolvasa eliminar el gen de
resistencia a tetraciclina y por tanto
el microorganismo pasara de
resistente a sensible.

Se aade tetraciclina in vitro y se

buscan clulas sensibles a
tetraciclina y blancas.

Tecnologas de expresin in vivo

IVET

IVET con seleccin auxotrfica:

IVET con seleccin antibitica:

Genes testigo: purA y lacZ

Salmonella typhimurium (se utiliz una cepa pur A)

La disponibilidad de las purinas es limitante para el crecimiento de esta bacteria cuando

infecta ratones
Pseudomonas areuginosa Se identificaron loci implicados en susceptibilidad.
Genes testigo: resistencia a cloranfenicol y lacZ
Salmonella typhimurium En ratones Balb/c y en macrfagos en cultivo. Junto con la anterior
se han identificado mas de 100 genes ivi, la mitad de ellos de funcin desconocida.
Yersinia enterocoltica Se han identificado 48 genes. La mitad similares a otros conocidos,
unos pocos con funcin desconocida pero similares a otros ya descritos y 18 completamente
nuevos.

IVET con resolvasa:

Genes testigo: resolvasa y lacZ, adems las cepas estudiadas portan una resistencia a
tetraciclina.
Vibrio cholerae Identificacin de 13 genes ivi. Algunos homlogos a genes implicados en el
metabolismo de aminocidos, otros homlogos a genes de funcin desconocida o
completamente nuevos.
Staphylococcus aureus Identificados 45 genes ivi. Varios previamente conocidos. El resto
similares a genes conocidos de otras especies o nuevos.

Differential Fluorescence Induction

Mtodo de seleccin positiva:

Como gen testigo se utiliza la GFP (Green

Flourescent Protein)

Se utiliza un sistema automtico de seleccin

de clulas individuales segn su fluorescencia
FACS.

Principio:

Si el promotor est activo se sintetiza la

GFP y la bacteria fluoresce.

Se cultivan in vitro las bacterias

fluorescentes in vivo y se seleccionan
aquellas que pierden su fluorescencia en
el nuevo medio.

Salmonella thyphimurium.:

Identificados 14 genes inducidos en

macrfagos.

8 poseen homlogos en otras bacterias

con funcin conocida

6 sin homologa con otros genes u

homlogos a genes de funcin
desconocida

Differential Fluorescence Induction

Salmonella typhimurium

Genmica funcional
1) Anlisis de la activacin de genes (Mutagnesis)

IVET: In vivo expression technology

DFI: Differential fluorescence induction
STM: Signature -tagged mutagenesis
GAMBIT: Genomic analysis and mapping by in vitro
transposition

Tecnologas de expresin in vivo

IVET

IVET con seleccin auxotrfica:

IVET con seleccin antibitica:

Genes testigo: purA y lacZ

Salmonella typhimurium (se utiliz una cepa pur A)

La disponibilidad de las purinas es limitante para el crecimiento de esta bacteria cuando

infecta ratones
Pseudomonas areuginosa Se identificaron loci implicados en susceptibilidad.
Genes testigo: resistencia a cloranfenicol y lacZ
Salmonella typhimurium En ratones Balb/c y en macrfagos en cultivo. Junto con la anterior
se han identificado mas de 100 genes ivi, la mitad de ellos de funcin desconocida.
Yersinia enterocoltica Se han identificado 48 genes. La mitad similares a otros conocidos,
unos pocos con funcin desconocida pero similares a otros ya descritos y 18 completamente
nuevos.

IVET con resolvasa:

Genes testigo: resolvasa y lacZ, adems las cepas estudiadas portan una resistencia a
tetraciclina.
Vibrio cholerae Identificacin de 13 genes ivi. Algunos homlogos a genes implicados en el
metabolismo de aminocidos, otros homlogos a genes de funcin desconocida o
completamente nuevos.
Staphylococcus aureus Identificados 45 genes ivi. Varios previamente conocidos. El resto
similares a genes conocidos de otras especies o nuevos.

Signature-tagged mutagenesis

Signature-tagged mutagenesis
DNA tag (o cdigo de Barras

Signaturetagged
mutagenesis

Signature-tagged
mutagenesis

Factores limitantes de la STM

STM evala la capacidad del patgeno para

dividirse en una poblacin heterognea.
Se espera que identifique genes de virulencia no
compensables por otros patgenos virulentos del
mismo inculo.
Factores determinantes:

La complejidad del inculo.

La dosis
La ruta de administracin
La duracin de la infeccin

Desventajas de IVET y STM

IVET:

Dependen demasiado de la no expresin de genes in vitro.

Desestima los genes que deban atenuarse durante la infeccin.
Los genes ivi deben ser mutados posteriormente para demostrar su
requerimiento en la infeccin.
No detecta genes esenciales

STM:

No selecciona positivamente.
Desestima los genes que deban atenuarse durante la infeccin.
La mutagnesis puede no ser verdaderamente aleatoria.
No detecta genes esenciales.

GAMBIT
(Genomic analysis and mapping by in vitro transposition)
Principio:
Sistema de identificacin de genes esenciales para la
supervivencia del microorganismo
til en organismos cuyo genoma esta
completamente secuenciado.
Utiliza la tcnica de footprinting por PCR
Precisa de unos 130 cebadores por Mb de DNA
investigado
Sistema de seleccin negativo

Aplicacin prctica
Haemophilus influenzae. En crecimiento in vivo y
en infecciones en animales (ratn)
Streptococcus pneumoniae. En crecimiento in vitro

GAMBIT

(Genomic analysis and mapping by in vitro transposition)

GAMBIT

(Genomic analysis and mapping by in vitro transposition)