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Licenciatura em Bioqumica

Biologia Molecular
Ano 2013/2014

Microarrays
Docente Luka Clarke
Ana Rita Janela n 43232

Ana Isabel Gouveia n 44356

Microarrays
A scientific revolution made possible by
technological revolution Richard S. Schifreen

Tpicos
Uma breve histria

Caractersticas dos microarrays


Como funciona um microarray
Aplicaes: caracterizao do transcriptoma, deteco de mutaes e SPNs
Design Experimental
Anlise e apresentao de dados
Recursos bioinformticas

Uma breve histria


1953 Watson e Crick propem o modelo da dupla hlice de DNA
1960 Por emparelhamento de bases, formam-se molculas hibridas DNA/RNA

1977 A tcnica de Southern Blot aplicada na anlise de DNA


1990 O Human Genome Project fundado
Inicio de 90s Sequencia de DNA forma fixadas a membranas e marcadas radioactivamente.
Meados de 90s Desenvolvimento das tcnicas de marcao com fluorescncia.
1995 Schena e colegas desenvolveram um mtodo de fixao de cadeias de DNA em lminas
de vidro.
1995 Patrick Brown publica um dos primeiros artigos sobre DNA Microarrays.
1996: Comercializao de microarrays pela Affymetrix
2004: Todo o genoma humano analisado num microarray.

Caractersticas dos Microarray


Ferramenta
genmica.

para

investigao

Permite a anlise global da expresso


gnica
em
vrias
condies
experimentais.
Sistemas robotizados e tcnicas de
fluorescncia permitiram a evoluo dos
microarrays.

Figure 1 PubMed references found with keyword searches of the title and abstract fields. Red: (DNA microarray) or
(DNA chip) or (expression array). Green: (microarray or chip) and (sequencing or resequencing or genotype).
After 1996 the first search was modified by dropping the DNA in DNA microarray. Before 1996 the second
group in the second search was expanded with or genome to catch two early references. The expression
profiling application quickly became dominant.

Caractersticas dos Microarrays


So um conjunto de molculas de DNA de
cadeia simples(ssDNA) imobilizadas em
locais especficos da superfcie slida, s
quais as molculas de interesse se vo
ligar por complementaridade qumica.
Componentes:

Sondas
Alvos
Spots

Caractersticas dos Microarrays


O seu funcionamente baseia-se na
capacidade de os cidos nucleicos
hibridizarem, isto , a ligao entre
cadeias nucleotdicas ocorre por
emparalhemento das bases. A adenina
emparelha com a timina(DNA) ou
uracilo(RNA) e a guanina emparelha
com a citosina.

Caractersticas dos Microarrays

Paralelismo
Miniaturizao
Multiplexing
Automatizao

Caractersticas dos Microarrays


Os alvos que hibridam emitem fluorescncia, enquanto os que no
hibridam no emitem.

Caractersticas dos Microarrays


Tipo de Material
Imobilizado

Desenho do Array

Fabricao

Suporte

Impresso

Aplicao

Caractersticas

1)
2)
3)
4)

Oligonucltidos
cDNAs
Protenas
Tecidos

1) Industrializado
2) Personalizados

1) Densidade
de
integrao

1) Poroso/no
covalente
2) No
poroso/coval
ente

1) Produo
da sonda

1) Sequenciao
2) Verificao
de alteraes
na expresso
gentica
3) Quantificao
da expresso
gnica

Nome

1)
2)
3)
4)

Gene chips
cDNA array
Protein chip
Tissue chip

1) Cassettes
2) Arrayers

1) Baixa
Densidade
2) Alta
Densidade

1) Membranas
de nylon
2) Lminas de
silica

1) In situ
2) Depositada
s

1) Chips de
hibridizao
2) Chips de
sequenciao
3) Chips de
expresso

Tipos de Microarrays
Microarrays de DNA
Spotted

Microarrays de Protenas
Microarrays de Anticorpos

Oligonucletidos

Microarrays de Tecidos

Spotted Arrays
Sondas
cDNA microarrays (at 5000 bp)
Oligonucletidos longos (20 -100 bp)
Arrays comerciais:
So fabricados pela Agilent
Usam inkjet para depositar o cDNA ou os oligonucletidos
Arrays manufacturados medida:
Deposio atravs de robots
Pins depositam as sondas por aco de capilares

Tipos de Sondas
cDNA ou produtos de PCR
Sntese In Vitro
Microarray Spotter

Oligonucletidos
Sntese In Situ
InkJet Printing (Agilent)
Fotolitografia (Affymetrix)
Sntese Electroqumica (CombiMatrix)

Sondas de cDNA
Patrick Brown desenvolveu os primeiros
microarrays usando este tipo de sonda.

Tm entre 500 a 5000 nucletidos.


So sintetizadas a partir do RNA de uma clula
por reao com a transcriptase reversa.

So fixas s lminas usando spotter de


microarrays.

Sondas de Oligonucletidos
Desenvolvida por Stephen e colegas em 1991.
So sintetizadas directamente na lmina do microarray
Podem ser sintetizadas por vrios mtodos:
Fotolitografia
InkJet printing
Sntese Electroqumica
Bubble Jet

Podem ser de baixa ou alta densidade


So sondas de tamanho varivel: 20-100bp

Fotolitografia
Patenteada pela Affymetrix.
Origina os GeneChip.
Tcnica de alta densidade.

Os spots tm 8 micrmetros de dimetro


(6,25x inferior ao dimetro de um fio de
cabelo).
necessrio conhecer a sequncia do
gene que origina a sonda.
As sondas tm cerca de 16-25 nucletidos.
No uma tcnica muito especifica,
recorre ao PerfectMach e MissMatch.

Fotolitografia
A lmina est revestida com uma
superfcie fotossensvel fazendo uso
de grupos protectores sensveis luz
Manipulao da luz para direcionar
a sntese qumica das sondas

Os nucletidos ligam-se aos locais


que foram iluminados.
O processo repetido at as sondas
estarem sintetizados.

A sntese ocorre de 5 para 3.

Sntese Electroqumica
Patenteada pela CombiMatrix
Produz os CombiSNP Array
Cada microeltrodo gera
selectivamente reagentes qumicos.
A sonda construida num chip
semiconductor atravs de um software.
Os spots tm 10-20 m de dimetro.

As sondas podem ter mais de 60


nucletidos.
uma tcnica especifica.

Sntese Electroqumica
um processo controlado por computador.
As reaces redox produzem ies e radicais.
Estes alcanam o Chip de DNA, e removem o
grupo protector da superfcie do chip.

Os novos nucletidos ligam-se apenas aos grupos


desprotegidos.
A restante sntese ocorre pela qumica de
fosforamidite.

InkJet Printing
Patenteada pela Agilent.
A densidade do array depende da
experiencia.

Spots com 15 micrmetros de dimetro.


necessrio conhecer a sequncia do
gene que origina a sonda.
Sondas com 60 nucletidos de
comprimento.
Tcnica de especificidade idntica
tcnica usando cDNA.

InkJet Printing
A lmina revestida por uma superfcie
hidrfoba, tendo terminais OH expostos.
So sintetizadas base a base atravs da
sntese qumica de fosforamidite.

Os nucletidos so depositados nos


spots por um robot controlado por um
computador.
A sntese ocorre de 5 para 3.

Comparao entre Sondas


Microarray de cDNA

Microarray de Oligonucletidos
Vantagens

Baixos custos
No necessita de equipamento especifico
Maior sensibilidade de deteco
Maior especificidade

Reproductibilidade
As sondas so sintetizadas directamente na
lmina no h necessidade de tratamento
prvio de amostras de DNA
No ocorre hibridizao cruzada

Desvantagens
Necessita de isolamento e purificao
prvias
Hibridizao cruzada (Cross-hybridization)

Os genes tm de estar sequenciados priori


Pouca sensibilidade
Especificidade varivel
Elevados custos de sntese

Comparao

Aplicaes dos Microarrays

Os Microarrays tm inmeras aplicabilidades:


Anlise expresso gnica
Caracterizao do Transcriptoma
Deteo e caracterizao de SNP
Deteo mutaes

Caracterizao do Transcriptoma
O transcriptoma o conjunto de todas as molculas de mRNA (ou
transcriptos) de uma clula dadascondies especificas.
possvel analisar a expresso dos genes numa dada condio fazendo
a anlise do transcriptoma.
Neste caso, as sondas so cpias de todos os genes da clula do
organismo em estudo.
Os alvos so as molculas de cDNA resultantes dos transcriptos.

Deteco de SNPs e de Mutaes


SNPs (Single nucleotide polymorphisms) so substituies de uma base
por outra que ocorrem apenas num nucletido.
H mais de 50 milhes no genoma humano.

Geralmente, no tm efeitos na clula.


No entanto, podem levar ao desenvolvimento
de doenas.
O HapMap um projecto que pretende
identificar SNPs nos humanos, teve inicio em
2003.

Deteo de SNPs e Mutaes

Nestas experincias as sondas so especificas para cada SNP.


Uso da tecnologia do GeneChip da Affymetrix para a deteco de SNPs.
Os microarrays so uma ferramenta para a rpida deteco de SNPs e
determinao da sua relevncia para certas doenas.

Design Experimental

Passos tpicos numa experincia:


1. Preparao e marcao da amostra
2. Hibridizao
3. Lavagem
4. Recolha das imagens e anlise dos dados

Design Experimental

Anlise e apresentao dos dados


Os microarrays so analisados com scanners de
microarrays.
Estes excitam a superfcie do microarray
hibridizado, e os alvos emitem fluorescncia. Esta
medida por CDC (Charge couple device).
Existem vrios scanners disponveis:
SureScan Microarray Scanner da Agilent
GenePix Microarray Scanner da GenePix
SpotLight CCD Microarray Scanners da Arrayit

Anlise e apresentao dos dados


Para analisar os dados de microarray necessrio:

a) identificar os sub-array (poro menor do array, que o divide


em n partes iguais)

Anlise e apresentao dos dados


b) Determinao da rea do spot a ser analisada:

c) Obteno de dados estatsticos e atribuio da intensidade do spot

Anlise e apresentao dos dados


Normalizao dos dados
Processo de eliminar variaes que permitam a comparao
apropriada de dados obtidos de duas amostras diferentes.

1 Passo escolher o gene-set; calcula-se um factor de


normalizao.
2 Passo filtrar os dados de baixa intensidade, aps
transformao com o factor de normalizao.

Anlise e apresentao dos dados


Os dados so apresentados sob a forma de uma matriz Matriz de
Expresso Gnica

Anlise e apresentao dos dados


As anlises de microarray tem
como objectivo o agrupamento
dos genes com perfis de
expresso semelhantes
Clustering.

Este pode ser hierrquico ou no


hierrquico.

Recursos Bioinformticas
Anlise, armazenamento e
processamento de
sequncias biolgicas em
grande escala
Organizao e manuseamento
das bases de dados biolgicas
Novas Tecnologias
Biologia Molecular

Grandes
quantidades de
informao para
processar

Modelao e simulao de
processos biolgicos
Resoluo de problemas de
Optimizao
Extrao de informao til a
partir das sequncias biolgicas

Bibliografia

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/

http://www.bio.davidson.edu/genomics/chip/chip.html

http://grf.lshtm.ac.uk/microarrayoverview.htm

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechMicroarray.shtml

http://www.nature.com/jid/journal/v133/n4/full/jid201364a.html

www.affymetrix.com

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/

Heller, M.J. (2002) DNA Microarrays Techonology: Devices, Systems and Applications. Annu. Ver. Biomed. Eng. 4:129153

Brown, P.O, Botstein, D. (1999) Exploring the new world of the genome with DNA Microarrays; Nature

Badu, M.M; An Introduction to Microarry Data Analysis

Ehrencreich, A. (2006) DNA Microarrays for the microbiologists: an overview; Appl. Microbiol Biotechnol; Vol: 73: 255273

Egeland, R.D., Southern E.M. (2005) Electrochemically directer synthesis of oligonucleotides for DNA microarray
fabrication; Nucleic Acids Research, Oxford Journals, Vol:33