TCNICAS PARA LA

OBTENCIN DE
PLANTAS
TRANSGNICAS
Manuel Contreras
Diego Mata

Dela Verastegui.

 Es posible utilizar tcnicas genticas in vitro para modificar un DNA

vegetal, y luego, transformar las clulas vegetales con DNA libre mediante
electroporacin o por el mtodo del disparador de partculas, o bien,
utilizando vectores procedentes de la bacteria Agrobacterium tumefaciens.

TRANSFERENCIA GENTICA
CON AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS
A. tumefaciens es una bacteria, Gram negativa, induce la formacin de

tumores en plantas, denominados agalla de la corona, generalmente en la

unin del tallo con la raz. Esta bacteria del suelo infecta a dicotiledneas
como parte de su ciclo vital insertando genes forneos en las mismas y
consiguiendo que se expresen en forma de protenas.

 En 1947, Armin C. Braun del instituto Rokefeller de Investigacin Mdica,

logr cultivar tejido de la agalla libre de bacteria, pudiendo observar como

los tumores crecan in vitro en un medio bsico carente de auxinas y
citoquininas (hormonas necesarias para el crecimiento de clulas vegetales
normales). Braun concluy que la bacteria introduca en las clulas un
principio tumorgeno.

 En 1965, Menagu y Morel del instituto de investigaciones agronmicas de

Versalles, observaron que las clulas tumorgenas podan sintetizar una

serie de derivados de intermediarios metablicos de la mayora de los
aminocidos, cetocidos y azcares. Denominaron a estas sustancias
qumicas opinas.

 En 1974 Jeff Schell, Marc Van Montangu y sus colaboradores de la

Universidad de Gante, encontraron plsmidos muy desarrollados en las

cepas virulentas y observaron que eran transferidos desde estas, a cepas
no virulentas por conjugacin.

 Luego el principio tumorgeno del que hablaba Braun, responsable de la

formacin de la agalla de la corona, era la transferencia de un fragmento

de DNA llamado T-DNA que a su vez se localizaba en un plsmido al que se
denomin Ti (inductor de tumores). Tras la transferencia el T-DNA se
integraba en el genoma nuclear de la planta y su expresin induca el
fenotipo tumoral.

Figura : Plmido Ti. El T-DNA est definido por los bordes

derecho e izquierdo e incluye los genes para la
biosntesis de auxina, citoquinina y opina; estos genes son
transcritos y traducidos slo en las clulas de la planta.
Fuera de la regin del T-DNA, hay un cluster de genes vir, un
gen que codifica para un enzima(s) del catabolismo de
la opina, y un origen de replicacin (ori) que permite que el
plsmido sea mantenido de forma estable en A.
tumefaciens

 Se demostr despus que el plsmido tena varias funciones: la funcin de

virulencia (Vir), responsable de la transferencia del ADN-T, la oncgena

(Onc), responsable del tumor (consecuencia de la sntesis de auxina y
citoquinina), la funcin que especifica la sntesis de opinas (Ops),
molculas que sirven de alimento a la propia bacteria, y la funcin
catablica (Opc, opina catabolismo).

 En realidad se encontraron varios segmentos Opc1, Opc2, que permiten la

degradacin de las opinas producidas por el tumor. Se ha de distinguir dos

tipos de funciones: las funciones situadas fuera del segmento ADN-T (Vir,
Opc1,Opc2) que se expresan en la bacteria y las funciones controladas por
el segmento ADN-T (Onc, Ops) que se expresan en la clula vegetal
despus de la transferencia de este segmento.

Plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens

ORIGEN DE REPLICACIN
El ori permite que el plsmido Ti sea mantenido de forma estable en A

tumefaciens.

Existen varios elementos genticos necesarios para la transferencia del T-

DNA a la planta, estas regiones crticas estn presentes en todos los

plsmidos de Agrobacterium, aunque su estructura y organizacin son muy
distintas segn la especie y la variedad: Bordes flanqueantes del T-DNA
(izquierdo y derecho), Genes vir.

GENES VIR
Genes de virulencia o regin vir codificada por el plsmido Ti en una regin

de 35 kb localizada fuera del T-DNA, existen 25 genes vir reunidos en 7

operones. La interaccin entre los genes vir y las secuencias de los bordes
inician el proceso de transferencia.

Para que este proceso de transferencia tenga lugar es necesario que

adems de practicarle una herida a la planta esta sintetice una serie de

compuestos que induzcan la expresin de los genes vir.

Stachel, trabajando con Nicotiana tabacum identific un grupo de

compuestos que inducan la expresin de los genes vir al aadir

Agrobacteriuum a exudados de heridas practicadasen esa planta. Una de
las sustancias ms activas identificadas fue la acetosiringona, adems es
necesario una serie condiciones para que la transferencia tenga lugar:
medios pobres en azcares, de bajo pH y con niveles bajos de fosfato.

 Vir A y vir G son dos genes reguladores necesarios para la activacin

transcripcional de los operones vir, mientras que estos dos genes son
expresados constitutivamente, los dems genes vir permanecen
silenciados en ausencia de ciertos factores, producidos por la planta, que
activan su sntesis.

Vir G, en base a la homologa de su secuencia de aminocidos, fue incluido

en una clase de genes reguladores positivos inducidos por factores

externos

Vir A , pertenece a un segundo grupo de genes que dirige la activacin de

protenas reguladoras positivas de la expresin gnica. Se localizan en la

membrana de Agrobacterium.

 La induccin de los genes vir de Agrobacterium implica que el sistema de

reconocimiento de la bacteria detecte los compuestos fenlicos producidos

por la planta y transmita la informacin al interior de la clula bacteiana.
Este proceso es mediado por el producto de los genes vir A y vir G.

El dominio periplsmico de la protena Vir A detecta el pH externo y la

presencia de inductores.

 Los inductores como la glucosa son reconocidos por Vir A. En el caso de la

induccin por azcares, es necesario el producto del gen chv E, localizado

en el cromosoma bacteriano, y que codifica para una protena de unin
periplsmica. La seal percibida por Vir A provoca su autofosforilacin en
un residuo de histidina especfico y esta es transmitida posteriormente a
Vir G por la fosforilacin del cido asprtico 52 del dominio receptor de
este. La unin de la protena citoplasmtica Vir G a las llamadas cajas vir
en las regiones promotoras de los operones vir provoca la activacin de la
trascripcin de forma eventual.

 Una vez se ha producido el reconocimiento y la unin a la clula vegetal

susceptible, el siguiente paso en la transformacin es la produccin de un

T-DNA intermediario denominado hebra T. La bacteria produce una copia
lineal de cadena sencilla a partir del T-DNA.

VirD1 y VirD2 reconocen las repeticiones directas de los bordes del T-DNA y

producen dos cortes entre el tercer y cuarto nucletido final de cada

secuencia repetitiva de los bordes. Estos dos cortes marcan los sitios de
inicio y terminacin de la formacin de la hebra T.

 VirD1 acta como una topoisomerasa relajando la doble hlice. Tras el

corte VirD2 permanece covalentemente unida al extremo 5 final de la

hebra T mediante un residuo de tirosina, de esta forma protege a la hebra
T de la accin de exonucleasas.

VirD2 acta como protena piloto impidiendo la deleccin de este extremo

que es imprescindible para la transferencia ya que su deleccin abole la

transferencia mientras que si se delecciona el borde izquierdo solo
disminuye la eficacia del proceso.

 Una vez producida la hebra T , es necesario que esta sea transportada a

travs de la membrana bacteriana, diversos estudios demuestran que los

productos del opern vir B estn implicados en este proceso

Aunque todo el DNA localizado entre los bordes derecho e izquierdo es

transferido la planta, en ocasiones, tambin se transfieren secuencias que

no estn entre los mismos.

BORDES DERECHO E
IZQUIERDO
Una vez trasladado el T-DNA a la planta este debe insertarse en el genoma

y para ello son necesarias las unidades de repeticin de 25pb presentes en

el borde derecho:

Derecho: 5-TGNCAGGATATATNNNNNNGTNANN 3
Izquierdo: 5-TGGAGGATATATNNNNNTGTAAANN 3
Durante la insercin del T-DNA en el DNA cromosmico de la planta, ste a

menudo experimenta cortas delecciones debido al proceso de empalme

entre ambos DNA. La insercin del T-DNA es aleatoria mientras que los
bordes presentan cierta homologa con aquellos lugares del DNA de la
planta en los que se insertan.

TRANSFORMACIN
BIOLSTICA
Se trata de disparar bolitas de oro que llevan fragmentos de ADN

adheridos, con una especie de pistola, sobre una poblacin de clulas. Las
bolitas que queden en el citoplasma pueden trasnferir el ADN que
transportan a algn cromosoma de la clula bombardeada.

Microcan con partculas metlicas rodeadas de ADN

 Sanford, bilogo molecular de la Universidad de Cornell (EEUU) a

principios de los aos ochenta estaba buscando el mtodo definitivo para

transformar cualquier tipo de plantas. En 1984 estableci contacto con E.
Wolf director del centro de fabricacin de micropartculas de su misma
universidad. Entre ambos surgi la idea de bombardear clulas vegetales
con ADN y como ste es una molcula flexible y frgil decidieron
enganchar ADN a micropartculas metlicas. En presencia de cloruro de
calcio y espermidina el ADN queda adherido a las micropartculas metlicas
por interacciones no covalentes. Las partculas se proyectan sobre el tejido
vegetal por el impulso de un chorro de aire comprimido o la explosin de
una carga de plvora. Una vez dentro del tejido vegetal el ADN se
desprende de las micropartculas debido a las modificaciones del entorno
inico.

 Cuando la cantidad de partculas en una clula era superior a once haba

pocas probabilidades de que la clula sobreviviera. Se pens que el

tungsteno podra ser ligeramente txico y por este motivo se emplearon
posteriormente micropartculas de oro. Una vez probada la penetracin de
ADN quedaba por demostrar la transferencia gentica. Adhirieron a las
micropartculas metlicas de ARN del genoma del virus del mosaico del
tabaco. Tres das despus del bombardeo de clulas de cebolla se
observaron partculas vricas, lo que demostraba que el material gentico
introducido segua siendo funcional.

REFERENCIAS
http://

www.uned.es/experto-biotecnologia-alimentos/TrabajosSelecc/TrinidadSanc
hez.pdf
http://
porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1&
note=18
http://
ciencia-en-red.uncachodeciencia.org/biologia/Transformacion%20de%20
celulas%20vegetales%20obtencion%20de%20plantas%20transgenicas.pdf
Madigan , M. T., Parker J., Madigan M. T. and Martinko, J. M.. Brock Biologa
de los Microorganismos. Dcima edicin. Pearson Prentice-Hall. Madrid,
Espaa. 2004.ISBN:84-205-36792.