Sunteți pe pagina 1din 47

CERCETAREA

MEDICALA IN
EPOCA
GENOMICII
SI
PROTEOMICI
I

GENOMICA

Genomica este stiinta care se ocupa cu studiul genomului organismelor.


Genomul este intreaga informatie ereditara a unui organism. Este codificata fie in
ADN fie in ARN pentru unele tipuri de virusuri. Genomul include atat genele cat si
secventele non codificatoare ale ADN-ului
In timp ce genomica ofera oportunitatea de a corela raspunsul unui organism cu
factorii stresanti din mediul (din punct de vedere al modificarii expresiei genelor),
intelegerea efectului unor astfel de evenimente asupra organismului uman este
departe de a fi indeplinita.
Acest domeniu include eforturi intensive de a determina intreaga secventa a ADNului organismelor si mapping-ul genetic in detaliu.

Human Genome Project


2001, initierea Human Genome Project
2007 a fost declarata incheiata secventierea genomului uman estimata la
aprox 20.000-25.000 gene. (cu mai putin de o eroare la 20,000 baze).
Afisarea rezultatelor proiectului necesita resurse bioinformatice
semnificative.
Secventa genomului uman poate fi explorata utilizand:
NCBI Human Genome Sequencing Progress
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human/
University of California (Santa Cruz) http://genome.ucsc.edu/ UCSC
Genome Browser
Ensembl Genome Browser (Wellcome Trust Sanger Institute & EMBLEuropean Bioinformatics Institute http://www.ensembl.org/
EMBL-Bank (European Molecular Biology Laboratory's Nucleotide
Sequence Database) http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html
.

Human Genome Project

GENETICA

Investigarea rolului si functiei unei singure gene este scopul


principal al biologiei moleculare sau geneticii si este un subiect
comun al cercetarii medicale si biologice moderne.

Cercetarea unei singure gene nu intra in cadrul definitiei genomicii,


cu exceptia cazului in care scopul analizei acestei informatii
genetice si functionale este de a elucida efectul si locul sau in cadrul
intregii retele a genomului.

Biologia moleculara se ocupa cu intelegerea interactiunilor dintre


diferite sisteme ale celulei (inclusiv interactiunile dintre AND, ARN si
biosinteza proteinelor) si deasemenea cu intelegerea modului in
care aceste interactiuni sunt reglate.

Tehnici de biologie
moleculara
Izolarea ADN
Verificarea puritatii si determinarea cantitatii de ADN
Reactia de polimerizare in lant (Polymerase chain
reaction - PCR)
Electroforeza in gel
Secventierea
Clonarea moleculara si Expresia genelor
Tehnici bazate pe hibridizarea acizilor nucleici:
PCR
Northern Blot
Southern Blot
FISH
Microarray

IZOLAREA ADN
Etape ale izolarii i purificarii AND-ului genomic:
1. Obinerea sedimentului celular.
2. Distrugerea peretelui celular: distrugerea peretelui celular se realizeaza
prin tratament cu lizozim.
3. Liza peretelui nuclear.
4. Deproteinizare enzimatic.
5. Precipitarea proteinelor cu soluie salin: proteinele/peptidele sunt
precipitate cu soluie KCl.
6. Precipitarea acizilor nucleici: precipitarea acizilor nucleici se realizeaza cu
alcool izopropilic
7. Indeprtarea moleculelor de ARN din extract: In marea majoritate a
experimentelor, n vederea ndeprtrii moleculelor ARN din extract se
efectueaza i tratament cu RNaz A
8. Este necesar i parcurgerea unei etape de splare a sedimentului ADN
cu etanol 70% rece.
9. Resuspendarea sedimentului ADN: Sedimentul ADN este uscat 20 min
apoi resuspendat n TE.

VERIFICAREA PURITII SI
DETERMINAREA CONCENTRATIEI ADN
PRIN ANALIZE SPECTROFOTOMETRICE

Extractele ADN sunt scanate n registrul de lungimi de und cuprins ntre 200 nm i
350 nm. Acest registru a fost ales avnd n vedere urmtoarele :
- faptul c moleculele de ADN (att d.c., ct i m.c.) prezint absorban maxim la
lungimi de und ce variaz ntre 257 i 260 nm (cel mai frecvent, ADN de origine
bacterian prezint peak-ul specific la = 258 nm);
- absorbana maxim pentru proteinele rmase eventual n extract este la =280 nm;;
- unele polizaharide absorb radiaiile luminoase cu = 230 nm;
- absorbana la 220 nm este dat de oligonucleotide ce reprezint de obicei molecule
de ADN fragmentat artificial n timpul tehnicilor de extracie i purificare.
Gradul de contaminare proteic a probelor a fost determinat cu ajutorul raportului
A260/A280 ; valoarea optim a acestui raport este cuprins ntre 1.7 i 2.0, valori mai
mici de 1.7 indicnd o contaminare proteic semnificativ; valori mai mari de 2.0
sunt, de obicei, corelate cu contaminarea probelor de ADN cu ARN.
Determinarea concentraiei ADN-ului din probe se face prin analize
spectrofotometrice, folosind relaia :
A260 = 1 corespunde la o concentraie de 50 g ADN d.c. / ml

TEHNOLOGIA PCR

Reacia PCR (Polymerase Chain Reaction = Reacie de Polimerizare n


Lan) este o metod de amplificare enzimatic in vitro a unei anumite
secvene de ADN.
Pe scurt, tehnica PCR permite ca o singura copie a unei secvente de ADN
sa fie copiata de milioane de ori sau chiar sa fie modificata pe parcursul
amplificarii (atunci cand este dorit acest lucru: ex. Introducerea unei mutatii).

Din punct de vedere chimic, reacia PCR este constituit din cicluri succesive
de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizeaz
cu cele 2 catene ale secvenei originale (folosit ca matri n replicare).
Diferena esenial ntre o asemenea reacie de replicare i un proces de
replicare ADN in vivo, l reprezint faptul c n reacia PCR etapa de
desfacere a dublului helix matri i, respectiv, cea de ataare a primerilor, nu
sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte de temperatur, iar
singura enzim folosit n reacie este o ADN polimeraz ADN-dependent
(cu funcie de replicaz).
Principalele 3 etape ale unei reacii PCR pot fi sintetizate astfel :

TIPURI DE PCR

Revers PCR (utilizat pentru amplificarea ARN): denaturarea structurilor


secundare ale moleculelor ARN, ataare un primer complementar capului 3 al
moleculei ARN i are loc sinteza primei catene de ADNc. In aceast reacie se
folosete o ADN polimeraz ARN-dependent (revers-transcriptaz), Hibridul
ARN:ADN obinut n aceast reacie de revers-transcriere este supus unei
reacii de distrugere a catenei ARN cu RNaza H, dup care la catena ADN
rmas este ataat un primer complementar cu capul 3 al acesteia. Dup
sinteza celei de-a doua catene ADN, moleculele sunt introduse ntr-o reacie
PCR obinuit.

MS PCR (Mutation Specific PCR): n experimentele de mutagenez situsspecific, modificrile dorite pot fi introduse n ampliconi pe calea primerilor, fie
c este vorba de inserii sau de deleii.

Obinerea de sonde ADN/ARN marcate Foarte multe tehnici de obinere de


sonde ADN/ARN folosesc variante de reacii PCR. Astfel, ntr-o variant, se
folosesc primeri marcai (n sistem radioactiv sau neradioactiv de marcare) i
dNTP nemarcate. Ampliconii obinui ntr-o asemenea reacie sunt molecule
dublu-catenare marcate la capete (primerii unei reacii PCR intr n structura
produilor de reacie).

TIPURI DE PCR

Real Time PCR (PCR cantitativ),


Real Time PCR este o metoda diferita
fata de RT-PCR (reverse transcriptase
PCR).
Real Time PCR este o metoda care
include atat amplificarea fragmentului
ADN in timp real cat si analiza acestuia.
Se folosesc cantitati foarte mici de
proba. Se pot amplifica atat probe ADN
cat si probe ADNc cu aceeasi viteza si
eficienta
Un numar mult mai mare de probe de
concentratii diferite pot fi analizate in
acelasi timp.
Amplificarea fragmentului ADN se poate
vizualiza cu ajutorul moleculei reporter
pe tot parcursul reactiei, nu la sfarsit.

Aplicatii Real-Time PCR

Real-Time PCR poate fi utilizat pentru:


Genotipare
Trisomii si detectarea numarului de gene unice din genom
Genotiparea microdeletiilor
Haplotipare
Analiza cantitativa a microsatelitilor
Diagnosticul prenatal al celulelor fetale din sangele matern
Diagnosticul cancerelor
Cuantificarea expresiei genelor
Masurarea expunerii la radiatii
Studiul ADN mitocondrial
Detectia metilarii
Detectia inactivarii cromosomului X

Electroforeza in gel
Este o tehnica utilizata pentru separarea ADN, ARN sau a proteinelor
utilizand un curent electric aplicat unei retele alcatuita dintr-un gel pe
baza de agaroza.
Este utilizata de obicei pentru analiza, dupa amplificarea ADN prin PCR.
In solutie libera, la pH neutru sau alcalin, acizii nucleici nu pot fi separati.
Pentru separarea lor se se folosesc matrici de gel de agaroza sau
poliacrilamida.
Un camp electric determina migrarea lor prin gel. Datorita numarului
mare de resturi fosfat, acizii nucleici au o puternica incarcatura negativa,
migrand in campul electric spre anod
Fragmentele se separa sub forma unor benzi electroforetice
In conditii ideale, viteza de migrare a fragmentelor este direct
proportionala cu tensiunea aplicata
Dupa ce separatia este completa, fragmentele ADN avand lungimi
diferite sunt adesea vizualizate prin legarea lor de un colorant fluorescent
precum bromura de etidiu

Electroforeza in gel
blanc

58

59.1

60.3

M50

61.4

62.5

63.5

64.5

Marimea fragmentelor este exprimata in:nucleotide, perechi de baze sau kb


-pentru o mie de perechi de baze.
-Determinarea marimii fragmentelor se face uzual prin compararea cu DNA-ladders
ce contin fragmente liniare de ADN, de lungimi cunoscute
Electroforeza acizilor nucleici este o etapa obligatorie in orice protocol de analiza
a acizilor nucleici
Prin ea se realizeaza: separarea fragmentelor ADN rezultate in urma digestiei cu
enzime de restrictie; verficarea amplificarii PCR; identificarea si/sau determinarea
semicantitativa a fragmentelor ADN rezultate in urma amplificarii PCR; detectia si
determinarea semicantitativa a ADN-ului genomic obtinut in urma extractiei din tesuturi

SECVENTIEREA
Secventializarea ADN reprezinta identificarea tipului, felului si succesiunii
nucleotidelor dintr-un fragment ADN de analizat
In momentul de fata s-au dezvoltat tehnici de secventiere automate: fie
chimic prin metoda Maxam-Gilbert, fie enzimatic prin metoda Sanger
Metoda chimica presupune marcarea ADN-ului supus secventializarii la
unul din capetele sale, denaturarea, urmata de de separarea prin
electroforeza in gel a celor doua catene
Are loc apoi taierea ADN-ului monocatenar cu obtinerea unor fragmente de
ADN cu lungime varibila ce pot fi separate electroforetic pe geluri de
poliacrilamida
Metoda enzimatica Sanger consta din replicarea ADN-ului monocatenar
incepand de la un punct precis de initiere, replicarea fiind apoi intrerupta in
functie de baza existenta in secventa de analizatde catre dideoxinucleotide

Clonarea moleculara si
Expresia genelor

ADN-ul poate fi manipulat in laborator.

Clonarea molecular se refer la procedura de izolare a unei anumite


secvene ADN i obinerea mai multor copii ale acesteia in vitro.
Clonarea este frecvent folosit pentru amplificarea secvenelor ADN ce
conin gene, dar poate fi folosit i pentru amplificarea oricrei secvene
ADN cum ar fi promotorii, secvene necodate i secvene aleatoare ale
ADN.

Enzimele de restrictie sunt o clasa speciala de enzime utilizate pentru a


taia ADN-ul la un anumit site de restrictie pe care il recunosc, avand ca
rezultat fragmente de ADN de lungimi predictibile. Utilizarea enzimelor
de restrictie permite ca fragmente de ADN din surse diferite sa fie
reconectate si astfel, prin ligarea lor, este obtinut AND-ul recombinat.
Adesea asociat cu organismele modificate genetic, ADN-ul recombinat
este utilizat in constructia vectorilor care au la baza plasmidele
(fragmente scurte de ADN circular).

Clonarea moleculara si
Expresia genelor
Vectorii de expresie sunt un tip specializat de vectori de clonare in
care semnalele pentru translatie si transcriptie necesare pentru
controlul genei de interes sunt incluse in vectorul de clonare. Aceste
semnle pot fi create artificial pentru a controla mai usor expresia
genei de interes.
Expresia genelor este o tehnica de clonare ADN care utilizeaza
vectori de clonare pentru a genera o biblioteca de clone, in care
fiecare clona exprima o proteina. Biblioteca de expresie este
analizata pentru identificarea clonei care intereseaza si aceasta este
recuperata pentru investigatii ulterioare. Un exemplu ar fi izolarea
unei gene care confera rezistenta la antibiotice.
Scop De obicei scopul final al expresiei genelor este a produce o
anumita proteina in cantitate mare.

EXPRESIA GENELOR APLICATII


Obinerea insulinei umane.
Noile tehnologii industriale de obinere a insulinei umane au fost
posibile odat cu extragerea genei insulinei (W.Gillbert i
colaboratorii si, 1980) i crearea moleculelor recombinate de ADN
n baza plasmidelor
Moleculele recombinate de ADN sunt transferate n Escherichia coli,
unde are loc realizarea informaiei genetice codificate n molecula de
ADN. Paralel cu proteinele specifice bacteriei, se sintetizeaz i
insulina. Pentru a proteja insulina uman (ea nu este proprie
colibacililor i este distrus de enzimele bacteriene), n molecula
recombinat de ADN se ncadreaz, pe lng gena insulinei, i o
gen reglatoare care codific proteine specifice colibacililor
(galactozidaza). Ca rezultat al manifestrii informaiei genetice a
moleculei recombinate de ADN, se obine o caten polipeptidic
hibrid, din care mai apoi se separ insulina.
Datorit utilizrii tehnologiei ADN-ului recombinat, se obin
aproximativ 200 grame de insulin de pe 1 m3 de mediu de cultur,
adic tot atta ct se poate extrage din aproape 1600 kg de
pancreas de bou sau porc.

EXPRESIA GENELOR
APLICATII
Obinerea somatotropinei.
Sinteza acestui hormon pe cale artificial s-a nceput cu producerea
de ADNc cu ajutorul revers-transcriptazei, avnd ca matrice ARNm
din hipofize (transcripie invers). Acesta a fost clonat, apoi tiat cu
enzime de restricie pentru obinerea secvenei nucleotidice
corespunztoare somatotropinei, cu excepia fragmentului ce
determin primii 23 de aminoacizi. Fragmentul n cauz era clonat
separat, ca rezultat al unei sinteze chimice, apoi cele dou
segmente unite, la ele se adug segmente reglatoare i pe baza
plasmidelor se obine plasmidiul recombinat cu gena HGH (a
somatotropinei). Colibacilii, primind acest plasmid recombinat,
sintetizau somatotropina (la 1 litru de mediu de cultur se obine
2,0-2,5 mg somatotropin).

TEHNICA MICROARRAY
PRINCIPII GENERALE
Tehnica ADN MICROARRAY reprezinta o tehnologie multiplex utilizata in studii
de biologie moleculara si medicina. S-a dezvoltat din metoda de analiza
SOUTHERN BLOTTING fragmente de ADN sunt atasate pe un substrat si sunt
hibridizate cu sonde marcate care reprezinta fragmente de gene sau gene
integrale
Spoturile pot fi fragmente scurte de gene SONDE utilizate la hibridizarea
ADNc TINTA, in conditii foarte bine definite
Complexele SONDA-TINTA pot fi vizualizate si cuantificate pe baza detectiei in
fluorescenta a unui fluorofor marker fluorescent atasat tintei in vederea
cuantificarii relative a abundentei acizilor nucleici existenti in proba tinta
Tehnica ADN microarray poate fi utilizata in:
Detectarea single nucleotide polymorphisms (SNPs)
Detectare ADN (studii de hibridizare genomica comparata) sau ARN (detectat
ca ADNc dupa realizarea revers transcrierii) care poate fi sau nu implicat in
traducere de proteine
Masurarea nivelului de expresie genica pe baza ADNc poarta denumirea de
ANALIZA DE EXPRESIE GENICA

Microcipurile microarray
traditionale reprezinta o
colectie de spoturi ADN
microscopice atasate de
o suprafata solida
sticla, plastic sau silicon
- BIOCIPURI

Schema experiment microarray


Etapa de hibridizare se realizeaza cu 2
probe de ADNc care urmeaza a fi comparate
(probe de tesut bolnav / tesut sanatos; celule
tratate / celule netratate) marcate cu doi
fluorofori diferiti
Markeri fluorescenti : Cy3, cu lungime de
unda de emisie 570 nm (corespunzator
spectrului cu lumina verde), si Cy5 cu
lungime de unda de emisie 670 nm
(corespunzator spectrului cu lumina rosie)
Cele doua tipuri de probe - Cy-labelled
cDNA sunt amestecate si hibridizate pe
acelasi cip microarray care va fi scanat
pentru a analiza intensitatea semnalului
fluorescent a celor doi fluorocromi
Intensitatile
relative
ale
semnalului
fluorescent a celor doi markeri pot fi
analizate ca raport in vederea identificarii
genelor cu expresie stimulata sau inhibata up-regulated sau down-regulated

PROTEOMICA

Proteomica se ocupa cu studiul la scara larga a structurii si functiei proteinelor.

Analiza de secven poate furniza mai multe date dect simpla identificare a
proteinei. Prin compararea secvenei unei proteine cu cele stocate n bazele de
date, se pot gsi informaii despre: structura, interaciile, activitatea biochimic,
evoluia i chiar rolul potenial ntr-o boal.

Structura tridimensional depinde de plierea catenei polipeptidice n spaiu care


reflect:
Lungimea secvenei (tip de aminoacizi i secven)
Structura primar
Modificri post translaionale suferite de aminoacizi

Funcia proteinei depinde de structura tridimensional pentru c aceasta


specific forma, distribuia sarcinilor si poziia unor aminoacizi cheie.

Proteinele cu secvene similare au proprieti similare. Paradigma


secven similar/ funcie similar st la baza bioinformaticii i ne permite
s se fac predicii structurale i funcionale pe baza secvenei proteice.

PROTEOMICA

Gradul de nrudire corespunde nivelului de conservare a funciei.


Dac dou secvene proteice sunt foarte similare, ar putea
reprezenta molecule omoloage care au funcii identice n specii
diferite i care au acumulat mutaii datorit speciaiei. Asemenea
proteine se numesc ortoloage (de ex. globina uman i de
oarece).

Un grad mai sczut de omologie ar putea indica faptul c


proteinele sunt omoloage dar au evoluat divergent n termeni
funcionali. Asemenea proteine se numesc paraloage i rezult din
duplicaia genelor i divergena n cadrul genomului. De ex.:
mioglobina i globina umane.

Mioglobina i globina sunt similare,


reflectnd relaiile evolutive i funcia
conservat. Au secvene cu 26% identitate i
39% similitudine.
Teoretic, mii de proteine ipotetice sunt nrudite
cu proteine cunoscute, dar secvenele lor au
devenit divergente. Structura lor poate
identifica nrudirea.
Cu alte cuvinte, n era postgenomic, datele
de baze de secven de proteine, n primul
rnd conduc la elucidarea funciei proteinelor.
n evoluie, structurile proteinelor sunt mult mai
bine conservate dect secvenele.
Scopul proteomicii structurale este de a gsi
membrii reprezentativi ai fiecrei familii de
conformaii proteice, de a descifra structura i a
furniza o matri pentru compararea acestora.
O aplicaie direct a proteomicii structurale
este proiectarea raional a medicamentelor.

Nu exist ntotdeauna o relaie direct structur-funcie. Faptul c secvene


divergente pot adopta aceeai structur este folositor pentru identificare relaiilor
evolutive aflate la distan.
Totui se pot deduce i relaii false, pentru c uneori, structuri echivalente din punct
de vedere funcional au evoluat independent.

Tehnici de determinare a structurii proteinelor:


Nu este nc posibil s se anticipeze structura teriar a unei proteine numai din datele
de secven. Tehnicile majore de studiu sunt:
Cristalografia cu raze X
Spectroscopia RMN
Pentru RMN proteinele trebuie s fie solubilizate, s fie stabile i solubile la
concentraii ridicate i s nu se agrege sau denatureze n aceste condiii.

Tehnici de determinare a functiei proteinelor:


Analiza de expresie genica
o In cazul analizei ARNm sau a profilului de exprsie genica se monitorizeaza
nivelul de expresie a mii de gene SIMULTAN in vederea studierii efectelor
anumitor tipuri de tratamente, boli sau analiza genica a diferitelor stadii de
dezvoltare a tesuturilor sau a organismelor vii
o De exemplu, pe baza analizei microaray se pot identifica genele a caror
expresie se modifica ca raspuns la actiunea unui anumit agent patogen sau alt
organism, comparand nivelul de expresie din celulele sau tesuturile infectate cu
nivelul de expresie din celulele sau tesuturile sanatoase, neinfectate.
Microarrays poate fi utilizat pentru a evalua expresia mai multor gene in acelasi
timp

oValorile nivelului de expresie genica indica cum conditiile experimentale


influenteaza nivelul de expresie ARNm a unui grup de gene
oMarcarea in verde indica un nivel redus de expresie genica
oAnaliza de CLUSTER identifica un grup de gene a caror expresie este redusa

Aplicatii practice ale


proteomicii

Scopul proteomicii structurale este de a gsi membrii reprezentativi ai fiecrei


familii de proteine, de a descifra structura, conformaia i a furniza o matri
pentru compararea acestora.

Medicina personalizata, nseamna acordarea unui tratament individualizat pentru


pacienti diferiti care au aceeasi boala. Aceasta diferentiere se bazeaza pe
particularitatile de ordin genetic, reflectate n compozitia si functionarea
proteomului, ale prezumtivului pacient.

Pe timp ce sunt descoperite diferentele genetice dintre indivizi, cercetatorii se


asteapta sa fie capabili de a utiliza aceste noi tehnologii pentru a creea
medicamente personalizate ce vor fi mult mai eficiente pentru fiecare pacient in
parte.

Exemplu: se spera sa se descopere noi medicamente care vor avea drept tinta
inactivarea proteazei HIV-1A, o enzima capabila de a cliva o proteina a virusului
imunodeficientei umane in parti mult mai mici, active. Virusul nu poate functiona
fara formele active ale acesteia: in consecinta ar fi una din cele mai eficiente
terapii impotriva HIV

Protein databases

UniProt
Protein Information Resource (PIR)
Swiss-Prot
Protein Data Bank (PDB)
National Center for Biotechnology Information (NCBI)
Human Protein Reference Database
Proteopedia The collaborative, 3D encyclopedia of proteins
and other molecules.

Telomere

In 2009 premiul Nobel pentru Fiziologie si Medicina a fost acordat


echipei alcatuite din Elizabeth Blackburn, Carol Greiger i Jack
Szostak pentru descoperirea felului n care cromozomii sunt
protejai de degradare de catre telomeri i de enzima telomeraza, n
marea parte a regnului animal i vegetal, de la amib la om.

Telomerii nu sunt altceva dect extremitile cromozomilor (n


greac, telos=sfrit, meros=parte). Sunt secvente de AND repetitiv
care se gasesc la capatul unui cromozom

Telomere
In vederea diviziunii celulare, ADN,
purttorul informaiei genetice, este copiat
cu ajutorul unui sistem replicativ n care un
rol important l are enzima ADNpolimeraza. Aceasta ns nu tie s
copieze telomerii. In consecin, s-ar
deduce c n urma fiecarei diviziuni
celulare, dimensiunile telomerilor se reduc.
Ins n cele mai multe cazuri realitatea nu
confirm. Echipa mentionata a identificat
motivul - telomeraza. Enzima ajut ADN
polimeraza s produc ADN la nivelul
telomerilor pe baza unei matrie de ARN.
Daca celulele se divid fara telomeraza,
atunci capetele cromozomilor vor disparea
si deasemenea si informatia pe care o
contin.

Telomerii scurtai sunt una dintre cauzele mbtrnirea, referindu-ne nu numai la cea
a celulelor individuale, dar a organismului ca tot unitar.
Pe de alt parte, exist boli genetice care au drept caracteristic telomeraz
deficitar, care implic sinteza unor celule incapabile de a-i ndeplini funcia.
Efectele variatiilor in vivo a lungimii telomerelor:
A fost raportat ca persoanele peste 60 ani, ale caror celule sanguine au telomere mai
scurte au rate mai mari ale mortalitatii
Telomerele mai scurte au fost asociate cu:

Cresterea de 3,2 ori a mortalitatii prin boli cardio-vasculare


Cresterea de 8,5 ori a mortalitatii prin boli infectioase
O supravietuire in urma tuturor patologiilor global scazuta
Cawthon et al, Lancet 361: 393-395, 2003

In schimb, dac activitatea telomerazei este ridicat, lungimea


telomerilor este meninut, senescena celular fiind ntrziat. Este
cazul celulelor canceroase, care sunt considerate nemuritoare.
Telomeraza este detectata in cantitate mare in 80-90% din formele de
cancer invaziv
Nivelul crescut de telomeraza promoveaza fenotipul celular nediferentiat
In plus, telomerele cromozomilor celulelor canceroase sunt mai scurte
(dovada a multiple cicluri de replicare), dar nu devin atat de scurte incat
sa induca moartea acestora
Daca se introduc mutatii in gena care codifica telomeraza si aceasta
devine inactiva:
Este inhibata RAPID cresterea celulelor canceroase
Este redus procesul de metastazare
Aceasta se produce prin:
Downregularea RAPIDA a ciclului celular si a progresiei tumorale
Downregularea metabolismului glucozei
Si (posibil) este indusa diferentierea celulara

Din acest motiv, se evalueaz n prezent compusi mpotriva


celulelor cu activitate telomerazic intens. Rezultatele obtinute
pna acum sunt promitatoare. Deja s-au obtinut o serie de compusi
care inhiba activitatea telomerazica la nivelul celulei canceroase,
nsa se pare ca dozele utilizate sunt destul de mari ceea ce ar putea
duce la posibile efecte adverse.

La om: Telomeraza este activa in timpul dezvoltarii fetale si ramane


activa in diferite celule proliferative
Celule stem cells
Limfocite, foliculii pilosi, etc

Telomeraza este downregulata, dar inca activa, in multe alte celule


de tip adult
Epiteliale
Fibroblasti
Endoteliale

CELULELE STEM

Deriva din masa celulara a blastocistului. Pot realiza numeroase diviziuni fara sa se
diferentieze. Mentin un set complet de cromozomi

Din ele se pot dezvolta celule ce deriva din toate cele trei foite embrionare. Sunt
capabile sa se integreze in toate tesuturile fetale pe parcursul dezvoltarii

Dintr-o singura celula poate rezulta o linie celulara. Pot fi determinate sa prolifereze
sau sa se diferentieze.

Le lipseste punctul de control G1. Celulele stem se gasesc de cele mai multe ori in
faza S a ciclului celular
Producerea de celule stem pluripotente umane:
Pot deriva din masa celulara a blastocistilor rezultati in urma unor tratamente de
fertilizare

Pot deriva din tesut fetal (mai intai s-au folosit celule germinale din tesut fetal de
soarece apoi au fost izolate celule germinale umane din tesut fetal de 5-9 saptamani)

Pot fi obtinute pe calea transferului nuclear in celule somatice (cazul oitei Dolly).

CELULELE STEM
Importanta celulelor stem embrionare
Descifrarea mecanismelor ce duc la diferentierea celulelor
tratarea unor boli grave cum ar fi cancerul, determinate de cresterea si
diferentierea anormala a unor celule
Testarea medicamentelor pe linii celulare
Terapia celulara tratarea unor boli
Parkinson,
Alzheimar,
boli cardiovasculare,
arsuri, diabet, osteoartrita

CELULELE STEM

Clonarea terapeutica implica indepartarea nucleului dintr-un ou


si inlocuirea lui cu nucleul subiectului cercetat.
Desi oul se dezvolta folosind ADN-ul donorului de nucleu, creste
intr-un blastocit din care rezulta celule stem embrionice cu
potential de a deveni celule utilizabile din punct de vedere
terapeutic. Celulele, dezvoltandu-se cu ADN-ul donorului, o data
implantate in corp nu vor fi atacate de donorul sistemului imun.

Intr-un studiu s-au folosit celule epiteliale din cozile a 24 de


soareci cu Parkinson pentru a crea 187 linii de celule, din care au
derivat neuroni dopaminici, acestia fiind ajustati la ADN-ul
fiecaruia. In continuare celulele ajustate au fost grefate
soarecilor cu acelasi ADN.

Un alt grup, de control, a primit celule cu ADN ce nu se potrivea


cu ADN-ul propriu. Soarecii ce au primit neuronii dopaminici
compatibili cu propriul ADN au prezentat imbunatatiri
neurologice si lipsa raspunsului imunologic in timp ce grupul de
control nu.

CELULELE STEM
Expertii au confirmat ca studiul aduce medicina cu un pas mai aproape de un
tratament eficace pentru Parkinson.
Insa este un drum lung pana la
demonstrarea eficacitatii pe
oameni, supravegherea soarecilor
analizati realizandu-se doar timp
de 11 saptamani, ceea ce nu este
indeajuns pentru a determina
daca tratamentul persista.
Fiind primul de acest tip,
cercetatorii au demonstrat ca
transferul nuclear de celule
somatice sau clonarea
terapeutica, folosind celule de la
un soarece pentru a trata acelasi
soarece, poate fi efectuata cu
succes.

CELULELE STEM
Probleme actuale de rezolvat:
Durata scurta a efectului in prezent, integrarea genei in genom este de scurta
durata, fiind necesare sedinte multiple de terapie
Controlul raspunsului imun declansat de prima sedinta de terapie,accentuat la
repetarea sedintei
Probleme speciale legate de vectorii virali efecte adverse nedorite (raspuns
inflamator, toxicitate, declansarea raspunsului imun, posibilitatea redobandirii
virulentei odata incorporat in genomul gazdei)
Bolile multigenice dificultati in identificarea tuturor genelor implicate, ale tipului
de intricare functionala; dificultati in inlocuirea tuturor regiunilor de genom
implicate

CELULELE STEM

Rezultate semnificative in prezent:

2008: UCL Institute of Ophthalmology ameliorarea vederii in urma terapiei


genice a unei forme ereditare de cecitate

2007: University of Texas si M. D. Anderson Cancer Center - un studiu pe soareci


(combinatie de terapie genica + tehnici nanotehnologice de introducere a genelor)
au indus scaderea semnificativa a volumului unor tumori pulmonare

2006: National Cancer Institute (NCI) au obtinut limfocite modificate genetic


care ataca celule tumorale de melanom malign

2005: tratata cu succes surditatea datorata distrugerii celulelor cohleare, la


hamsteri, prin introducerea unei gene care a determinat cresterea de noi celule
cohleare

Alte rezultate promitatoare deocamdata neconfirmate prin studii pe animale de


laborator sau studii clinice: tratamentul Coreei Huntington, bolii Parkinson,
talasemiei, fibrozei chistice, anumitor forme de cancer, leucemii, sicklemie
etc

CELULELE STEM