REVIEW BIOANALISIS

Indri Kusharyanti, M.Sc., Apt

BIOANALISIS
A bioanalytical method consists of two main

components:
1. Sample preparation extraction of the drug
from the biological fluid usually including a
concentration step to enhance sensitivity of
the method
2. Detection of the compound ususally
following chromatographic separation from
other components present in the biological
extract. The detector of choice is a mass
spectrometer.

Secara umum proses analisis minimal

mempunyai 5 langkah :
1. sampling (pengambilan sampel),
2. preservasi sampel (penyimpanan sampel),
3. preparasi sampel (penyiapan sampel),
4. analisis (pengukuran),
5. interpretasi data (analisis data), dan
6. pembuatan laporan analisis.

SAMPEL BIOLOGIS
DARAH
Whole Blood
Plasma
Serum

FESES

JARINGAN

LIVER

URINE

PANKREAS

SALIVA

BRAIN

SPUTUM
SPERMA
CAIRAN

SEREBROSPINAL

RAMBUT
PLACENTA

METHOD VALIDATION
Any method is valid as long as it is validated
Procedures that demonstrate that a method is
reliable and reproducible for the intended use.
Types:
Full validation: first time, new drug, or addition of
metabolites
Partial validation: modifications of a validated method
Cross-validation: comparison between methods

PRE-STUDY VALIDATION
Fundamental parameters for validation
Method used for the determination of drugs
and/or metabolites should be:

Sensitive

Selective
Accurate

Precise
Stable

Reference standard
Analysis of drugs and their metabolites in a

biological matrix is carried out using samples spiked

with calibration (reference) standards and using
quality control (QC) samples
The purity of the reference standard used to prepare

spiked samples can affect study data

For this reason, an authenticated analytical

reference standard of known identity and purity

should be used to prepare solutions of known
concentrations

Reference standard
The source and lot number, expiration date,

certificates of analyses when available, and/or

internally or externally generated evidence of
identity and purity should be furnished for each
reference standard
If possible, the reference standard should be

identical to the analyte

When this is not possible, an established chemical

form (free base or acid, salt or ester) of known purity

can be used

Reference standard
Three types of reference standards are usually

used:
(1) certified reference standards (e.g., USP

compendial standards);
(2) commercially supplied reference standards
obtained from a reputable commercial source;
(3) other materials of documented purity
custom-synthesized by an analytical laboratory
or other noncommercial establishment

Preparasi Sampel
proses yang harus dilakukan untuk

menyiapkan sampel sehingga siap untuk

dianalisis menggunakan instrumentasi yang
sesuai.

Sample preparation for DNA

Extraction

Potential interfering substances in a biological

matrix include endogenous matrix

components, metabolites, decomposition
products, and in the actual study, concomitant
medication and other exogenous xenobiotics

AnFar.S2-08

14

Deproteinisasi
Metode yang paling umum digunakan :

- Pengendapan protein sebagai garam yang

tidak larut

Protein

pH rendah ( asam kuat )

pH tinggi ( basa kuat )

muatan positif

muatan negatif

Pengaturan pH
Sampel (protein)

Sampel (protein)

pH larutan <

pH larutan >

titik isoelektrik

titik isoelektrik

protein sbg kation

protein sbg anion

bereaksi dng
anion ttt.
membentuk garam
tak larut

bereaksi dng kation

ttt. membentuk
garam
AnFar.S2-08tak larut

16

Precipitating Agents
Anionik

pikrat

molibdat
tungstat
sulfosalisila
t
metafosfat
perklorat
trikloroaset
at

Kationik
Ion-ion logam berat
spt. :
- seng
(Zn)
- merkuri (Hg)
- Kadmiu (Cd)
m
(U)
- uranium (Fe)
- besi
(Cu)
- tembag (Pb)
a
timbal

Deproteinisasi dgn dehidrasi

Bila sejumlah tertentu air

dihilangkan dari protein

Protein akan mengendap

SENTRIFUGASI
AnFar.S2-08

Deproteinisasi dgn cara

dehidrasi
Solvent

Salting out

( suhu rendah )

( protein pada
titik isoelektrik )
+

Asetonitril
Aseton
Metanol
Etanol

Garam
( Na sulfat, Na
sulfit )
Protein
mengendap

AnFar.S2-08

20

SENTRIFUGASI
Untuk menghasilkan supernatan yang jernih

dan berisi komponen yang diinginkan.

Pemisahan dilakukan berdasar sifat partikel
dalam medan gaya senrifugal.
Tingkat pemisahan biasanya:
Sel utuh dan pengotor
2. Inti sel, kloroplas, mitokondria, lisosom
3. Mikrosom, ribosom
1.

AnFar.S2-08

22

tujuannya
Concentrate analyte(s) to improve limits of detection and/or

quantitation
Exchange analyte from a non-compatible environment into one that
is compatible with chromatography and mass spectrometric and/or
other instrumental analytical techniques
Remove unwanted matrix components that may interfere with the
analysis of the desired compound
Perform selective separation of individual components from complex
mixtures, if desired
Detect toxins in human system or in environment (air, drinking
water, soil)
Identify stereochemical effects in drug activity and/or potency
Follow drug binding to proteins
Determine stability and/or absorption of drugs and follow their
metabolism in human body

Liquid-Liquid Extraction (LLE)

Partitioning of analytes between

water phase and organic phase

Kurang cocok untuk :

- sampel komplek
(sampel
biologis)
- presisinya rendah
Cocok untuk :
- water insoluble
compound
dalam water-soluble
matrix

Solid Phase Extraction (SPE)

SPE retains analyte from a flowing liquid

sample on solid sorbent, analyte is

recovered via elution from the sorbent
Phase types:
Reverse phase
Normal phase
Ion exchange
Adsorption

The Four Basic Steps of A Solid-Phase Extraction

AnFar.S2-08

27

Solid Phase Extraction (SPE)

Nonpolar:
Reverse phase C18 (octadecyl bonded

silica) and C8 (octyl bonded silica) are

most commonly used for hydrophobic
analytes
Polar:
Normal phase SPE uses cyanopropyl

bonded, diol bonded, or amino propyl

bonded silica (used for polar analytes
such as cationic compounds and organic
acids)
Electrostatic:
Ionic Exchange SPE is based on

electrostatics uses quaternary amine,

sulfonic acid, or carboxylic acid bonded silica
Adsorption type SPE uses unmodified materials such as alumina, Florosil, resins

Solid Phase Extraction (SPE)

SPE uses a cartridge or disc
May be performed a one time use syringe or a

multiple cartridge unit

Solid Phase Extraction (SPE)

uses a cartridge or disc
May be performed a one time use syringe or a multiple
cartridge unit
SPE

Various SPE Phases and Conditions

Mekn.pmsh

Tipe fase

Struktur

Tipe analit Loading solv. Eluting solv.

AnFar.S2-08

31

AnFar.S2-08

32

Solid Phase Microextraction (SPME)

A 5 step process
Advantages over L-L include: smaller volume solvent used, no emulsions,

automation results in reduced time and cost

Based on a solvent-free sorption-desorption process
SPME is a fused silica fiber coated with solid adsorbent
Organic analytes absorb to the fiber, released by heating in GC port
Combines extraction, concentration, and injection in one process

AnFar.S2-08

34

AnFar.S2-08

35

AnFar.S2-08

36

AnFar.S2-08

37

Instrumen Bioanalisis
Khromatografi

HPLC, GC, TLC

Spektroskopi
UV-Vis, Spektrofluorometri, IR, NMR, MS, AAS
Elektroforesis
Immunoassay
EIA, ELISA, Western Blot, Soutern Blot,

HPLC
Merupakan teknik pemisahan senyawa dengan

cara melewatkan senyawa melalui fase diam

(stationary phase)
Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi

dengan fase gerak (mobile phase)

Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom

atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga

akan
mempengaruhi
kekuatan
interaksi
senyawa dengan fase diam dan fase gerak
DKS-09

39

HPLC
Senyawa

yang keluar dari kolom akan

dideteksi dengan detektor yang sesuai dan
dilaporkan sebagai kromatogram

Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu

retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak

Untuk analisis kualitatif digunakan informasi

tR, sedangkan untuk analisis kuantitatif

digunakan informasi luas area/tinggi puncak
kromatogram
DKS-09

40

HPLC
Metode hplc dipilih bila akan menganalisis

senyawa dalam sampel:

- yang tercampur dengan matriks yang
sangat komplek
- dengan kadar sangat kecil
Metode hplc dipilih bila akan menganalisis

beberapa senyawa sekaligus (secara

simultan)
DKS-09

41

Normal-Phase HPLC
[ Fase diam lebih polar dibanding fase gerak ]
Senyawa polar:
- terelusi belakangan (tR panjang)
semakin non-polar fase gerak, tR senyawa
polar makin panjang
Solven:
- campuran metilen klorid, dietileter,
kloroform
Eluent strength:
DKS-09
- dimodifikasi dengan n-heksan

42

Reversed-Phase HPLC
HPLC
Reversed-Phase
[[ Fase
Fase diam
diam lebih
lebih nonpolar
nonpolar dibanding
dibanding fase
fase gerak
gerak ]]
Senyawa polar:

- terelusi lebih dahulu

Semakin polar fase gerak, senyawa nonpolar
lebih kuat tertahan
Solvent: Campuran metanol, asetonitril,

tetrahidrofuran
Eluent strength:

DKS-09

43

HPLC

DKS-09

44

wadah untuk sampel yang siap diinjeksikan

[ jumlah kecil ]
DKS-09

45

Tujuan Derivatisasi
Derivatisasi

adalah reaksi suatu senyawa

dengan pereaksi (agen) penderivat untuk
menghasilkan derivat (turunan) senyawa ybs

Menghasilkan senyawa yang tadinya tidak bisa

dideteksi menjadi bisa dideteksi (senyawa nonkromofor senyawa berkromofor)

Meningkatkan

berkromofor
fluorescensi)

daya
UV

deteksinya (senyawa
senyawa berkromofor
DKS-09

46

Gas Chromatography
metode pemisahan yang mendasarkan partisi cuplikan

antara fase gerak dan fase diam

mempunyai kecepatan yang tetap dan aliran fase gerak
( gas ) sangat terkontrol,
sangat mudah terjadi pencampuran uap sampel ke dalam
aliran fase gerak,
pemisahan fisik terjadi di dalam kolom yang jenisnya
banyak sekali, panjang dan temperaturnya dapat diatur.
mempunyai banyak macam detektor yang dapat dipakai
dan tanggap detektor (proporsional dengan jumlah tiap
komponen yang keluar dari kolom),
kemudahan kromatografi gas yang digabungkan dengan
instrumen fisiko kimia yang lainnya seperti GC-MS, GC-FTIR.

DERIVATISASI

DKS-09

4
8

DERIVATISASI

DKS-09

4
9

TEKNIK-TEKNIK SPEKTROSKOPI
Jenis

Dasar

Penggunaan Utama

Spektrofotometri UVVis

Perpindahan energi
dari elektron luar yg
terikat maupun tidak
dlm molekul

Analisa biokimiawi
kualitatif & kuantitatif
secara rutin lewat uji
kolorimetri, uji enzim
dari kinetika reaksi

Spektrofluorometri

Radiasi yang terserap

dipancarkan lagi
dalam gelombang yg
lebih panjang

Analisis kuntitatif
rutin, analisa enzim
dan kinetika dan
perubahan
konformasi protein.
Lebih peka dr
Spek.UV-Vis

Spektrofotometri
infra-merah (IR)

Vibrasi Atom karena

perbedaan gerak dua
kutub

Analisa kualitatif
pengenalan molekul
murni dengan ukuran
sedang. Dipakai dlm
penelitian.

TEKNIK-TEKNIK SPEKTROSKOPI
Jenis

Dasar

Penggunaan Utama

Spektrofotometri
Nyala (pancaran &
serapan, AAS)

Perubahan energi dari

elektron terluar suatu
atom setelah
penguapan menjadi
nyala

Analisa kualitatif &

kuantitatif untuk
metal, biasanya dlm
biokimiawi klinis.

Spektrometri magnet
inti

Penentuan tenaga
magnetis yang
berhubungan dengan
proton ganjil pada inti
atom

Penelitian struktur
molekul organik
dengan berat molekul
kurang dari 20.000
dalton

Spektrometri massa
(MS)

Penentuan jumlah
molekul dan
pecahannya yang
terionisasi bermuatan
positif

Analisa kualitatif
denagn bahan sedikit
(10-4 10-6 g), dapat
dihubungkan dengan
GC.

ELISA
(Enzyme-linked immuno-sorbent assay)
antigens are immobilized on a solid support, either coated
directly or through specific capture antibodies. Primary
detection antibodies are then applied, forming a complex
with the antigen. If conjugated with an enzyme, the
detection antibody can directly be used to quantify the
antigen, or can itself be quantified by another enzymeconjugated secondary antibody

Blotting

Terminologies..
A Southern blot is a method routinely used in

molecular biology for detection of a specific DNA

sequence in DNA samples.
The northern blot is a technique used in
molecular biology research to study gene
expression by detection of RNA.
The Western blot (alternatively, protein
immunoblot) is an analytical technique used to
detect specific proteins in a given sample of tissue
homogenate or extract.
Southwestern blotting, based along the lines of

Southern blotting (which was created by Edwin

Southern) and first described by B. Bowen and
colleagues in 1980, is a lab technique which

..Western Blot

PEMILIHAN METODE BIOANALISIS

Kebutuhan metode yang cepat & biaya ekonomis.
Pengetahuan dasar komposisi bahan yang akan

dianalisis sehingga dpt dipilih metode dan cara

penyiapan yg tepat.
Tingkat ketelitian yang dikehendaki
Jika metode yg singkat dan biaya rendah sdh cukup

memadai, tidak perlu melakukan metode yg rumit

dg tingkat ketelitian yg tinggi.
Berapa banyak sampel yang tersedia
Jika sampel sedikit, sulit didapat & mahal, maka

perlu dipilih metode yg mampu mendeteksi sampel

yg sedikit

et
Bon COURAGE