IMPACT OF HYPERGLYCEMIA ON

EARLY EMBRYO DEVELOPMENT AND

EMBRYOPATHY : IN VITRO
EXPERIMENTS USING A MOUSE
MODEL

PEMBIMBING : dr. TIGOR P. SIMANJUNTAK, Sp.OG.

OLEH : TATIH / 1061050159
KEPANITERAAN ILMU KEBIDANAN DAN KANDUNGAN FK UKI
JAKARTA 2015

ABSTRACT
BACKGROUND: The aim of this study is to model the processes of early
embryopathy seen in human pregnancy complicated by maternal
hyperglycemia secondary to maternal diabetes using a mouse embryo
culture system.
METHODS: Female mice were superovulated and mated in pairs. Two-cell
embryos were harvested from the oviducts and cultured in vitro in KSOM
medium (synthetic oviductal medium enriched with potassium)
supplemented with 0.2, 5.56, 15.56 or 25.56 mM D-glucose. Cell
proliferation, differentiation and apoptosis were assessed. Experiments were
performed in constant, embryos exposed to a particular concentration of
glucose (0.2, 5.56, 15.56 or 25.56 mM) from harvest to either Day 5 post
fertilization (pf) or Day 8 pf, and fluctuating, embryos exposed to alternate
high 25.56 mM and normal 5.56 mM concentrations of glucose between
harvest and Day 5 pf, glycemic culture.

ABSTRACT
RESULTS: Expected levels of blastocyst formation and hatching were seen at
0.2 and 5.56 mM concentrations of glucose but both were impaired at higher
concentrations (x2 , P < 0.005; P < 0.001). Total cell numbers (P < 0.002)
and cell allocation to the inner cell mass (P < 0.01) were reduced, but with
no evidence of enhanced apoptosis in the hyperglycemic cultures. Variation
in hyperglycemic exposure of the embryos on Days 2, 3 and 4 showed no
adverse effects of hyperglycemia up to 24 h, but 48 and 72 h exposures
were equally embryopathic (P < 0.01).
CONCLUSIONS: Hyperglycemic exposure for >24 h is toxic to early embryo
development. These findings may explain the lower than expected
implantation rates and higher than expected rates of congenital abnormality
and early pregnancy loss seen in patients with diabetes, particularly those
with poor diabetic control.
Keywords: embryopathy; hyperglycemia; in vitro; mouse embryo; diabetes

ABSTRAK
LATAR BELAKANG : Tujuan dari penenlitian ini adalah untuk mengetahui
proses awal embriopati yang terlihat pada wanita hamil dengan komplikasi
hiperglikemia sekunder pada ibu diabetes menggunakan sistem kultur
embrio tikus.
METODE : Tikus betina yang subur dan dikawinkan dengan pasangannya. Dua
sel embrio diambil dari saluran telur dan dikultur secara in vitro pada media
KSOM (media saluran telur sintesis yang diperkaya dengan potasium)
dilengkapi glukosa 0.2, 5.56, 15.56 atau 25.56 mM. Proliferasi sel,
diferensiasi dan apoptosis dinilai. Percobaan dilakukan dengan memberikan
pajanan konsentrasi glukosa (0.2, 5.56, 15.56 atau 25.56 mM) secara terus
menerus pada embrio dari pengambilan pada hari ke 5 post fertilisasi (pf)
atau hari 8 pf, dan embrio diberikan pajanan konsentrasi glukosa yang tinggi
25.56 mM dan konsentrasi glukosa yang normal 5.56 mM secera
bergantian.

ABSTRAK
HASIL : Diduga peningkatan pembentukan blastosis terlihat pada konsentrasi
glukosa 0.2 dan 5.56 mM tetapi keduanya dihambat pada konsentrasi
glukosa yang lebih tinggi (X2, P<0.005 ; P<0.001). Pada kultur
hiperglikemia, total jumlah sel (P<0.002) dan alokasi sel inner cell mass
(P<0.001) dikurangi, tetapi tanpa ada peningkatan apoptosis sel. Pada
embrio variasi pajanan hiperglikemik pada hari ke 2,3,dan 4 menunjukan
tidak ada efek buruk hiperglikemia hingga 24 jam, tetapi pada 48 dan 72
jam paparan dapat menyebabkan embriopati (P<0.01).
KESIMPULAN : Pada awal perkembangan embrio pajanan hiperglikemia
selama > 24 jam bersifat toksis. Penemuan ini mungkin menjelaskan bahwa
terdapat peluang lebih rendah terjadinya tingkat implantasi dan terdapat
peluang lebih tinggi terjadinya kelainan kongenital dan keguguran yang
tampak pada pasien diabetes, terutama dengan kontrol diabetes yang
buruk.
Kata Kunci : Embriopati, hiperglikemia, in vitro, embrio tikus, diabetes

PENDAHULUAN
Tujuan
untuk mengetahui proses awal embriopati
yang terlihat pada wanita hamil dengan
komplikasi hiperglikemia sekunder pada ibu
diabetes menggunakan sistem kultur embrio
tikus.

 Pada Blastosis (Hari ke 4 kehamilan) lebih

tinggi tingkat terjadinya :
fragmentasi inti sel,
pengurangan jumlah inner cell mass (ICM)
meningkatkan insidensi apoptosis ICM
dibandingkan dengan hewan non diabetes.

(Pampfer et al., 1990, 1997 ; Vercheval et al., 1990;

De Hertogh et al., 1991a; Moley et al., 1991, 1998a).

Percobaan embrio pada kultur konsentrasi glukosa yang

tinggi (20-52 mM) menunjukan adanya:
inhibisi perkembangan blastosis,
inhibisi proliferasi sel dan diferensiasi sel,
meningkatkan apoptosis dan mempengaruhi kadar
metabolit intraembrionik.

(Zusman et al., 1985; Diamond et al., 1989; Pampfer

et al., 1990; Wuu et al. 1998; De Hertogh et al.,
1991a; Moley et al., 1996, 2001).

HINCK ET AL. 2001.

Peningkatan kadar ROS dan stimulasi ekpresi dari
gen pro-apoptotic (p53 dan Bax) 12, 21 dan
efektor apoptotic intraselular (caspase-3 dan
caspase
-activated
deoxyribonuclease)
menyebabkan pengurangan jumlah ICM.

Hinck L, Van Der Smissen P, Heusterpreute M, Donnay I, De

Hertogh R, Pampfer S. Identification of Caspase-3 and CaspaseActivated Deoxyribonuclease in Rat Blastocysts and Their
Implication in The Induction of Chromatin Degradation (But Not
Nuclear Fragmentation) by High Glucose. Biol Reprod 2001;64:555562.

PEMBAHASAN

PENILAIAN PERKEMBANGAN TAHAP PREIMPLANTASI

Morfologi sel
Diferensiasi sel
Proliferasi sel
Apoptosis sel

(A) Blastocyst stained using 4,6-Diamidino-2

phenylindole (scale bar 50 m) for assessment
of cell proliferation.
(B) Blastocyst stained using terminal
deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP
nick end labeling (scale bar 50 m) for
assessment of cell death (apoptosis).
(C) Dual stained blastocyst (scale bar 20 m)
for assessment of cell differentiation

Efek pada Pre-implantasi

Konsentrasi glukosa (0.2-25 mM)
Tingkat
perkembangan blastosis pada hari ke 5 post
fertilisasi secara signifikan lebih besar pada
KSOM (61,2%) dibandingkan pada mKSOM
(45.6%).
Pada preimplantasi embrio hari ke 5 post
fertilisasi dengan pajanan glukosa yang tinggi
menghasilkan blastosis yang lebih sedikit
dibandingkan dengan embrio kontrol (kultur
dalam glukosa 5.56 mM)

EFEK HIPERGLIKEMIA PADA BLASTOSIS

HARI KE 5 PF

HIPERGLIKEMIA DAN APOPTOSIS

Peningkatan konsentrasi glukosa, bagaimanpun tidak
mempunyai efek yang signifikan pada persentasi
apoptosis sel. Embrio kontrol positif secara konsisten
memiliki mayoritas (>90%) apotosis sel.

Efek pada Peri-implantasi

Peningkatan konsentrasi glukosa
lebih sedikit
embrio yang mengandung ICM (P<0.01).
kultur dengan konsentrasi glukosa 0.2 dan 5.56
mM, 80% embrio mengandung ICM.
kultur dengan konsentrasi glukosa 15.56 dan 25.56
mM hanya 60.5% dan 31.3% mengandung ICM.
Efek embriopati maksimal pada konsentrasi glukosa
25.56 mM.
embrio tikus hari 5 pf
konsentrasi glukosa 25.56 mM
(24, 48 jam)
memeriksa pajanan glukosa relatif yang
dapat menyebabkan embriopati. (Gambar 3)

Gambar 3. Effect of Increasing The Concentration of Glucose in Embryo Culture

Media on Percentage of 2-Cell Embryos Forming Blastocysts by Day 5 pf.
*Significantly different to control culture (2, P < 0.001) Control embryos were
cultured in 5.56 mM glucose for the duration of the experiment.

 Pada akhir percobaan proliferasi sel embrio secara

signifikan terhambat oleh pajanan glukosa 25.56 mM
selama 48 jam tetapi hal ini tidak terjadi pada awal
percobaan.
Selain itu, tidak ada efek signifikan pada apoptosis sel
ketika embrio terpajan oleh konsentrasi glukosa yang
tinggi selama 48 jam antara hari ke 2 dan ke 4 pf.
(Gambar 2).

Tabel 6. The Effect of Exposure to High Glucose in Embryo Culture Medium for
Either a 24h or a 48 h Period on The Total Cell Number and Cell Apoptosis on
Day 5 pf.

Glucose concentration of medium H = 25.5 6mM, L = 5.56 mM

Total cell No of apop % Apoptotic
Day 1 Day 2
Expt 1 Control
Early 24 h
Late 24 h
Expt 2 Control
Early 48 h
Late 48 h
Expt 3 Control
Mid 24 h
Split 48 h

Day 3
L
H
L
L
H
L
L
L
H

n
L
L
L
L
H
H
L
H
L

P < 0.05

NS

NS

L
L
H
L
L
H
L
L
H

36
33
32
34
29
37
56
52
32

Values are expressed as mean SEM.

*aSignificantly different to Experiment 2 Control.

52.1 3.7
58.6 3.6
48.3 3.3
50.0 3.0
52.0 3.6
41.5 2.9a
57.5 3.3
49.3 3.5
52.8 3.3

3.8 0.6
3.9 0.6
3.8 0.8
2.5 0.4
2.9 0.9
2.4 0.4
4.3 0.9
3.3 0.5
3.5 0.5

7.1 1.2
7.1 1.2
7.5 1.5
5.3 1.0
5.1 1.4
6.3 1.1
8.1 1.0
7.3 0.9
7.2 1.1

KESIMPULAN
Pada awal perkembangan embrio pajanan hiperglikemia selama
> 24 jam bersifat toksis.
Penemuan ini mungkin menjelaskan bahwa terdapat peluang lebih
rendah terjadinya tingkat implantasi dan terdapat peluang lebih
tinggi terjadinya kelainan kongenital dan keguguran yang tampak
pada pasien diabetes, terutama dengan kontrol diabetes yang
buruk.

DAFTAR PUSTAKA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.

Pampfer S, de Hertogh R, Vanderheyden I, Michiels B, Vercheval M. Decreased Inner Cell Mass

Proportion in Blastocysts from Diabetic Rats. Diabetes 1990;39:471-476.
Vercheval M, De Hertogh R, Pampfer S, Vanderheyden I, Michiels B, De Bernardi P, De Meyer R.
Experimental Diabetes Impairs Rat Embryo Development During The Preimplantation Period.
Diabetologia 1990;33:187-191.
De Hertogh R, Vanderheyden I, Pampfer S, Robin D, Dufrasne E, Delcourt J. Stimulatory and Inhibitory
Effects of Glucose and Insulin on Rat Blastocyst Development In Vitro. Diabetes 1991;a40:641-647.
Moley KH, Vaughn WK, DeCherney AH, Diamond MP. Effect of Diabetes Mellitus on Mouse
Preimplantation Embryo Development. J Reprod Fertil 1991;93:325-332.
Moley KH, Chi MM, Mueckler MM. Maternal Hyperglycemia Alters Glucose Transport and Utilization In
Mouse Preimplantation Embryos. Am J Physiol1998;a275:E38-E47.
Zusman I, Yaffe P, Ornoy A. Effects of Metabolic Factors in The Diabetic State of The In Vitro
Development of Preimplantation Mouse Embryos. Teratology1987;35:77-85.
Pampfer S, Moulaert B, Vanderheyden I, Wuu YD, De Hertogh R. Effect of Tumor Necrosis Factor Alpha
on Rat Blastocyst Growth and Glucose Metabolism. J. Reprod Fert 1994;c101:199-206.
Pampfer S, Vanderheyden I, Wuu YD, Baufays L, Maillet O, DeHertogh R. Possible Role for TNF-Alpha in
Early Embryopathy Associated with Maternal Diabetes in The Rat.Diabetes 1995;44:531-536.
Moley KH, Vaughn WK, Diamond MP. Manifestations of Diabetes Mellitus on Mouse Preimplantation
Development: Effect of Elevated Concentration of Metabolic Intermediates. Hum Reprod 1994;9:113-121.
Wuu YD, Pampfer S, Vanderheyden I, Lee KH, De Hertogh R. Impact of Tumor Necrosis Factor Alpha on
Mouse Embryonic Stem Cells. Biol Reprod 1998;58:1416-1424.
Moley KH, Chi MM-Y, Kuudson CM, Karsmeyer SJ, Muekler MM. Hyperglycemia Induces Apoptosis in
Pre-implantation Embryos Through Cell Death Affected Pathways. Nat Med 1998;b4:1421-1424.
Moley KH. Hyperglycemia and Apoptosis: Mechanisms for Congenital Malformations and Pregnancy Loss
in Diabetic Women. Trends Endocrinol Metab2001;l2:78-82.
Hinck L, Van Der Smissen P, Heusterpreute M, Donnay I, De Hertogh R, Pampfer S. Identification of
Caspase-3 and Caspase-Activated Deoxyribonuclease in Rat Blastocysts and Their Implication in The
Induction of Chromatin Degradation (But Not Nuclear Fragmentation) by High Glucose. Biol Reprod
2001;64:555-562.