MICROSCOPIO

ELECTRONOCI DE
BARRIDO
PREPARACION DE LA MUESTRA

MICROSCOPIO ELECTRONICO DE
BARRIDO
La metodologa que se emplee para preparar la
muestra que ser observada por microscopa
electrnica de barrido, tendr como objetivo lograr
que la misma se encuentre en condiciones idnticas
a su estado natural, sin que aparezcan artefactos
que introduzcan errores durante la interpretacin de
las imgenes.

MICROSCOPIO ELECTRONICO
BARRIDO
(1)Bacterias y
esporas de
alga.

MICROSCOPIO ELECTRONICO DE
BARRIDO
Para seleccionar el mtodo a usar, se deber elegir la ruta de acuerdo a la
naturaleza de la muestra (1).
Para obtener informacin de la topografa superficial se podr realizar
observaciones por microscopa electrnica de barrido con detector de
electrones secundarios o retrodifundidos, si se necesita realizar
reconstruccin tridimensional, los nuevos instrumentos poseen
incorporado un haz de Galio que va liberando zonas de observacin y si
se requiere conocer los elementos qumicos que la componen se decidir
por un sistema de microanlisis con detector de rayos x. Las condiciones
de operacin del equipo que se utilizar para su observacin dependern
del tipo de muestra y la clase de instrumento utilizado.

TIPOS DE MUESTRA
Superficies no biolgicas:
Seleccin de la muestra: se toma una porcin de la muestra
representativa. Se elige la zona a observar, si es necesario se
lava, ya sea lavado simple, o bien con aparato limpiador de
ultrasonido, pulido o lavado con solventes. Puede secarse al
aire, en estufa a 25 C, fracturarse por congelamiento, etc. Se
acondiciona la superficie que se desea observar de la mejor
manera posible.

Superficies de especmenes biolgicos

Seleccin de la muestra: la muestra ser tomada de acuerdo al

detalle que necesita ser observado, cuando ms pequea mejor se
mantendr la estructura. (1,2 mm aproximadamente como tamao
ptimo para tejidos). Se tendrn en cuenta las limitaciones en el
tamao de la cmara del microscopio en que se observar y las
posibilidades de inclinacin y rotacin.
Deber tenerse en cuenta al lavar, la osmolaridad de la solucin,
el tampn, el pH, la duracin del lavado, la cantidad de los
mismos, si usar ultrasonido, el tiempo y por ltimo la temperatura.

 Mtodos para remover materiales extraos de la superficie de la muestra:

Durante la preparacin de especmenes acuticos, es necesario remover materiales de
la superficie tales como mucus y partculas. Estas pueden ser restos de animales,
suciedad, fragmentos de tejido, bacterias que casi siempre estn adheridos al mucus. Un
mtodo que puede utilizarse es tratar las muestras con glicerol para extraer mucus.
Se utilizan soluciones cidas, ej. : 1% acido cloridrico o cido ascrbico para remover el
mucus. Un mtodo que ha dado excelentes resultados es el tratamiento con ultrasonido
(desde 5 a 30 seg.) para nemtodos, artrpodos, vertebrados, larvas y otros tipo de
muestras . El nico cuidado que hay que tener es no pasarse con el tiempo. El mismo
mtodo se utiliza para limpiar superficies de rocas, metales, piezas con corrosin, etc.
Desmineralizacin:
Se realiza con EDTA (cido etilen- diamina-tetraactico). Otra tcnica es utilizar una
solucin de cido ascrbico 1% para remover grnulos de calcio o esqueletos calcreos.
Remover cilios o flagelos (estructuras microtubulares):
Suspender y agitar en agua de mar fra e hipertnica (conteniendo 30 mg /l de Na Cl
adicionales) por 2 minutos.
Aspirar varias veces con una jeringa los especmenes (protozoos).

Tecnicas de preparacin
La preparacin de muestras al MEB requieren de un proceso que no es ni
complejo ni laborioso, aunque algunos de sus pasos deben ser muy
preciso, como es el caso de la desecacin, para que la muestra se
conserve lo ms cercana a la realidad.
Los pasos o tcnicas para la preparacin son:
Fijacin
Deshidratacin
Desecacin
Montaje
Metalizacin

Fijadores
Tiene por objeto mantener la estructura estable para lo cual se fijan
las protenas y lpidos.
Se utilizan fundamentalmente dos tipos de fijadores:
Coagulantes.- Actan coagulando las protenas, formando en el
nucleoplasma y citoplasma una intrincada red en donde quedan
atrapadas las organelas.
No coagulantes. Mantienen la estructura en mejores condiciones,
similares a su estado natural.

Formas de utilizacin de los fijadores

Como vapor: Generalmente se utiliza cuando por alguna razn no se puede
sumergir la muestra en el fijador. Para realizar este mtodo se deben tomar
medidas de seguridad: se colocar la muestra en una cmara cerrada, debajo de
campana extractora y el espcimen se expondr a los vapores durante
determinado tiempo, depender de su tamao.
Ej. tetrxido de osmio tarda en penetrar 0.5mm en una hora cuando est en
solucin. Es muy voltil y como vapor fija muy rpido.
Por inmersin: Requiere una cuidadosa diseccin del espcimen

Deshidratacin
El objetivo de que el tejido se mantenga en buenas condiciones para su
observacin. Para remover el agua de los tejidos se utilizan solventes
orgnicos, como acetona o alcohol.
Mtodos de deshidratacin
Se extrae el lquido fijador (sin dejar la muestra al aire) y se reemplaza por el
primer lquido deshidratante, as hasta llegar al ltimo, que es el puro (100%).
Se hace con pipeta Pasteur, cuidando que el volumen de la solucin siempre
sea mayor, por lo menos 10 veces, al tamao del material (muestra).
Se trabaja a temperatura ambiente o en fro. Si se hace en fro, se debe elevar
la temperatura hasta la ambiente cuando el material ya est en la solucin al
96%.

Secado o desecacin
Secado por congelamiento

El espcimen se congela rpidamente en nitrgeno lquido y el hielo es

sublimado a baja temperatura y alto vaco. Cuando el hielo se ha
vaporizado completamente, la muestra se lleva a temperatura
ambiente y se prepara para su observacin. Los lquidos para
congelarla pueden ser: Nitrgeno lquido, propano y otros.
Secado por punto crtico:

Esta tcnica utiliza la propiedad de los lquidos de cambiar de la fase

lquida a la gaseosa sin generar calor latente de vaporizacin o cambio
de densidad. La temperatura y presin a la cual este fenmeno ocurre
se denomina punto crtico .

Portamuestra
El instrumento posee unos recipientes metlicos
para colocar las muestras y se pueden fabricar
fcilmente portamuestras adaptados al tipo y
tamao del espcimen.
Cpsulas beem modificadas: estas cpsulas se
compran en los proveedores de artculos de
microscopa electrnica y se adecuan a las
necesidades. Hay de varios tipos y de acuerdo a
la muestra que se va a procesar se pueden
fabricar diferentes.

Montaje
El soporte para la muestra es generalmente un cilindro de bronce, aluminio, o carbn.
Los hay de diferentes tamaos. Los convencionales son de 1cm y 2,5 cm de dimetro.
En algunos instrumentos tiene una base de menos dimetro que se utiliza para fijar el
portamuestra con un tornillo a la platina de la cmara del SEM.
Una vez que la muestra est seca, se fija al portamuestra con un material adhesivo.
Entre los adhesivos ms utilizados se mencionan: cintas adhesivas conductoras de
aluminio, carbn, doble faz, esmalte para uas, pintura de plata y protenas que
adhieren la muestra por carga elctrica.
La muestra se debe fijar al portamuestra con un adhesivo, preferentemente, conductor.
Si se utiliza un adhesivo no conductor, se puede realizar un puente con pintura de
plata (conexin) entre la muestra y el portamuestra para facilitar la conduccin.

Montaje

Montaje

Montaje

Montaje
Orientacin de la muestra:
Es importante, que la muestra haga buen contacto con el portamuestra. Un contacto
insuficiente provocar efecto de carga, distorsin de la imagen o desprendimiento
de la misma dentro del microscopio. La muestra deber montarse cuidadosamente
exponiendo las reas de inters .
Un paso importante es colocar el sitio de la muestra que queremos observar hacia
arriba, de manera que podamos enfrentarla al detector, rotarla e inclinarla. De esta
manera se facilitar la toma de imgenes y la calidad de los resultados que
obtengamos.

Metalizacin
La metalizacin consiste en cubrir la muestra con un metal conductor
como el Au (oro), el Pd(paladio) o el Pt (platino), y se realiza en vaco
en un metalizador. Cuando la muestra se va a analizar con difraccin
de rayos X se suele cubrir con polvo de carbn.

Metalizacion

Metalizacion
Recubrimiento de muestras en bajo vaco
Con este mtodo de recubrimientos llamado spputtering se aplica la cubierta de oro
para obtener las mejores condiciones de imagen y, si se requiere microanlisis por
rayor X, el recubrimiento por hilo de carbono.
Recubrimiento de muestras en alto vaco
Sus aplicaciones van ms all de la necesidad de obtener una muestra conductora para
el SEM. Consigue recubrimientos de grano mucho ms fino y est preparado para
realizar spputtering con distintos metales. Tambin trabaja por el mtodo de
evaporacin, con lo que aumenta el rango de posibles elementos de recubrimiento.
Utiliza electrodos de carbono para evaporarlo y obtener films que recubren las
rejillas destinadas al TEM.