Universidad de El Salvador

Facultad de Ciencias Naturales y Matemtica

Escuela de Biologa.

Marcadores basados en
PCR y Polimorfismo de
ADN amplificado
arbitrariamente (RAPD).

Marcadores basados en PCR

Reaccin en
Polimerasa.

cadena

de

la

La tecnologa de la reaccin en cadena de la

polimerasa fue concebida por Kary Mullis a
mediados de la dcada del 80, la cual revoluciono la
biologa en las reas de mejoramiento gentico de
plantas y animales domsticos.

Muchos
mtodos
tradicionales de clonacin,
secuenciacin y anlisis de
polimorfismo de ADN fueron
acelerados o sustituidos por
el uso de las numerosas
derivaciones de la tcnicas
de PCR.
Una de estas tcnicas es la
tecnologa
RAPD
que
comprende la amplificacin
simultanea de varios loci
annimos en el genoma
utilizando
primers
(iniciadores) de secuencia
arbitraria.

La PCR es una tcnica que comprende la

sntesis enzimtica In Vitro de millones de
copias de un segmento de ADN en presencia de
la ADN polimerasa.
La reaccin de PCR se basa en el apareamiento
y la polimerizacin enzimtica de un par de
oligonucletidos
utilizados como iniciadores
(primers) que delimitan la secuencia de ADN
de doble cadena, blanco de la amplificacin.
Estos Primers son sintetizados artificialmente de
manera que sus secuencias de nucletidos sean
complementarios a las secuencias especificas
de la regin blanco.

Ciclo de PCR

Polimorfismo de ADN
amplificado arbitrariamente
(RAPD).
Gracias a la tcnica de la PCR fue
posible
generar
grandes
cantidades de ADN de segmentos
especficos del genoma. El ADN
en grandes cantidades puede ser
detectado fcilmente a simple
vista directamente
en gel de
electroforesis
atraves
de
colorantes especficos para ADN
(Bromuro de etidio).

El gran avance en el rea de

marcadores moleculares basados
en PCR ocurri en 1990, con la idea
de utilizar primers mas cortos y
de secuencia arbitraria para dirigir
la
reaccin
de
amplificacin,
eliminando
la
necesidad
del
conocimiento
previo
de
la
secuencia.
Esto permiti abrir una perspectiva
enteramente nueva para el anlisis
genmico
de
individuos
y
poblaciones.

Desde su descripcin el uso de

marcadores RAPD en el anlisis
gentico y mejoramiento de plantas ha
tenido una rpida difusin.
Aplicaciones:
Obtencin de Fingerprints genmicos de individuos,
variedades y poblaciones.

Anlisis de la estructura y diversidad gentica en poblaciones

naturales, poblaciones de mejoramiento y bancos de
germoplasma
Establecimiento de relaciones filogenticas entre diferentes
especies.
Construccin de mapas genticos de alta cobertura genmica
y la localizacin de genes de inters econmico.

Base Gentica de los marcadores

RAPD.
Bsicamente RAPD es una variacin
del protocolo de PCR, con dos
caractersticas distintas:

Utiliza un primer nico en vez de

un par de primers.

El primer nico tiene secuencia

arbitraria, y por lo tanto su secuencia
blanco es desconocida.

Base molecular de los loci

RAPD.
La base molecular del polimorfismo RAPD no es
enteramente conocida.
Evidencias experimentales indican que diferencias
de un solo par de bases (mutaciones de punto) son
suficientes para causar la no complementariedad
del primer con el sitio de iniciacin e impedir as
la amplificacin del segmento.

 Datos experimentales de mapeamiento

gentico en diversas especies indican
que los loci de marcadores RAPD estn
distribuidos al azar a lo largo del
genoma, sin evidenciar agrupamiento
de marcadores en regiones especificas.
Las
secuencias
internas
de
los
segmentos amplificados incluyen desde
secuencias de copia nica hasta
secuencias altamente repetitivas.

Incremento del nivel de polimorfismo

de marcadores RAPD.
El uso de dos primers arbitrarios
pueden ser usados para aumentar la
cantidad de polimorfismo gentico.
De esta forma se esperara, un
incremento de bandas cuatro veces mas
a partir de un reaccin con dos primers
que con dos reacciones separadas, cada
una
utilizando
un
primer
individualmente.

 La combinacin de primers resulta en la

perdida de identidad de los fragmentos
amplificados, ya que un segmento puede ser el
resultado de la amplificacin mediada por uno u
otro primer o por la combinacin de ambos.
La digestin enzimtica de varios segmentos
amplificados RAPD o de segmentos individuales
reamplificados es una de las alternativas para
detectar el polimorfismo adicional entre bandas
monomorficas ( mismo tamao en pares de
bases y las mismas secuencias en las
extremidades donde el Primer inicio la
amplificacin).

 Otra estrategia para extraer mas

polimorfismo
a
partir
de
un
segmento de RAPD monomorfico es
la del mtodo de SSCP (Single Strand
Conformation
Polimorphism)
o
polimorfismo de conformacin de
cadena simple.

Competicin por sitios de amplificacin RAPD.

Tericamente, el numero de marcadores RAPD
amplificados y visualizados en la electroforesis
depende exclusivamente de la longitud del
primer utilizado y del tamao y complejidad del
genoma analizado.
La frecuencia de amplificacin de un segmento
depende de la probabilidad de que el primer
utilizado
encuentre
dos
secuencias
complementarias
(sitios
de
iniciacin)
en
orientacin opuesta a lo largo del ADN y a una
distancia amplificable, o sea como mximo algunos
miles de pares de bases.

 Estudios realizados demuestran que el

numero de bandas obtenido es independiente
de la complejidad del genoma. Es decir el
numero de bandas amplificadas a partir de
genomas mas simples como los de
Cianobacterias
es
semejante
a
los
amplificados a partir de genomas mas
complejos como el de soja.
La reaccin RAPD favorece la amplificacin de
segmentos donde la complementariedad
entre el primer y el sitio de iniciacin en el
ADN molde es mas alta.

 La disponibilidad de sitios de
amplificacin con mayor numero de
bases en un genoma, resulta en una
mejor competitividad de esos sitios y
con
esto
la
amplificacin
preferencial, aun si hay presencia de
exceso molar de ADN de otro
genoma.

Dominancia de los marcadores

RAPD.
Una caracterstica fundamental de
los
marcadores
RAPD
es
su
comportamiento como marcadores
genticos dominantes.
Al observar una banda RAPD en el
gel no es posible distinguir si aquel
segmento se origino a partir de una o
de dos copias de la secuencia

Un individuo diploide homocigtico(AA): a partir de estos

alelos dominantes se produce la amplificacin
Un individuo heterocigtico (Aa):
el alelo A es
amplificado, mientras que el alelo a no es amplificado.
En RAPD el genotipo homocigtico recesivo (aa) es
identificado por la ausencia de la banda en el gel (fenotipo
nulo), los genotipos homocigticos dominante (AA) y
heterocigtico (Aa) son considerados como una misma
clase fenotpica, esto es la presencia de las bandas en el
gel.

Ventajas de marcadores RAPD.

Simple.
Sencillo.
Permite efectivamente el anlisis gentico detallado
de un gran numero de marcadores.
El uso de la tcnica no requiere experiencia
profunda en biologa molecular ni tampoco
instalaciones sofisticadas de laboratorio.
Mas sensible que la RFLP en la deteccin de
polimorfismo a nivel del ADN..
Puede ser utilizado para cualquier organismo.

Limitaciones de los marcadores RAPD.

Bajo contenido de informacin gentica
por locus.
Requiere uso intensivo de geles de
electroforesis.
Solo un alelo es detectado, el segmento
que es amplificado, mientras las dems
variaciones allicas son clasificadas
conjuntamente como un alelo nulo.

 As como para todos los tipos de

marcadores moleculares, en el caso de los
marcadores RAPD algunas bandas so fcil
y claramente interpretadas, mientras que
otras son ambiguas, esta ambigedad
puede resultar de:
1

Bajo poder de un primer especifico para

discriminar
entre
distintos
sitios
de
amplificacin.

De la competicin de diferentes sitios de

amplificacin por sustrato o enzimas

Problemas relacionados con la estandarizacin

de las condiciones de amplificacin.

Esquema para realizar el anlisis RAPD RAPD.

Descongela el primer y la mescla maestra.

Hervir agua en un Beaker.
Rotular los tubos ependorf.
Agregar a cada tubo 20 l de mescla
maestra, mas 1.5 l de primer por cada
muestra a analizar.
Adiciona un l de ADN a cada tubo.
Microcentrifugar lentamente por pocos
segundos.

Adicionar 35 l de aceite mineral.

Colocar los tubos en la rejilla, hervir por 10 min.
Prepara el termociclador.
Preparar la solucin Taq mesclando en un ependorf
colocado en hielo, 0.25 l de Taq-polimerasa mas
2.25 l de agua bidestilada por muestra a analizar.
Luego de hervir, coloque rpidamente la rejilla en
hielo picado durante 5 min.
Adicione 2.5 l de solucin Taq a cada Eppendorf,
transpasando la capa de aceite con la punta de la
micropipeta.
Saque los ependorf. Pongales aceite abajo y poner
a funcionar la maquina.

Gracias por
su atencin