Biotecnologa

Definicin
Historia
Procesos en la biotecnologa alimentaria
Etapas en el desarrollo de la biotecnologa
Aplicaciones de la biotecnologa
Areas biotecnolgicas importantes
Procesos biotecnolgicos por fermentacin
Produccin de aminocidos, biopolmeros,
compuestos aromticos y colorantes
Hidrlisis para la obtencin de glucosa y fructosa

Biotecnologa
Uso integrado de la bioqumica, microbiologa y de las
ingenieras gentica, bioqumica y de procesos para fabricar
productos a partir de microorganismos, cultivos celulares y
partes derivadas de ellos (Knorr, 1987).
La biotecnologa alimentaria puede definirse como el uso de
las tecnologas biolgicas para la produccin, transformacin
o conservacin de alimentos, o bien para la produccin de
materias primas, aditivos y coadyuvantes empleados en la
industria alimentaria (Garca Garibay y col., 1993).
Ha permitido el desarrollo de procesos con base en las
siguientes aplicaciones:
1. Los mecanismos de control de la expresin y regulacin
gentica en microorganismos y en clulas utilizadas.

2. Las leyes de la bioqumica y la fisicoqumica que regulan el

comportamiento de stos entes biolgicos y de sus molculas.
3. La fisicoqumica y los fenmenos de transporte involucrados en
las operaciones de propagacin, recuperacin y utilizacin de los
organismos o partes de ellos.
Bioqumica
Microbiologa

Biologa
molecular

Biotecnologa

Universo
de la
Biotecnologa

Ingeniera

 Es una de las ms antiguas industrias. La panificacin, produccin

de vino y cerveza se remontan al ao 2400 a.c., en India (los Vedas)
con un producto similar al yogurt, y en los grabados de una tumba
Egipcia describiendo la panificacin y fermentacin alcohlica.
Posteriormente los estudios de Luis Pasteur ayudaron a comprender
los mecanismos de la fermentacin en la produccin de cerveza,
vino, vinagre, etc.
Posteriormente se us la papana para la produccin de la cerveza
siendo tal vez la primera patente con enzimas exgenas.
A principios del siglo pasado (XX) empezaron a prepararse una gran
cantidad de productos por fermentacin, tales como la biomasa de
microorganismos como alimento, el cido ctrico, y la invertasa de
levadura para la hidrlisis del azcar.
Muchos alimentos y bebidas comunes se basan en fermentacin
natural (queso y yoghurt), o en el uso de enzimas (jarabes
fructosados, aspartamo).

 El mayor impacto de la biotec. de alim. es la elaboracin de materias

primas y aditivos alimentarios: edulcorantes no calricos, jarabes
fructosados, aminocidos, vitaminas, etc.
En cuanto a las aplicaciones analticas destacan las enzimas para la
determinacin especfica de algunos componentes, microorganismos para la
evaluacin de la calidad nutricional de alimentos. Tambin se han
desarrollado sondas de DNA de anticuerpos para la determinacin rpida
de patgenos (Salmonella, Listeria) adulteraciones de protena de origen
animal por una de origen vegetal.
El mayor beneficio se ha dado en el sector farmacutico y de salud, ya que
son productos de alto valor agregado que pagan el costo de la investigacin
rpidamente.
Los antibiticos produjeron avances en en la tecnologa de fermentaciones,
microbiologa industrial, mutaciones no especficas, control de expresin
gentica.
En los 70s y 80s la tecnologa del DNA recombinante se ha usado para
producir protenas
de inters
farmacutico: insulina, hormona del
crecimiento, interfern, activador del plasmingeno.
La industria de los alimentos se encuentra muy departamentalizada y no tiene
estructura de grupo, adems el consumo de alimentos es masivo, con bajo
valor agregado.

Procesos Involucrados en la Biotecnologa

Alimentaria
1.

Procesos de fermentacin en alimentos

2.

Procesos de fermentacin en medios de cultivo

3.

Naturales o espontneos (cultivos mixtos) : ensilado, cacao, caf,

pozol
Inoculados: vino, yogurt, tempeh (Rhizopus oligosporus)
Produccin de biomasa: protena unicelular, levadura de pan, o de
cervecera

Procesos enzimticos

Elaboracin de materias primas: jarabes fructosados, cido

asprtico
Procesos de transformacin: malteado, coagulacin de leche
Aditivos

4.

Cultivo de clulas vegetales:

Elaboracin de materias primas: colorantes

Micropropagacin

Perodos de Desarrollo de la Biotecnologa

Primera Generacin: Etapa emprica o pre-Pasteur, donde se elaboran
vinagre, bebidas alcohlicas, productos lcteos, alimentos
fermentados tradicionales. No se tiene registro histrico.
Biotecnologa Industrial: A partir de la segunda mitad del siglo XIX.
Se divide en 2 etapas:
I) Segunda generacin o era de Pasteur: Entre 1865-1940;
desarrollo inicial de la microbiologa y la bioqumica.
II) Tercera generacin: Era de los antibiticos, entre 1940-1975,
surge la ingeniera bioqumica
Cuarta Generacin o nueva Biotecnologa: En la segunda mitad de la
dcada de los setenta, con la Ing. Gentica, cultivo de tejidos,
anticuerpos monoclonales.

4.

Biotecnologa no-convencional: Procesos de fcil implementacin,

de pequea o mediana escala, tendientes a resolver problemas de
ndole energtico o ecolgico.

Anticuerpos
Ab: Protenas en forma de Y, localizadas en el suero sanguneo,
producidas en respuesta a un antgeno especfico (MW~ 150 kDa)

Inmunidad humoral: IgG (Ab), IgM, IgE (alergia),

IgD, IgA (secreciones como saliva, calostro, lgrimas)

IgG: 75% del total de Ig

(Fluorocromo)

Sistema biotina-avidina,
que puede ser usado
eficientemente en
inmunofluorescencia
indirecta (IF), Enzyme
linked immunosorbent
assay (ELISA) y radioinmunoensayos (RIA).
Fluorforo: digoxigenina

ELISA competitiva para la deteccin de Salmonella. Al aumentar

la densidad de Salmonella, menos Ab estar disponible para
enlazarse al Ag recubriendo los pozos. Esto conduce a menos
enlace del Ab de deteccin a los Abs de los pozos y menor

ELISA tipo sndwich para la deteccin de una toxina.

Un au-mento en el nmero de molculas de toxina
conducir a un aumento en la formacin de producto

Procedimiento usado para aislar clulas de hibridoma

produciendo anticuerpos monoclonales. PEG= polietiln
glicol; HAT= hipoxantn aminopterina timidina.

Aplicaciones diagnsticas relevantes al procesamiento

y produccin de alimentos
Citometra de Flujo
Partculas biolgicas de inters se
colocan en suspensin. Se aade un
color fluorescente a la suspensin la
cual se hace fluir en un tubo que pasa
por una fuente de luz, usualmente un
rayo lser, una partcula a la vez. La
de la luz se elige para que el colorante
ligado a las partculas deseadas
fluoresca. Una computadora cuenta
y/o analiza las clulas o partculas que
pasan por el rayo lser y fluorescen,
las cuales pueden separarse de las
dems y recogerse en recipientes
separados. Algunas carctersticas de
las partculas como tamao y forma
no requieren usar colorantes, porque
tienen una dispersin de luz tpica al
pasar por el rayo lser.

IMPACTO DEL DESARROLLO BIOTECNOLGICO EN EL

PROCESO DE DOS PRODUCTOS ALIMENTICIOS:
Queso

Cerveza

Primera
Uso emprico de BAL
Uso emprico de levaduras
generacin Uso emprico de quimosina Uso emprico de malteado
Segunda Aislamiento y uso de BAL Uso de cultivos puros de lev.
generacin Extraccin, purific. y carac- Naturaleza enzimtica del
terizacin de la quimosina
malteado
Uso de papana para la
clarificacin en fro

Queso
Tercera Propagacin masiva de
Generac. BAL
Seleccin de cultivos
lcticos mejorados.
Sustitucin de quimosina por proteasas microbianas producidas
en gran escala

Cerveza
Mejor control de la fermentacin
Fermentacin continua para
producir cerveza.
Prod. y uso de amilasas microbianas
para sacarificacin y de -glucanasas
termotolerantes.
Uso de enzimas (glucosidasas amilasas)
para la produccin de cervezas ligeras

Cuarta ADN recombinante para Ing. Gentica para obtener levaduras

Generac. producir quimosina y
amilolticas y prod. de -acetolactato
mejoramiento de BAL
descarboxilasa para [diacetilo]<0.5 mg/L
Utilizacin ptima de
Ing. Gentica y cultivo de tejidos
enzimas y m.o. para la
para mejoramiento de cebada
maduracin acelerada.
Procesos con m.o. y enzimas inmovilizadas.

Uso industrial de enzimas: Quimosina (Renina)

La quimosina bovina causa un
rompimiento especfico de la kappacasena, que estabiliza las micelas de
casena. Reconoce la secuencia de
His98 a Lys111 y rompe el enlace
peptdico entre Fen105 y Met106 de
la cadena de kappa-casena.
Es una proteasa producida en el
cuarto estmago de la ternera, como
un precursor (pre-pro-quimosina).
Despus de una serie de protelisis, la quimosina madura tiene un PM
de 35.6 kDa, y se clasifica como una proteasa asprtica o carboxil
proteasa.
Tambin ataca enlaces Phe-Val, Glu-Ala, Leu-Tyr, Tyr-Leu, Leu-Val,
Phe-Tyr
pH ptimo de 3.5, aunque mxima estabilidad a pH 5.Experimenta
autlisis a pH 3.5 y se desnaturaliza a pH>6.

169

Uso industrial de enzimas: Quimosina

(Renina)
Las proteasas de Mucor miehei, M. pusillus y
Endothia parasitica, tienen similar estructura y
especificidad.
No obstante, estas proteasas no son adecuadas
para quesos madurados puesto que tienen un
rango diferente de actividades no especficas que
la quimosina y no producen los sabores correctos
en maduracin prolongada.
Las fuentes microbianas son ms baratas y
tienen ms estabilidad en su disponibilidad.
Adems, los vegetarianos encuentran el uso de la
renina bovina inaceptable.

Uso industrial de enzimas: Quimosina recombinante

Otra alternativa es clonar el gene bovino en una cepa productora
adecuada y producir la enzima por fermentacin. Los huspedes
posibles para su produccin son:
Escherichia coli. Es el organismo ms frecuentemente usado en
clonacin de genes. Desafortunadamente, las protenas
recombinantes son frecuentemente sintetizadas
intracelularmente como cuerpos de inclusin, lo cual incrementa
considerablemente el costo del proceso. Adems, E. coli no es
generalmente reconocida como segura para el consumo humano.
Bacillus sp. Es no patognico y se usan industrialmente para
producir amilasas. B. licheniformis produce la quimosina, pero
las secuencias seal no permitieron la secrecin de la enzima al
medio de cultivo.

Uso industrial de enzimas: Quimosina

recombinante
Lactococcus lactis. Se usa en cultivos iniciadores, pero los
niveles de produccin encontrados han sido muy bajos.
Saccharomyces cerevisiae. Se han tenido dificultades para
obtener altos niveles de secrecin en esta levadura.
Kluyveromyces lactis. Se usa para producir -galactosidasa, y
sus propiedades de fermentacin son bien conocidas. La
quimosina pudo producirse en este husped y se han obtenido
buenos niveles de secrecin al medio de cultivo.
El gen de quimosina se insert en el cromosoma de K. lactis
y la levadura se crece por fermentacin en lote alimentado.
Despus de la fermentacin, la levadura se destruye
aadiendo cido benzoico y la quimosina se separa por
filtracion.

Proceso de fermentacin en cervecera

Tipos de Malta

Proceso de fabricacin de cerveza

Gushing: Espuma fuera de la botella. Ocurre cuando existen muchas

microburbujas y liberacin excesiva e incrontrolada de CO2
Skunking: Cerveza daada por luz (UV), por enlazamiento de isohumulonas con S (se pueden detectar partes por trilln).
DMS: (CH3)2S, proviene de SmetilMetionina, umbral:10-150 ppb

Tipos de Cerveza
Los egipcios y mesopotmicos tenan en la cerveza un alimento
imprescindible.
Se producan hasta ocho tipos diferentes de cerveza que en Egipto
era un monopolio econmico en manos del faran
Los avances en la tecnologa cervecera se afianzan en Baviera,
alrededor del ao 1400, al descubrirse las ventajas de la
fermentacin, no en superficie sino en la profundidad de la cuba
Lager: Elaborada con cepas que crecen en el fondo del tanque: S.
cerevisiae. Fermentacin a 6-12C, por 8-14 d, despus se almacena
por mximo 3 semanas a -1C, antes de embotellar.
Es la que ms se produce en Alemania, E.U., Mxico, etc. Las lagers
de E.U. tienden a tener poco lpulo comparado con las europeas, y
no son amargas. Con 40-90 kcal/100 ml y <6 % (v/v) alcohol
(legislacin mexicana).

Tipos de cerveza
Ale: Se hacen con cepas de superficie que crecen uniformemente en
todo el mosto, son S. cerevisiae o S. carlsbergensis. Crecen a 1423C por 5-7 d.
Es casi exclusiva de Inglaterra, y su periodo de aejamiento es de
solo 1-3 d. Tiene sabores ms complejos que las lager por la T de
fermentacin (sabor afrutado por steres, etc.). Las ales fuertes
tienen >5% de alcohol, stout, porter, pale ale, bitter, con colores de
amarillo a negro y sabores de ligeros a muy profundos y complejos
Cervezas secas y ligeras. Pueden hacerse de ales o lagers, aunque se
usan ms comnmente las lagers. La ligera tiene sabor ms simple
por menores niveles de carbohidratos no fermentescibles,
obtenindose menos alcohol, y por tanto menos caloras (15-30
kcal/100 ml). Las cervezas secas tienen el mismo alcohol que las
convencionales, pero con diferente calidad sensorial con menos
sensacin de llenado. Sin alcohol: <1 % (v/v)
Cervezas sin alcohol: Evaporacin: los componentes voltiles se
recuperan del vapor en forma de esencia por destilacin fraccionada.
Rectificacin al vaco: Separar CO2 el cual se lava para recuperar
voltiles que se adicionan al destilado al vaco (~42C). smosis
inversa a P=5-7,5 MN/m2 . Mtodos ms primarios como la simple
detencin del proceso de fermentacin (malos sabores)

Lpulo (Humulus lupulus)

Confiere a la cerveza su sabor amargo caracterstico
Este fenmeno se debe a la isomerizacin de sus resinas
Sus componentes amargos son la humulona, lupulona y sus
compuestos de transicin, pero tambin tiene aceites esenciales
(humuleno, farneseno) y taninos.

Son las flores de la planta femenina del lpulo

Se usa entre 0.4 y 4 g/L
Es mejor usar extracto y resinas preisomerizadas

Adems, el lpulo tiene otras funciones

Props. antimicrobianas contra Gram(+)
Mayor cuerpo de la cerveza

Haze forming materials

Yeast
Spoilage organisms
Oxalic acid
Cell wall
polysaccharides from
Barley
Starch
Proteins and
polyphenols

Fermentacin primaria
La fermentacin es una parte crucial en el proceso de fabricacin de
cerveza
El proceso de gliclisis y fermentacin fue elucidado primeramente
en S. cerevisiae
Despus de la coccin se elimina el lpulo, se enfra el mosto y se
transfiere al biorreactor.
Se agregan ~0.5 L de una suspensin de levadura por 100 L de mosto
para disminuir la fase lag.
La fermentacin es un proceso anaerbico para generar energa a
travs de la reduccin de aceptores electrnicos orgnicos como la
G3P o acetaldehdo.
Altas conc. de glucosa y otros carbohidratos evitan la respiracin de
S. cerevisiae, alterando la estructura mitocondrial, ocasionando que la
fermentacin sea la ruta predominante de obtencin de energa, an
cuando exista abundante oxgeno, este fenmeno se denomina efecto
Crabtree.

Glucosa (180 g)
2 EtOH (92 g) + CO2 (88)

Piruvato descarboxilasa
(Mg2+)
Alcohol deshidrogenasa (Zn)

Fermentacin secundaria
Cuando todos los CHO fermentescibles se han convertido en EtOH, la
cerveza se transfiere a otro tanque, se enfra y se almacena, an con la
presencia de las levaduras.
El aejamiento vara de varios das a meses, donde la levadura es
capaz de ejercer un metabolismo limitado.
Se dan otros cambios debido a reacciones qumicas que mejoran el
sabor de la cerveza (steres: etil-, isoamil-, feniletil-; alcoholes,
cidos etil octanoato y etil caprilato, dicetonas vecinales, comps. de
azufre [DMSO, (CH3)2S, DMS], acetaldehdo, c. grasos de cadena
corta)
Cambio ms importante: reduccin en niveles de diacetilo (fuerte
sabor a mantequilla) indeseable en cerveza. El diacetilo se forma a
partir de -acetolactato (intermediario en la biosntesis de varios
aminocidos) a travs de un proceso no enzimtico.
El diacetilo se convierte lentamente a acetona por la levadura. Las
cerveceras modernas carbonatan la cerveza antes de envasar (4-5 g
CO2 /L). Se agrega glucosa para producir CO 2 en el producto final.

-acetolactato

Acetona
Diacetilo

[diacetilo]<0.5 mg/L, para no detectar sabor

N: ayuda a espumar,por polipptidos

amfipticos (10-50 ppm), suprime
carcter amargo.
O2: envejecimiento, turbidez
EtOH: puede inhibir espumado

Aspectos de la espuma de
cerveza

A favor
Polipptidos
Iso -cidos
Me2+
N2

Formacin (nucleacin, moldeado)

Estabilidad (retencin de cabeza)
Lacing (pegado, adhesin)
En contra
Textura, blancura, etc
Lpidos
Protenas responsables
Detergentes
Etanol

del espumado

Hiptesis del polipptido discreto

Hip. De los polipptidos amfipticos generalizados

Mejoras biotecnolgicas de la
cerveza: Represin catablica
La glucosa es la mejor fuente de carbono para las levaduras
porque puede pasar directamente a la ruta fermentativa
La glucosa es preferencialmente fermentada por las
levaduras y se usan otros carbohidratos cuando se termina la
glucosa, siendo entonces sujetos a represin catablica (RC)
Esto resulta en una disminucin indeseable en la velocidad
de produccin de etanol que a lo largo de un ao provoca
prdidas significativas en la produccin de la cervecera
En levadura, la RC tambin se ha llamado sealizacin de la
glucosa. Cuando se termina la glucosa, se inactivan los
genes necesarios para su utilizacin y se activan aquellos
involucrados en la entrada y uso de otros azcares, como
maltosa, ocurriendo un cambio diuxico.

Represin catablica en levaduras

En levaduras los niveles de adenosn monofosfato cclico
(cAMP), aumentan cuando la glucosa est presente; esto
bloquea la transcripcin de genes que codifican para
protenas involucradas en la toma y uso de maltosa y otros
azcares, aunque el mecanismo de esta regulacin no est
claro todava.
Como los mecanismos de la RC en levadura no estn
claros no se pueden alterar los genes para modificar la RC.
Se ha intentado eliminar la RC en algunas cepas de
levadura de cervecera exponindolas a un mutgeno
(sustancia que causa cambios aleatorios en la secuencia del
DNA), y luego a 2-desoxiglucosa, un anlogo de glucosa,
que no puede usarse como fuente de C (y energa) por las
levaduras

Represin catablica en levaduras

Clulas con RC normal de las cepas silvestres no pueden
usar fuentes alternativas de C debido al efecto inhibitorio
de la 2-desoxiglucosa.
Uno de los muchos mutantes puede desarrollar una RC
alterada, por mutacin de un gen responsable de codificar
una protena reguladora clave en la expresin gentica.
Tal mutante podra ser capaz de usar otros carbohidratos, a
pesar de la presencia de 2-desoxiglucosa.
Esta estrategia se ha usado exitosamente para producir
levaduras mutantes que pueden usar glucosa, maltosa y
maltotriosa simultneamente, evitando la fase lag que
normalmente ocurre a medida que declinan los niveles de
glucosa.
Recientemente los genes mig1 y mig2 se han descubierto
como los responsables de la represin catablica

Uso de una estrategia de mutagnesis para aislar

cepas de levadura con RC alterada
Exponer la levadura al mutgeno
Mutaciones aleatorias en el genoma de la levadura
Exponer las levaduras a 2-desoxiglucosa
La RC previene el uso
de otros carbohidratos
Mueren las levaduras
silvestres

Levaduras con RC alterada pueden

usar otros carbohidratos
Sobreviven las levaduras
mutantes

Mejoras en los procesos

industriales
S. cerevisiae utilizada en la industria cervecera flocula al
presentarse una falta de nitrgeno, oxgeno o carbono. La
floculacin est controlada por una proteina de pared celular con
su N-terminal hacia el medio y esta se une a glucoprotenas
(manosa)
Introduccin de -glucanasa para facilitar el filtrado de la
cerveza (-glucanos son muy viscosos)
Disminucin del tiempo de fermentacin por delecin de
mecanismo de control de expresin de invertasa y maltasa (mig1,
mig2), a causa de un incremento en el consumo de maltosa y un
decremento en el tiempo de adaptacin cuando se agota la
glucosa.

Biotecnologa: Cinco reas tecnolgicas

principales
DNA recombinante (rDNA). Insercin de DNA
nuevo sistema, donde se clona y se expresa.

a un

Tecnologa enzimtica. Se usa la capacidad cataltica de las

enzimas en solucin o inmovilizadas.
Cultivo de tejidos de plantas. Cultivo in vitro de clulas de
plantas para obtener sustancias o biotransformaciones
requeridas.

Tcnicas de clulas fusionadas. Fusin de dos clulas diferentes,

produciendo hbridos con caractersticas de ambos padres.
Ingeniera del procesamiento y tecnologa de fermentaciones.

Usos de la Biotecnologa en el procesamiento de alimentos

1.

2.

3.

Diseo de microorganismos que transformen biomasa no

comestible en alimento para consumo humano o alimentacin
animal.
Uso de sistemas biolgicos para ayudar al procesamiento de
alimentos ya sea actuando directamente sobre el alimento o
suministrando materiales que puedan aadirse al alimento
(aditivos)
Procesos innovadores en la tecnologa de alimentos: eliminacin
de cido ercico del aceite de canola. www.alltech.com/es

Categora de Procesos
1.
2.
3.

4.
5.
6.

Produccin de clulas microbianas: levadura, vacunas, insecticidas

microbianos.
Produccin de metabolitos: alcohol, cidos orgnicos, antibiticos,
aminocidos, vitaminas y enzimas.
Bioconversin de sustratos, no utilizados para crecimiento:
hormonas esteroides: Progesterona 11-hidroxiprogesterona por
Rhizopus nigricans, luego por sntesis qumica: cortisona y otros
tres esteroides (800 tons/ao).
Bioconversin de sustratos, usados para crecimiento pero con
objeto principal de cambiar su estado fsico: aguas residuales
Alimentos fermentados: yoghurt, queso, ensilado, salami, etc.
Cultivo de clulas de plantas y animales usando tcnicas
microbiolgicas.
a) Clulas animales. Anticuerpos monoclonales
b) Clulas de plantas

Procesos Biotecnolgicos
Seleccin del organismo
Gentica Aplicada
(mutacin, recombinacin, manipulacin de genes)
Esterilizacin

Elim. de
slidos

Biorreactor
(Clulas microbianas, de plantas
o animales; enzimas)
Procesos de recuperacin

(rompimiento de pared celular, separacin S-L,

concentracin, cromatografa, cristalizacin)
Producto final
(enzimas, antibiticos, aminocidos)

Calor
Eliminacin
de gases
Elim.
biomasa

Transformacin Gentica de Cultivos

Usos Potenciales de Plantas Transgnicas de Relevancia

para Consumidores y la Industria de Alimentos.

Cultivos recombinantes liberados en

EUA entre 1994 y 2000

(lino)

Rendimiento del algodn Bt en Mxico

Cutivos de OGM como canola,
maz, algodn y soya
representarion ms del 99% de
cultivos de OGM a nivel
mundial en 2001. En 2001 en
EUA nicamente stos 4
cultivos ms papaya y
calabacita transgnicos
produjeron un extra de 4
millardos de lb de alimento y
fibra, y aumentaron el ingreso
de granjas en $1.5 millardos y
redujeron el uso de plaguicidas
en 46 millones de lb.
http://whybiotech.com/mexico.asp?id=2701; Council for Biotechnology Information, (2004)

"Plant Biotechnology: Current and Potential Impact for Improving Pest Management
in U.S. Agriculture, An Analysis of 40 Case Studies," National Center for Food and
Agricultural Policy, June 2002, <www.ncfap.org/40CaseStudies.htm>.

Daar el ambiente?
Es seguro para comer?
Cmo me
beneficia?

La nueva tecnologa
es riesgosa

Preocupaciones del
consumidor

Rechazo del consumidor

de alimentos conteniendo
plantas transgnicas

Factores que conducen a la hostilidad del consumidor

hacia alimentos conteniendo plantas transgnicas

Compuestos indeseables en cultivos comestibles,

naturaleza qumica y presencia o ausencia de lneas
transgnicas con niveles reducidos de cada compuesto

Procesos biotecnolgicos por fermentacin

Leches fermentadas
Grupo I. Lactococcus y leuconostoc. Acidez baja moderada: Jocoque,
buttermilk

Grupo II. Lactobacillus. Acidez moderada/alta: Leche blgara, yakult,

leche acidfila

Grupo III. Lactobacillus, Streptococcus. Acidez moderada/ alta. Yoghurt,

Bioghurt, Brano

Grupo IV. Bacterias lcticas y levaduras. Acidez y alcohol: Kefir,

Koumis, Blgaros

Suero
Produccin de cidos orgnicos (propinico, actico, lctico), etanol,
-galactosidasa
Medio de cultivo: Protena unicelular (Kluyveromyces marxianus)
Levadura para panificacin (S. cerevisiae), despus de hacer
disponible los azcares (hidrlisis de lactosa)
Bebidas (Rivella, Gefilus)

Composicin del suero lcteo

Base hmeda
DBO: 30-50 g/L

Dubach, 1988.

Produccin mundial de suero lcteo

FAO, 2001

Usos del suero lcteo

Productos lcteos
(WPC, WPI)

Hidrolizados proteicos

Panadera
Confitera
Ac. Lctico
Enzimas:

inulinasa, lactasa
a partir de K. lactis, o
pectinasa y lactasa.

Alimentacin humana
Cmara de productos alimenticios
elaborados con leche, 1985
Produccin de 1.15 millones de tons
(1984), y 85% ms para 1995.

Jarabes de suero
Protena unicelular (C. utilis,
K. marxianus)

Programas de investigacin sobre propiedades

nutracuticas de productos lcteos
Inhibidores de la enzima convertidora de
angiotensina-I (ACE)((Dism. la presin arterial)
Glicomacropptido (64 aa)
Prebiticos, probiticos y simbiticos
-lactoglobulina como acarreador y fijador de retinol
Pptidos bioactivos liberados de las estructuras
nativas de la casena (casomorfinas, fosfopptidos)
Protenas biolgicamente activas (lactoferrina y sus
pptidos)

Productos fermentados de leche

como alimentos funcionales
Probiticos
Microorganismos benficos

Prebiticos
Incrementan el crecimiento de probiticos

Simbiticos
probiticos y prebiticos juntos

Hidrolizados de protena
de leche
Farmacutico dietas de formulacin
definida, nutricin enteral, nutricin
parenteral
Alimentos infantiles hipoalergnicos, no
alergnicos, bajo peso al nacer,
fenilcetonuria
Fortificacin Nutricional - calcio bebidas
enriquecidas, bebidas isotnicas para
atletas.

Pptidos derivados de la leche bovina

con propiedades inmunoregulatorias

Adapted from Gill & Rutherfurd, 1998

Algunos nutracuticos podran ser ms

adecuadamente clasificados como
frmacos
Inmunizacin
Bacteria

Vaca
Vaca Hiper- Transgnica
inmunizada
Ingenera
gentica

Tratamiento Inmunoglobulinas
basadas en Leche y
trmico calostro (MCBIs)
Componentes

antibacteriales no
especficos
Manufactura

Tratamiento de
enfermedades
digestivas.
Posible
actividad
anticariognica

Anti-allergy properties of fermented foods: an important

immunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria?
M. L. Cross, L. M. Stevenson and H. S. Gill
Milk and Health Research Centre, Institute of Food, Nutrition and Human Health, Massey University, Palmerston North, New Zealand

International Immunopharmacology
Volume 1, Issue 5, May 2001, Pages 891-901
Abstract
Clinical reports have suggested that dietary consumption of fermented foods, such as yogurt, can alleviate some of the
symptoms of atopy and might also reduce the development of allergies, possibly via a mechanism of immune
regulation. Controlled studies have indicated that consumption of fermented milk cultures containing lactic
acid bacteria (LAB) can enhance production of Type I and Type II interferons at the systemic level. In animal
models, LAB have been shown to promote interferon expression, and to reduce allergen-stimulated production
of IL-4 and IL-5 in some cases. Recent results have shown that LAB are potent inducers of pro-interferon
monokines (IL-12 and IL-18), and that cytokine secretion is stimulated by the interaction of Gram-positive cell
wall components with surface receptors of mononuclear phagocytes, via NF-B and STAT signalling pathways.
However, it is clear that the extent and quality of LAB-induced immunoregulation is strain-dependent. This
review discusses the clinical and laboratory evidence for anti-allergy properties of fermented foods, and
proposes a model for the mechanism by which some well-defined strains of immunoregulatory LAB might
down-regulate a Th2 allergic phenotype.

-lactalbumina Bovina
PM= 14.2 kDa y es muy parecida a la
protena humana. 74% de sus
aminocidos son idnticos, y un 6%
extra tiene un alto grado de similitud
qumca.
La alfa-LA bovina consiste de 123
aas y cerca del 10% de la protena
bovina est glicosilada. Tiene 4
enlaces disulfuro, Cys6-Cys120, Cys28Cys111, Cys61-Cys77, and Cys73-Cys91.
Dos puentes (Cys6-Cys120) y (Cys28Cys111) estn en el dominio-a, el
tercero (Cys61-Cys77) est en el
dominio-b. El cuarto (Cys73-Cys91)
conecta la hlice-C del dominio-a con
una hlice-310 en el dominio-b. No

 Embutidos fermentados
Los microorganismos reducen la humedad, contribuyen a la
estabilidad y proporcionan sabores y aromas caractersticos.
M.O.: BAL, Corynebacterium sp., Debaromyces sp.,
Penicillium expansum, P. nalgioviensis.
Pueden ser secos y semisecos, de carne (principalmente
cerdo) picada que por accin microbiana llegan a un pH 5.3,
y eliminada 25-50% de humedad (secos) 15% (semisecos).
- Ahumados/curados (semisecos): Thuringer (alemn). 18-48 h
de maduracin a 35-40C, coccin a 105C; 50% humedad
- Secos. Salami (italianos). 18-48 h de maduracin a 28-32C;
30-69 d de secado a 10-22C; 35-40% humedad
- Ahumados. Boloa (embutido de Lbano, Penn.). Slo de res.
10 d en salmuera a 4C, uso de KNO3; ahumado a 68C por
4-8 d. 50% humedad.

Clasificacin de bebidas alcohlicas segn el

sustrato de donde proceden
Sustrato

No destiladas

Destiladas

(3.5-14% alcohol)

(35-55% alcohol) (~20% alcohol)

Uva

Vino, champaa,
vino espumoso

Brandy, coac,
armaac, pisco
grappa

Manzana

Sidra, sidra
espumosa

Calvados

Pera

Perry

Cereza

Kirsch

Otras

Vinos de frutas:

FRUTAS

capuln, ciruela, guayaba, pitahaya, etc.

Fortificada

Jerez, oporto,
vermouth,
moscatel, madeira

Clasificacin de bebidas alcohlicas (Cont.)

Sustrato

No destiladas

Destiladas

Cereales
Cebada

Cerveza

Whisky

Maz

Tesgino

Bourbon, whisky de
maz de Tennessee

Varios
(incluyendo papa)
Arroz

Vodka, ginebra, akvavit

Cerveza africana

Caa
Melazas jugo

Ron, aguardiente,
cachaza, pinga,
charanda

Agaves

Pulque (A. atrovirens)

Miel

Vino de miel

Tequila (A. tequilana Weber),

mezcal (A. angustifolia)

Qu es el mezcal?

Es aquel producto que se obtiene de la destilacin y rectificacin

de mostos preparados directa y originalmente con los azcares
de las cabezas maduras de los Agaves, previamente hidrolizadas
o cocidas y sometidas a fermentacin alcohlica con levaduras,
cultivadas o no.
El Mezcal 100% agave puede ser joven, reposado o aejo y
susceptible de ser abocado.
Este debe ser producido en la Regin del Mezcal en Mxico.
Durango, Zacatecas, San Luis Potos, Guerrero y Oaxaca.

NOM-070-SCFI-1994 Bebidas alcohlic

Materia prima utilizada para

produccin de Mezcal en Mxico
OAX
GUE

Agave potatorum

OAX
GUE
SON

DUR
ZAC

Agave scabra

SLP
ZAC

Agave salmiana
GUE

Agave weberi
Agave angustifolia haw
Otras especies del genero agave excepto A. tequ

Proceso de elaboracin del Mezcal

1. Jima

2. Coccin

3. Molienda

5. Destilacin
y Almacenamiento

Mezcal

4. Fermentacin

Alimentos y bebidas fermentados tradicionales

Alimentos fermentados por hongos. Productos de origen indonesio
como el tempeh (soya fermentada por Rhizopus oligosporus) , y
oncom (cacahuate fermentado por neurospora sp.).
Alimentos fermentados por bacterias. Generalmente BAL, gnero
Bacillus.
- Verduras fermentadas. Col (sauerkraut), rbano, pepinos, etc.,
fermentados en salmuera
- Pescados fermentados. Salsas y pastas de pescado usadas como
condimento en el sureste asitico. Kecap de Indonesia, patis de
Filipinas.
- Granos fermentados. Fermentacin por B. subtilis de soya para
producir natto (producto viscoso de olor y sabor penetrante) en
Japn.
- Productos de maz. En frica se fermenta una masa de maz dando
el kenkey. La fermentacin dura 3 d y se ha identificado a
Corynebacterium sp., Aerobacter cloacae y Lb. plantarum

Alimentos y bebidas fermentados tradicionales

- Productos de arroz. El idli es un pan hind a base de arroz y frijol

negro. Se produce cido y gas por fermentacin natural con L.

mesenteroides y S. faecalis.
- Productos de yuca. El gari es yuca fermentada por 3-4 d, se fre y se
mezcla con agua, azcar, especias
Alimentos fermentados por mezcla de hongos y levaduras
el ragi de origen chino se usa como inculo en varias fermentaciones
asiticas. Se hace fermentando harina de arroz y Mucor, Rhizopus,
Candida y Saccharomyces le confieren sabor dulce, un poco cido y
alcohlico
Alimentos fermentados por hongos, seguido de una mezcla de
bacterias y levaduras
Se usa como inculo el tane koji que es un polvo verde-amarillento
conteniendo esporas de A. oryzae y A. soyae, para la primera
fermentacin de la salsa de soya. La segunda fermentacin se hace
con bacterias y levaduras. Otro producto similar es el miso y sake

Algunos alimentos mexicanos fermentados

Nombre
Alimentos de maz
Atole

Descripcin

Estados donde se
consume

Bebida no embriagante (BNE)

preparada con masa de maz, de
tortillas y mazorcas

SLP, Ver, Hgo, Pue,

Gro, DF,Tlax, Mich,
Jal, Oax.

Atole agrio

BNE de masa de maz negro y

fermentado por 4-5 d

SLP, Ver, Hgo, Pue,

Gro, DF,Tlax, Mich,
Jal, Oax.

Charagua

BE a base pulque con almbar, chile ancho y hojas de maz tostado.

Se calienta y luego se fermenta.

SLP, Ver, Hgo, Pue,

Gro, DF,Tlax, Mich,
Jal, Oax.

Pozol

BNE cida. Masa de maz nixtama- Tab, Chis, Yuc, Oax,

Ver, Gro, QR.
lizado fermentada envuelta en
hojas de pltano; diluido con agua

Algunos alimentos mexicanos fermentados (Cont.)

Nombre

Alimentos de
frutas
Colonche

Descripcin

Bebida dulce, gaseosa, ligero olor

butirceo, y bajo contenido alcohlico.
Fermentacin de jugo de tunas

Estados donde se
consume
Chih, Son, SLP,
Zac, Dgo

Tepache

Bebida dulce refrescante. Se obtiene de De consumo

la fermentacin de jugo y pulpa de pia, general en el pas
naranja, guayaba, arrallanes

Chicha

Bebida alcohlica elaborada de pia,

agua de cebada y masa de maz prieto.
Se fermenta por 4 d y se aade dulce,
clavo y canela

Tejuino

Bebida alcohlica obtenida por infusin

del jugo de tunas con cscara de frutos

Mtodos para el estudio de comunidades microbianas

en alimentos fermentados

Clonacin

Denaturing gradient gel electrophoresis (Urea 6M, Formamida)

Gradient Gel Electrophoresis

ARDRA=Anlisis de Restriccin de DNA Ribosomal Amplificado

Temperature
AFLP= Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados
RAPD= Anlisis de DNA polimrfico amplificado al azar
RFLP=Polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin

ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) consiste en amplificar el gen 16S
rRNA seguido de una separacin de digeridos con diferentes enzimas de restriccin. Estos
patrones de restriccin combinados resultan en perfiles ARDRA que permiten diferenciar
entre la mayora de las especies. Por ej. los patrones de restriccin obtenidos con
respectivamente CfoI, AluI, MboI, RsaI y MspI numerados respectivamente 1,1,1, 2 and 3
rinden en combinacin el perfil ARDRA 11123 que es caracterstico de A. baumannii. El
proceso completo de extraccin de DNA (a partir de un cultivo puro), amplificacin del 16S
rDNA, restriccin, digestin y electroforesis en agarosa toma un da (hasta 30 cepas).
Figure 1. Patrones de restriccin obtenido despus de digestion con enzimas de restriccin CfoI,
AluI, MboI, RsaI and MspI para 16S rDNA amplificado de diferentes especies de Acinetobacter.

Perfiles ARDRA de cepas de Acinetobacter previamente

identificadas a especies genmicas por el uso de
hibridacin DNA-DNA.
Los patrones se muestran en la Fig. anterior.

Pattern with enzyme

Genomic species

CfoI

1 (A. calcoaceticus)

2 (A. baumannii)

Strains

AluI

MboI

RsaI

MspI

(N)

ATCC 23055T

RUH 583

27

ATCC 17904

33

ATCC 19606T

1+3

LMD 82.54

Reference strain

AFLP
I paso: digerir DNA genmico con una enzima de restriccin que corte
frecuentemente (MseI, 4 pb secuencia de reconocimiento) y otra que corte
menos fecuentemente (EcoRI, 6 pb secuencia de reconocimiento).
Los fragmentos resultantes se ligan a molculas adaptadoreas extremoespecficas.
Se realiza una amplificacin preselectiva por PCR usando primers
complementarios a c/u de los adaptadores, excepto por la presencia de una
base adicional en el extremo 3, seleccionada por el usuario. Ocurre
amplificacin de solo 1/16 de los fragmentos de EcoRI-MseI.
En un segundo PCR "selectivo", se usan los productos del primer PCR como
plantillas, conteniendo los primers dos bases adicionales, seleccionadas por el
usuario. Los primers para los adaptadores especficos de EcoRI estn
etiquetados por fluorescencia o radioactividad.
El perfil electrofortico revela un patrn (huella digital) de fragmentos
representando cerca de 1/4000 de los fragmentos de EcoRI-MseI.
Primer preselectivo EcoRI GCCTAAGCCGAATTCg
Adaptador
-------------------------------|
Primer selectivo EcoRI GCCTAAGCCGAATTCgtc
Adaptador
--------------------------------|

AFLP
Comparado con RAPD, se requieren menos primers para realizar
escrutinios de todos los sitios posibles.
El procedimiento de AFLP tpicamente detecta ms polimorfismos
por reaccin que los anlisis por RFLP o RAPD.
El anlisis AFLP es especialmente til para el escrutinio de
individuos que se retrocruzan (backcross).
AFLP's, pueden ser marcadores codominantes, como los RFLP's. La
codominancia resulta cuando el polimorfismo se debe a secuencias
dentro de la regin ampliada. Pero debido al No. de bandas
observadas al mismo tiempo, se requiere evidencia adicional para
determinar que un grupo de bandas resulta de diferentes alelos en el
mismo locus.
Si el polimorfismo se debe a la presencia/ausencia de un sitio de
unin al primer, la relacin es dominancia. El alelo que no tiene
unin al primer no ser detectado como una banda.

RAPD
La complejidad del DNA nuclear eucaritico es suficientemente alta para que
aleatoriamente existan pares de sitios complementarios a octa- o decanucletidos de
una tira en la orientacin correcta y relativamente cercanos unos de otros para que
puedan ser amplificados por PCR.
Con algunos decanucletidos escogidos al azar no se amplifica secuencia alguna.
Con otros, productos de la misma longitud se generan a partir de DNAs de
diferentes individuos. Con algunos otros, se dan patrones de bandeo (ver figura)
diferentes para cada individuo de una poblacin.
La bandas variables son comnente llamadas DNA polimrfico amplificado al azar
(RAPD). Tres de las bandas de la figura son bandas RAPD.

RAPDs exhiben polimorfismo y pueden usarse como marcadores genticos

RAPDs son dominantes en el sentido de que la presencia de una banda RAPD
no distingue entre estados hetero- y homozigotos.

Tecnologa Enzimtica
El mercado mundial para las enzimas de inters industrial se ha
estimado en US $ 625 millones (1989) y $ 2 millardos (2004), siendo
Novozymes (55%) y Danisco (30%, Dinamarca) los principales
productores, con un ritmo de crecimiento de 2-3% anual.
En Mxico el mercado estimado es de US $17 millones.
En 1985 se produjeron 80 000 tons de productos enzimticos,
equivalentes a 4 000 tons de protena activa.
La mayora de las enzimas producidas encuentran aplicacin en la
industria de los alimentos: la industria alimentaria ocupa el 62 % (con
la tercera parte usada en panificacin), la textil el 5 % y la industria
de los detergentes el 33 %.
En la industria alimentaria las enzimas se utilizan principalmente para
el procesamiento del almidn, en seguida para la elaboracin de
quesos, jugos, repostera, jarabes fructosados.

Distribucin del mercado mundial de las enzimas

Rao y col., 1998

Selected Industrial Enzyme Companies

AB Enzyme
www.abenzymes.com
Bio-Cat
www.bio-cat.com
Danisco Dinamarca
www.danisco.com
Diversa Corp.
www.diversa.com
DSM Food Specialties USA www.dsm.com
Enzyme Development Corp. www.enzymedevelopment.com
Genencor Internationala
www.genencor.com
National Enzyme Co.
www.nationalenzymecompany.com
Novozymesb
www.novozymes.com
a

Second largest manufacturer

b
First largest manufacturer

Enzimas en la industria

Kaneka ha encontrado una formiato

deshidrogenasa robusta para el
reciclaje de cofactores en procesos
de oxidacin-reduccin.

Dowpharma ha usado su tecnologa

de expresin Pfenex para producir
grandes cantidades de enzimas.

Uso Industrial de enzimas: Panificacin

En panificacin, las amilasas, celulasas y

proteasas ayudan a procesar el pan y la
masa para mejorar las calidades de:
textura, volumen, estabilidad y estructura
de la miga.
La harina de trigo contiene <1% de
azcares fermentescibles, Los principales
carbohidratos son almidn y pentosanos.
La harina contiene ~5-7% del almidn
daado el cual es susceptible de ataque
enzimtico. Las - y -amilasas actan
sobre sta fraccin de almidn
produciendo maltosa.
La harina quebrada y molida generalmente
Una dextrinizacin excesiva produce una
tiene poca -amilasa y se aade
comnmente a la harina, usualmente como miga con textura suave, pegajosa en la
hogaza terminada. La -amilasa tambin es
una preparacin fngica.
efectiva para retrasar el envejecimiento del
pan.

Uso Industrial de enzimas: Panificacin

La harina de trigo contiene tambin ~

2.5-3% de pentosanos, tal como
arabinoxilanos que representan cerca
de un cuarto de la absorcin de agua
de la masa. Los pentosanos insolubles
deprimen el volumen de la hogaza y
hace una estructura de la miga mas
abierta. Existe actualmente mucho
inters en usar xilanasa en
panificacin para reducir el contenido
de pentosano insoluble.
Las proteasas (de A. oryzae) se
aaden a menudo para relajar la masa,
resultando en mayor mobilidad y
extensibilidad. Esto es probablemente
debido a efectos en las fracciones de
gluten o gliadina de las protenas. Una
acccin excesiva de las proteasas
causa pegajosidad en la masa.

Uso Industrial de Enzimes: Panificacin

Otra adicin comn a los sistemas

de masa es la lipoxigenasa.
Esta enzima oxida los cidos
grasos cis, cis-polienoicos a
hydroper-xidos, oxidando
conjuntamente los grupos -SH de
las protenas a grupos -S-S-,
aumentando la resistencia de la
fraccin del gluten en las protenas
de la masa.
Tambin acta sta enzima como
blanqueador ya que decolora los
carotenoides de la harina.
La enzima es usualmente aadida
en forma de harina de soya
desgrasada.

Soybean lipoxygenase

Uso Industrial de enzimas: Lipasas en la Industria Lctea

Se usan principalment en la IL para la mejora del
sabor y en la maduracin de quesos.

Los cidos grasos libres dan el sabor y aroma

caracterstricos de los quesos: liberacin de
cidos grasos de cadena corta (C4 y C6) dando
sabores fuertes y c. grasos de cadena media
(C12 y C14) dan origen a sabores a jabn.
Los c. grasos pueden ser biotransformados
por la poblacin microbiana del queso,
conduciendo a la formacin de compuestos de
sabor como acetoacetato, beta-ceto cidos, metil
cetonas, steres y lactonas.
Tradicionalmente lipasas animales se han
usado en los quesos, con cada especie resultando
en un perfil de sabor caracterstico.
Recientemente, se han introducido lipasas
microbianas de Mucor miehei, Aspergillus niger,
y A. oryzae.

Queso
Romano
Feta

Lipasa
cabrito/cordero pregstrico
Mucor miehei

Mozzzarella Ternera/cabrito pregstrico

Parmesano
Provolone
Cheddar
A. niger
Manchego A. oryzae
Azul

Uso Industrial de enzimes: varios

Las pectinases ayudan a romper las paredes ceulares de
las plantas, permitiendo ms eficiente extraccin de
jugos para bebidas de fruta y vino, y mejorar el proceso
de clarificacin.
Una gran variedad de enzimas especializadas se han
usado para diferentes productos. P. ej. pueden usarse
proteasas especficas para hidrolizar compuestos
alergnicos en soya o leche, permitindoles un uso
seguro como aditivos alimentarios.
Las enzimas son tambin valiosas en la produccin de
sabores y fragancias para mejorar la calidad de los
alimentos.

Enzimas y microorganismos con potencial en

la industria de alimentos
Termolisina

Sntesis de aspartamo

(B. thermoproteolyticus)

Pululanasa cida

Sacarificacin de almidn

(B. acidopullulyticus)

Fructosil transferasa

Nuevos disacridos

(B. subtilis)

-amilasa cida
(B. stearothermophilus)

Ligninasas
(Arthrobacter sp.)

Varias
(Irpex lacteus, Formitopsis pincola)

Produccin de jarabes de
maltosa
Degradacin de cscara de
cacahuate
Generacin de aroma en
quesos

Produccin industrial de aminocidos

La produccin microbiolgica de aminocidos se basa en la
conversin de diferentes fuentes de carbono, tales como melaza,
glucosa, hidrolizados de almidn, azcar, etc. Pero no en todos
los casos se usa la fermentacin comercialmente.
Mtodo
Ejemplo
Fermentacin (glucosa/melazas) Acido L-glutmico, L-lisina
Enzimtico (preparacin de
Ac. L-asprtico de ac. fumrico
precursores)
L-alanina de c. L-asprtico
Sntesis qumica
DL-metionina
Extraccin
L-cistena de pelo humano y
de equino

Aplicacin de tcnicas modernas de biotecnologa

para la produccin de aminocidos
Metodologa

Aminocido

Cultivo continuo
L-lisina
Cultivo continuo en cepa transformada L-triptofano
genticamente
Ingeniera gentica
L-treonina, L-fenilalanina
Clulas inmovilizadas/sistema continuo L-serina
Nueva cepa, sustrato barato,
L-fenilalanina
ingeniera gentica
Se han usado tcnicas de ADN recombinante eficientemente en
Brevibacterium flavum (Lys) y Corynebacterium glutamicum (Glu),
con el fin de tener cepas mutantes, con caractersticas regulatorias
deseadas e hiperproductoras de aminocidos.

Aminocidos usados en la industria alimentaria

Aminocido

Prod. mundial/
ao (tons)1984

Usos

Utilidad

L-Glu (GMS)

~1 milln
(2004)

Varios

Reforzar sabor, ablandador

de carne

L-Asp y Ala

5,000 (Q)

Jugo de frutas

Enriquecer el sabor

Gli

6,000 (sntesis
qumica, Q)

Alim. Endulzados
Nutricin humana

Mejorar sabor, punto de

inicio en sntesis orgnica

L-Cys

700
(Extraccin)

Pan, jugos de
frutas

Mejorar la calidad;
Antioxidante

L-Try + L-His

400

Varios, leche en
polvo

Antioxidante, aditivo
nutritivo

L-Lys

70,000

Pan (Japn), Alim. Aditivo nutritivo

animal

L-Met
DL-Met

150 enzimtica
120,000 (Q)

Prods. de soya;
Alim. animal.

Aditivo nutritivo, uso en

hepatitis (teraputico)

Valor de mercado estimado (2004): $ US 3.5 billones; Ajinomoto (30%), ADM y BASF. 52%
alimentos, 30% alim. animal, 18% especialidades qumicas y farmacuticas).

Producccin de aminocidos por enzimas

inmovilizadas
DL-R-CHCOOH + H2O Aminoacilasa L-R-CHCOOH + RCOOH +
NHCOR
NH2
D-R-CHCOOH
Acetil D,L-aminocido
L-aminocido
NHCOR
Acil-D-aminocido

Racemizacin
Tanabe (Japn) en 1969 desarroll un proceso continuo
utilizando aminoacilasa de A. oryzae inmovilizada en DEAESephadex.
Con reactores de 1 m3 se obtienen 200-250 kg de aa/da.
Se producen por este mtodo L-Ala, L-Met, L-Phen, L-Trp, LVal (520 ton/mes).

Aumento de la productividad de Aminocidos

La fig. siguiente muestra las rutas bioqumicas y los mecanismos
regulatorios de metabolitos producidos por m.o. y mtodos de
promocin de sobreproduccin de los metabolitos
Para tener una sobreproduccin, el aa debe excretarse de la clula, la
cual deber seleccionarse de entre otras con cambios en sus
mecanismos de control
Para el cido glutmico (GLU), la velocidad de crecimiento de las
bacterias (Brevibacterium lactofermentum Corynebacterium
glutamicum), aumenta por la adicin de biotina al medio. Pero esto
reduce la permeabilidad de la membrana para GLU disminuyendo
su sntesis y acumulacin.
La adicin de penicilina c. grasos saturados (C16, C18) al cultivo
restaura la permeabilidad de la membrana, resultando altos
rendimientos y acumulacin de GLU

Mtodos tpicos para promover la sobreproduccin de metabolitos

Smbolos
Produccin
Puntos de Control S: Sustrato
Inhibicin
represin

Aceleracin
Desregulacin
limitacin

A y B: Intermediario
C: Subproducto
P: Producto
E: Enzima

Funcin

1: Activacin
crecimiento celular
2: Aceleracin de
la exc. de producto
3: Elim. de la inhib
por retroaliment. y
represin
4: Enriquecimiento
de la activ. enzim.
5: Reduc. de la ac.
enz. que conduce a
subproductos

Ruta y control de la produccin de Lis en mutantes

auxotrficos de C. glutamicum
auxtrofo cuando slo
es capaz de proliferar en
Oxaloacetato
Aspartato
un medio de cultivo si a
ste se ha aadido
Aspartato cinasa
alguna sustancia
especfica, que el tipo
Aspartil fosfato
silvestre, llamado
prottrofo no requiere,
porque es capaz de
Aspartato semi-aldehido
sintetizarla.

Glucosa

Mutante no tiene homoserina

deshidrogenasa

Homoserina

Dihidropicolinato
Diaminopimelato

Metionina

Treonina

Lisina

Penicillin yields raised from 0.15 to 7 g/L by spontaneous or induced mutations

Aminocidos producidos por cepas mutantes

La produccin de L-LIS se obtiene de cepas productoras de LGLU donde la primera enzima de la ruta biosinttica (Aspartato
cinasa; AC) se regula por unos cuantos metabolitos tales como
TRE y LIS a travs de una inhibicin por retroalimentacin
concertada (el efecto de los moduladores es ms que aditivo).
Se han obtenido mutantes regulatorios de C. glutamicum donde
la AC es resistente a la inhibicin por LIS, y la enzima
homoserina deshidrogenasa se ha eliminado genticamente, por
lo cual no se produce TRE ni MET.
Suministrando bajos niveles de TRE se han producido
industrialmente 170 g/L de LIS y 0.54 mol LIS/mol glucosa
Produccin anual de LYS: 300,000 tons ($ US 600 millones)

Principales polisacridos microbianos de inters comercial

Polisacrido

Fuente

Composicin

Xantana

Xanthomonas
campestris

Unidad estructural: glucosa, manosa, c.

glucurnico (2:2:1), PM~2x106 Da. Se
produce a pH>5.0, 28C, en quimiostato
con conds. limitadas de N

Dextrana

Leuconostoc
mesenteroides

Glucosa con enlace -1-6, ramific. 13, 1-4 (5%). nSacarosa Dextrnsacarasa
nfructosa+dextrana PM:0.51x106 Da.

Alginato

Azotobacter
vinelandi

cido gulurnico y manurnico

conectados por enlaces -1-4 y -1-4.
Sustituyentes acetil. 50-100,000
residuos.

Pseudomonas
aeruginosa

Curdlano

Alcaligenes
faecalis

Glucano con enlaces -1-3

Fermentation process for the production of microbial xanthan

Xanthomonas campestris
inoculum (<0.2%)

Microbiological media
Aerobic batch fermentation
(Fed & continuous culture
systems are also patented)

a)

1-5% carbohydrates
(glucose, sucrose, corn starch
hydrolyzates, etc.)
b)
0.05-0.1 % nitrogen
(yeast extract, peptone,
ammonium nitrate or urea)
c) Salts (0.27% NH4Cl, 0.5%
K2HPO4, 0.01% MgSO47H2O,
0.09% NH4NO3, etc.

48 h, pH 7.0

Xanthan recovery (25-30 g/L)

(Precipitation, with isopropanol or methanol. This step also kills the culture)

Drying (vacuum or spray) and grinding

Xanthan
(12% moisture; 9-10% ash)

Flow diagram of the production process of microbial alginate

Principales aplicaciones de los alginatos

rea de
aplicacin

Funcin

Ejemplos

Industria de
bebidas y
alimentos

Estabilizante
Espesante
Gelificante

Estabilizacin de espumas
Suspensin de frutas, espesante
de salsas
Reconstitucin de alimentos

Industria
farmacutica

Estabilizante
Gelificante

Emulsiones para cosmticos

Impresiones dentales, fibras y
pelculas, cubiertas para tabletas.

Otros usos

Espesante

Tintas para impresin, inmovilizacin de clulas y enzimas

Biopolmeros producidos por microorganimos con

potencial aplicacin industrial
Biopolmero
Celulosa bacteriana
(Acetobacter xylinum)
Gelana
(Pseudomona elodea)
PS-10 (Kelco, EUA)
(Erwinia tahitica)
Emulsana
(Acinetobacter
calcoaceticus)

Caractersticas
Pelcula extracelular compuesta de
microfibras de celulosa
Polmero extracelular compuesto de glucosa y
rahmnosa. Geles termoreversibles. Producido
por Kelco (EUA)
Polmeros de glucosa, manosa, fructosa, c.
glucurnico. Sustitutos de hidroxi-etilcelulosa
en pinturas
Lipopolisacrido que funciona como
emulsificante

Compuestos Aromticos y Sabores

La legislacin trata de limitar el uso de sabores y aromas artificiales
en alimentos y bebidas.
Aumento en el rechazo del pblico de alimentos (ingredientes)
qumica o sintticamente producidos.
Sabores naturales encuentran uso ms amplio en alimentos; de
plantas (a menudo en cantidades pequeas o en forma enlazada), o de
origen microbiano.
Sabores microbianos puede venir de biosntesis (sntesis de novo, de
clulas en crecimiento o de su metabolismo secundario; bajos
rendimientos) o de biotransformaciones (modificaciones especficas o
interconversiones de estructuras qumicas; mayores rendimientos y
mas econmicas).
Los microorganismos o enzimas pueden producir ya sea sistemas de
sabores complejos multicomponentes o compuestos individuales de
sabor.
El etil-butilato microbiano (sabor a frutas): $ 180/kg, sinttico: $ 4/kg
(Hercules, Inc.)

Compuestos aromticos producidos por microorganismos

Microorganismo

Aroma

Compuestos

Ceratocystis
moniliformis

Afrutado: pltano,
durazno, pera, rosa

3-metil butiril acetato, - y

-decalactona, geraniol,
citronelol, nerol, linalol,
geranil acetato

Mycoacia uda

Afrutado: almendras,
pasto

p-metilacetofenona, ptolil-1-etanol

Penicillium
decumbens

Pino, rosa, manzana,

hongo

3-octenona, 1-octen-3-ol,
-feniletanol, nerodiol

Sporobolomyces
odorus

Durazno

Trametes odorata

Afrutado: miel, rosa,

ans

Metil fenil acetato, geraniol, nerol, citronelol

Trichoderma viride

Coco

6-pentil-2-pirona

Vanillin
Principal flavor component of vanilla, which is widely
used in flavor formulations. US $ 2,500/kg flavor solids.
Extracted form pulped wood (vines), and also via microbial
biotransformation (also considered natural)
Produced from eugenol or isoeugenol by Serratia, Klebsiella
or Enterobacer, with a yield of 3.8 g/L.
Can also be obtained form callus cells of Vanilla fragrans or V.
phaeantha. Higher yields may be obtained by immobilized
culture systems with continuous removal of flavor
components; passing them through activated charcoal and
eluting with 50% ethanol.
COO
CHO
Eugenol
Ferulic acid
Vanillic acid
Vanillin
O

-lactone
R

OCH

-lactone
R

OH

-ionone (off flavor in oxidized freeze-dried carrots)

Flavor enhancers: production of 5 nucleotides

by enzymatic hydrolysis of RNA
Yeast (C. utilis, S. cerevisiae)
-Extraction by hot alkaline saline (5-20% NaCl, 8 h, 100C)
-Precipitation by HCl or ethanol
-dry

RNA (70-90 %
purity)

-Exonuclease P1 (Penicillium citrinum) or

-Streptomyces aureus mutant [5 nucleotidase & phosphatase (-)]
-pH 5, 4 h, 65C

5GMP/5AMP/5CMP/5 UMP mixture

-Remove CMP/UMP by adsorption on activated charcoal

-Elute adsorbed AMP/GMP with methanol/ammonia

5AMP/5GMP mixture

- Deamination of AMP by adenyl deaminase (A. oryzae)

IMP/GMP mixture

-purification by anion exchange chromatograpy

5 IMP + 5 GMP (1.5-3 %)

NUCLEOTIDES

Monosodium Glutamate (MSG)

Fermentation of glucose and sucrose as carbon and energy
sources by C. glutamicum.
C. glutamicum accumulates -ketoglutaric acid (AGA)
because it is uncapable of performing a complete TCA cycle.
AGA is directed towards the production of glutamic acid
Biotin limiting conditions leads to more production of GLU
Limiting biotin reduces phospholipid synthesis and
membrane permeability, but it is restored by adding 0.65
mL/mL of oleic acid (18:1).
Using Brevibacterium divaricatum, 50-60% of the C source is
converted to GLU, at pH 7.8, 38C, in a fed batch process,
after 30-35 h, with a yield of 100 g/L.

Sntesis de Aminocidos y ciclo de Krebs

Flavor enhancers
5 GMP + 5 IMP: their maximum influence in savory flavor
is on fish and vegetable proteins. Less effect on meats,
cereals, milk, eggs.
MSG: Most profound influence on: meat, followed by fish,
vegetables, cereals, egg, milk.
UMAMI compounds have a most pronounced effect on
chicken, and weaker enhancement on beef, turkey and pork
Savory ingredients market: $ US 1 billion/year. HVP,
Autolyzed yeast extract, soya bean sauce, MSG, I+G.

Clasificacin de los colorantes

I. Naturales
1.- Orgnicos
a) Vegetales: Antocianinas, betalanas, carotenoides,
flavonoides, clorofila, otros
b) Animales: Acido carmnico (de grana cochinilla), cido
kermsico (obtenido de las hembras fecundadas de los insectos Kermes ilicis
L. y Kermes vermilio Planchn, parsitos de la encina (Quercus ilex L.) y de la
coscoja (Quercus coccifera L.), respectivamente), otros

2.- Inorgnicos
a) Minerales: Azul ultravioleta, dixido de titanio,
negro carbn
II. Sintticos
1.- Orgnicos: Azoicos, antraquinonas, difenilmetano, otros

Pigmentos alimenticios de origen natural

Componente
Tetrapyrroles
Clorofilas
Grupos Hemo
Carotenoides
Caroteno
Xantofilas

Fuente
Vegetales verdes, de hoja
Carnes
Zanahorias (-caroteno), tomates (licopeno),
Chiles del gnero Capsicum (capsantina),
salmon (astaxantina), zempaschitl (lutena)

Benzopiranos
Antocianinas
Uvas (enocianina), bayas, manzanas
Flavonas y flavanonas Nueces, piel de cebolla, t
Betalanas
Betacianina
Betabel
Betaxantinas
Betabel
Pigmentos derivados de Procesos
Caramelo
Miel, jarabes, refresco de cola, licores
Melanoides
Jarabes

Produccin de monascina por diferentes tcnicas

Cepa
Cultivo Sumergido
Monascus anka

Condiciones de cultivo

Polvo de arroz 3%; MgSO47H2O 0.1%,

KNO3 0.15%, KH2PO4 0.25%, 96 h a 30C
M. kaolinus S-11
Idem, 72 h a 35C
M. anka V-204Polvo de arroz 5%, Glutamato monosdico
0.15%, MgSO4 7H2O 0.1%, KH2PO4
0.25%, 144 h a 30C
Cultivo slido
M. anka
Polvo de arroz 168 h, 30-40C
M. anka
Harina de pan, 192 h, 32C
M. kaoliang R 10847 Harina de Mantou 144 h, 32C

Historia de los procesos de hidrlisis para la obtencin de glucosa

Epoca

Materia prima
(almidn 30-45% materia seca)

Hasta 1950s

Acidificacin (HCl, pH 1.5). Hidrlisis (T=150C).

ED= funcin del tiempo de hidrlisis.
Con 45 min: ED =90 con 86% glucosa

Hasta 1960s

Acidificacin (HCl, pH 1.5). Hidrlisis (5-10 T=150C;

ED= 12-20). Reaccin con amiloglucosidasa (pH=4-4.5,
T=60C, 48-100 h. J. gluc: ED=96-98 (92-96% glucosa)

Entre 1960s y 70s Licuefaccin con -amilasa (pH5.5-7.0, T=70-90C),

ED=20-30. Sacarificacin con amiloglucosidasa (pH=44.5; T=60C, 48-100 h). J. de gluc: ED=96-98 (92-96%
glucosa.
Despus de 70s

Licuefaccin -amilasa termorresistente (6 a 105C, 2 h

a 95C), ED=8-12. Sacarificacin con amiloglucosidasa
(pH=4-4.5; T=60C, 48-100 h). J de gluc: ED=96-98
(92-96% glucosa)

Almidn
H2O
Enzimas
(10%)
CaCl2

Enzima
(90%)

atmsfera

Vapor

Cocedor jet
(140C, 30 s)
Bomba de desplazamiento positivo
ED = 8-15
90-95C, 2 h

Sistema de licuefaccin con -amilasa

termorresistente

Process flowchart
for dextrose production

(50-55% solids)

Glucoamilasa de A. niger o
Rhizopus. El proceso puede ser por
lotes o continuo.
El rendimiento de glucosa de una
suspensin de almidn (32-35 %
p/p ) es 95-96%.
El rendimiento puede aumentarse
por sacarificacin a 10-12 % (p/p)
de slidos y usando pululanasa,
resultando en aumentos del 0.5-1%
En 1998: dextrosa anhidra $
1.12/kg; dextrosa monohidrato $
0.51/kg; jarabe de maz $ 0.21 /kg

Jarabe de maz de alta fructosa (HFCS)

La conversin enzimtica de glucosa a fructosa se report en 1957 y fue

patentada en 1960 por la compaa CPC (USA)
Un desarrollo Japons usando GI de Streptomyces logr la primera
produccin comercial de HFCS en 1967 en USA (por lotes).
Los problemas que evitaban su competencia con sacarosa y azcar invertido
incluyeron
- Alto costo de la enzima
- Formacin de productos coloreados
- Produccin de azcar no metabolizable (D-psicosa)
- Inhibicin enzimtica por minerales (Ca2+)
La GI inmovilizada re-utilizable permiti una produccin continua en 1972
Este fue el primer uso a escala industrial de enzimas inmovilizadas, cuyas
caractersticas son (40-50 %w/w) :
- Reduccin significativa de costos de produccin
- Costos competitivos con la produccin de sacarosa

(30-40% dry solid;

pH 6-6.5)

-amylase
Ca2+ (100-200 ppm)

Mg2+activator

DE=94-98; 31% TS

60C, pH 7.0, de-aeration

(87% glucose, 5% F)
Resina fuertemente
cida cationica, Ca2+,
retrasa fructosa y no Separation
retiene DP>3-4
C treatment

70-85% TS

US HFCS producers

HFCS
La produccin anual global de HFCS es 10 millones de tons, en
base seca (1999).
Para esto se utilizan 1500 tons de GI inmovilizada (GII; 1999)
Los mayores productores de GII son Genencor (Danisco) y
Novo.
La GII de Genencor se produce por adsorcin de la enzima
purificada en resinas de intercambio inico, reticulada con
polietilnimina y glutaraldehdo, y granulada por extrusin.
La productividad es de 12-15 tons de HFCS (bs)/kg GII, con
t=1900-3600 h.
La GII de Novo (Sweetzyme T) se prepara por reticulacin de
clulas de Streptomyces murinus con glutaraldehdo, seguido de
extrusin
Se usa en biorreactores de 1.5 m(d)x5 m(h) a 60-65C, pH 7.58.5 (1 h reaccin; 0.5 tons/da) para producir jarabe con 42% de
fructosa, que por fraccionamiento se convierte a 55% de
fructosa.

Catalizadores formulados con Glucosa Isomerasa

Compaa

Actividad
(IGIU/g)*

Catalizador

t1/2 & (hrs)

Miles (Takasweet)

171

Clulas de Flavobacterium
aborescens, extruidas y reticuladas

1800

Gist-Brocades

675

Enzima de Streptomyces
missouriensis en gelatina
reticulada con glutaraldehdo

1500

(MGIU/L)
CPC Int. Inc.

1487

Enzima en DEAE-celulosa

Novo A/S

200

Clulas de B. coagulans
entrecruzadas

1500

Enzima de Streptomyces
Rubiginosus en DEAE celulosa y
poliestireno con TiO2

1200

Finnsugar
(Spezyme, IGI)

*IGIU: Cantidad de enzima que produce un mol de fructosa por minuto

&
Tiempo de vida media, bajo condiciones ptimas de reaccin.

cido Ctrico
Su produccin rebasa las 3x105 tons/ao
Pfizer tiene la mayor planta con capacidad mayor a 8x10 4
tons/ao
70% es consumido por industria de alimentos y bebidas,
donde representa el 55-65% del total de acidulantes
18% se dirige a industria farmacutica
Se produce por Aspergillus y Penicillium, aunque tambin
levaduras y bacterias pueden acumular c. ctrico a partir de
glucosa en un menor tiempo de fermentacin.
Su produccin requiere de una operacin defectuosa del
CAT y su transporte fuera de la clula.

Degradacin de glucosa a cido ctrico a travs de

gliclisis y ciclo de los cidos tricarboxlicos

Produccin de cido ctrico (AC)

Todas las reacciones del CAT excepto la condensacin del
AC ctrico son reversibles.
Se bloquea la transformacin del AC reduciendo a un
mnimo la presencia de iones fierro (cofactor de aconitasa)
Se interrumpe entonces la formacin de los dems
intermediarios esenciales en biosntesis, por lo cual se
requieren reacciones adicionales llamadas anaplerticas
de reabastecimiento que regeneren los intermediarios del
CAT, aprovechando la reversibilidad del ciclo
Tres reacciones anaplerticas pueden ocurrir

Reacciones
Anaplerticas
del ciclo de
Krebs (CAT)

 La nica reaccin anaplertica comprobada en A. niger es la

carboxilacin del piruvato, permitiendo la fijacin del CO 2
removido de piruvato durante su descarboxilacin a acetil-CoA
A partir de glucosa se han tenido rendimientos de 70-90%
(w/w), con el mximo terico de 112%.
La participacin del ciclo del glioxilato durante la
fermentacin ctrica de A. niger es controvertida y solo se ha
comprobado en levaduras.
Para evitar esta reaccin:
Oxalacetato
oxalacetato hidrolasa oxalato + acetato
Se conduce la reaccin a pH 3.5, al cual sta enzima no acta
Los altos niveles de AC inhiben la fosfofructocinasa, la cual se
protege en presencia de iones NH4+ a concentraciones
superiores a las fisiolgicas

 La deficiencia de Mn2+ permite la acumulacin de iones NH4+,

modificndose la sntesis normal de lpidos
La consecuencia de esto es la presencia de membranas celulares
defectuosas con mayor permeabilidad al AC, as como un mayor
flujo de C hacia el AC como resultado de la disminucin de lpidos
en los componentes celulares
Cuando se usan levaduras para producir AC, la fermentacin es
independiente de Mn2+, requieren de un pH menos cido (4.5-6.5),
requieren de tiamina y se acumula AC en condiciones de limitacin
de N

Aspectos Nutricionales
La produccin de AC est relacionada inversamente con el
crecimiento celular
Los carbohidratos deben ser simples : melaza (14-240 g/L); N: sales
de amonio (0.1-0.4 g/L); 0.1-0.2% de fosfato, Fe 2+ y Mn2+ en bajos
niveles, por lo que se debe remover el Fe de las melazas (EDTA,
polietilenamina).

Aspectos Fisicoqumicos
Temperatura de 25-30C, ya que a T mayor se acumula c. oxlico
pH inicial 3.5-4.5, pero se mantiene en 2 durante la etapa productiva

Cintica de la
fermentacin para
producir cido
ctrico por A.
niger.
La fermentacin
es sumergida,
aerbica en
grandes biorreactores de acero
inox. en un medio
deficiente en
hierro.

Diagrama simplificado del proceso de produccin de cido

ctrico por cultivo sumergido a partir de melazas

Microorganismos usados para elaborar productos valiosos

en la industria de alimentos

Gene encoding
protein of interest
Sequence encoding
6 His in frame with
cloned ORF

Clone producing His-tagged protein

Expression vector

Tagging Proteins for Affinity

Purification

Ni Affinity
Column

Clone producing
His-tagged protein
of Interest

Crude
Extract

EluentCompetes for
Ni Matrix

Ni Column

Affinity
Chromatography

Pure
Protein

PAGE Results of a
Protein Purification

Separacin de DNA por

Electroforesis en Gel
Propsitos
Herramienta analtica
- Identifcar o conocer algo acerca de un fragmento
particular de DNA: tamao, topologa, patrn de
restriccin, pureza, concentracin
Herramienta Preparativa
- Separar un fragmento de inters de una mezcla
compleja de fragmentos de DNA.

Gel Electrophoresis

El Gel Tamiza las Molculas Pequeas Molculas Migran ms Rpido

DNA de Alto PM,

incremento en la
friccin

DNA de bajo PM,

disminucin en la
friccin

+
Tiempo

Electroforesis en Gel
Molculas cargadas se movern en un campo
elctrico
Se usa una matriz de gel para tamizar las
molculas
Agarosa floja; amplio rango de separacin
Acrilamida ms apretada; estrecho rango de
separacin

El movimiento a travs del gel depende de la carga

y forma NO de la masa
Para que el movimiento sea proporcional a la masa
(PM) la molcula debe tener un relacin
carga/masa constante.

Electroforesis en Gel
El DNA tiene 2 cargas negativas (fosfato
disteres) por par de bases
Todas las molculas lineales de doble tira
del DNA tienen (esencialmente) la misma
forma
Por tanto el movimiento es proporcional a
la longitud (MW)
Distancia 1 / log (MW)

Gel Electrophoresis
DNA cargado en pozos

Movimiento
de fragmentos
de DNA

+
A

Bromuro de Etidio
Colorante para visualizar DNA
+

NH3

+H N
3

Fluorescencuia se
incrementa por
enlace al DNA

Absorbe a ~520nm
Fluoresce a 605nm
(Fluoresce naranja
bajo luz UV)

Bromuro de Etidio Intercalado

en la hlice del DNA

XbaI

KpnI

XhoI

ApaI

Marker
48
33
25
17
10

Anlisis de
Restriccin

Informacin de Electroforesis en Gel

Tamao

Distancia migrada es
inversamente
proporcional al logPM (o
log(# pb).

Cantidad
- Enlace del etidio es
directamente
proporcional a la
MASA del DNA

Quantitation of DNA by Ethidium Bromide

Marker DNA Staining
Known size
and quantity

10 Kb

1011 Molecules x 10 Kb
= 1012 Kb
= ~100 ng

5 Kb

2x1011 Molecules x 5 Kb
= 1012 Kb
= ~100 ng

1 Kb

1012 Molecules x 1 Kb
= 1012 Kb
= ~100 ng

Clicker Question
You have purified your favorite plasmid
from a strain of E. coli. You run an
agarose gel with a standard of known
concentration to quantitate the DNA. But
what about protein contamination?
Does the presence of contaminating
protein interfere with this procedure?
A.Yes
B.No

La Densidad de la Matriz Define

la Resolucin del Gel
Porcentaje de Agarose

Resolucin de molculas
muy grandes de DNA por
Electroforesis en Gel de
Campo Pulsante
180 KiloBP

90 KiloBP
45 KiloBP

El campo elctrico se
reorienta constantemente
mientras se corre el gel.
Consecuentemente, las
molculas de DNA tienen
que reorientarse.
Pequeos fragmentos se
reorientan ms
fcilmente.

Digerir muestra de DNA

Con enzimes de restriccin

Southern Blot

Electroforesis
Transferir DNA
a membrane

Aadir fragmento de DNA

etiquetado e hibridizar

Inventado por E. Southern

Oxford University

EcoRI

Strain 1

EcoRI

Strain 2

EcoRI

EcoRI

Probe

sonda etiquetada
se hibrida a la
secuencia
complementaria
3-TCCGTAATC**** -5

5CCGGCTAAC -3
5AGGCATTAG -3
3-TCCGTAATC**** -5
5TTTAACGCG -3

Premio Nobel Qumica 2006

Roger D. Kornberg, a structural biologist at Stanford University, has been awarded

the 2006 Nobel Prize in Chemistry for his studies on the molecular basis of
eukaryotic transcription, the process by which the genetic code of DNA is
converted into messenger RNA for later translation into proteins.

Kornberg has used the yeast Saccharomyces cerevisiae as a model

eukaryotic organism. He developed an in vitro yeast transcription system
that contained highly purified RNA polymerase II and five helper proteins
known as general transcription factors. However, the system did not
respond to the addition of other transcription factors known to activate
specific genes in cells. This observation led Kornberg to discover a
protein complex known as Mediator, which serves to transfer signals from
gene-specific transcription factors to RNA polymerase II and the general
transcription factors.

Mighty Machine In this ribbon structure of

part of the yeast RNA polymerase II complex,
the clamp protein (yellow) closes on the DNA
(blue and green) and growing RNA transcript
(red). The bridge helix is shown in green and
the complex's active site magnesium ion is
shown in pink.

In 2001, Kornberg and his colleagues published high-resolution X-ray crystal

structures of a 10-subunit yeast RNA polymerase and of a complex consisting of
RNA polymerase, template DNA, and product RNA (Science 2001, 292, 1863
and 1876).
These structures showed that the two largest subunits of RNA polymerase lie in
the center on either side of a nucleic acid-binding cleft, with the smaller subunits
on the outside. The cleft is bridged by an -helix that acts like a ratchet to move
the growing RNA transcript out of the active site during RNA synthesis.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Es un mtodo para la amplificacin rpida de DNA in vitro que
produce grandes cantidades de genes especficos para clonar,
secuenciar o para propsitos de mutagnesis
Se requiere conocer una parte de la secuencia nucleotdica del
gen que se desee amplificar, stos son los iniciadores, a partir de
los cuales se sintetiza la hebra complementaria por la DNA
polimerasa (Thermus aquaticus [Taq] polimerasa)
1. Dos oligonucletidos (degenerados o no) iniciadores en los
extremos del DNA blanco se fabrican en un aparato de sntesis de
oligonucletidos y se aaden en mucho exceso al DNA blanco
desnaturalizado por calor
2. Cuando se enfra la mezcla, se asegura que el exceso de
iniciadores (primers), relativos al DNA blanco, se hibridicen a las
hebras separadas con los iniciadores y no entre ellas
(alineamiento)

3.

La DNA polimerasa extiende los iniciadores usando las hebras

blanco como plantilla
4. Despus de un tiempo adecuado de incubacin, la mezcla se vuelve
a calentar para separar las tiras, y se contina con este ciclo unas
20-30 veces (calentamiento, alineacin, extensin)
Los productos de extensin de un iniciador, pueden servir como
plantilla para otro iniciador en el siguiente ciclo
Cada ciclo ( aprox. 5 min) involucra:
1. Desnaturalizacin por calor 93C, 5 min (despus de 1er ciclo: 1 min)
2. Enfriamiento para alineamiento de iniciadores 45C, 1 min
3. Extensin de iniciadores 70C, 1 min. Despus del ltimo ciclo se
deja 10 min para finalizar las extensiones
En cada ciclo se duplica el contenido del DNA blanco original,
obtenindose en 20-30 ciclos aumentos en 106-109 de la secuencia
blanco

PCR para amplificar secuencias de DNA.

(a) calentamiento del DNA blanco y exceso
de dos iniciadores, uno complementario de
una tira y el otro de la tira complementaria,
ms DNA polimerasa. (b) alineamiento y
extensin, originndose dos tiras hijas. (c)
nuevo ciclo. (d) 2a copia de DNA. (f)
Efecto de 20 ciclos PCR en un DNA blanco
conteniendo 10 copias inicialmente (la
grfica es semilog)

 La Taq polimerasa no tiene funcin correctora, por lo cual

comete errores en la extensin
Cuando la exactitud es crucial, puede usarse la DNA
polimerasa del arqueano Pyrococcus furiosus (Top=100C;
Pfu), ya que tiene actividad correctora
La amplificacin in vivo tomara varios das, por lo cual los
termocicladores son muy tiles.
La DNA polimerasa termoestable se ha clonado en E. coli y
se produce en grandes cantidades
El PCR es muy til en la clonacin de DNA porque si se
conoce la secuencia en sus extremos puede amplificarse antes
de clonar
Como herramienta para la secuenciacin de DNA, el PCR
produce grandes cantidades de DNA que pueden usarse como
plantillas

 El PCR puede producir grandes cantidades de DNA mutado

Usando oligonucletidos con algunas bases que no se
hibridizarn como iniciadores, pueden introducirse
mutaciones. Los mutantes puede entonces amplificarse por
PCR
El DNA mutado puede usarse para transformar clulas,
formando derivados mutantes
El PCR puede usarse para estudios comparativos
evolucionarios, amplificando genes de diferentes fuentes,
donde el DNA ya se ha clonado y secuenciado, usando
iniciadores que no sean perfectamente complementarios, pero
que sean regiones altamente conservadas
Con los iniciadores adecuados, puede identificarse una sola
clula bacteriana, en presencia de otras, en una muestra
Puede usarse para identificacin de individuos (huellas
dactilares de DNA)