UNIVERSIDAD AUTNOMA DE

GUERRERO
UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS
NATURALES

QUMICO FARMACUTICO
BILOGO
*BIOTECNOLOGA

* Determinacin de la carga viral del VIH-1

en Muestras de sangre seca en papel de
Filtro
Integrantes:
ROJAS ALONZO RAFAELA
NEZ TAPIA FLOR DE AZUCENA
DE
LA
CRUZ
CASTRO
KARLA
GIOVANNA
HERNNDEZ
MALDONADO
ELIZABETH
GMEZ LPEZ ELAS

M.C. :Ma.Martina Lpez Soto

Grupo: 802 QFB

Introduccin
Se centr principalmente en el aumento de la sensibilidad, precisin, rango
dinmico y la identificacin de las variantes genticas de un virus que se
caracteriza por su alta tasa de mutacin [2, 3].Estos ensayos operan en
tecnologas como la reaccin en cadena de la polimerasa en tiempo real (RTPCR), que ha permitido la automatizacin de los sistemas, reduciendo el
error humano y el aumento de la eficiencia de trabajo [4].

Aunque la muestra ideal para VL cuantificacin de VIH-1 es el plasma,

ciertos investigadores han probado secas especmenes manchas de
sangre (DBS) en papel de filtro utilizando diferentes kits comerciales
o mtodos de laboratorio estandarizados, debido a sus ventajas
econmicas y tcnicas.DBS ha demostrado su utilidad, sobre todo en
lugares que carecen de la infraestructura costosa utilizado para los

En Cuba, como parte de la atencin mdica descentralizada de las

personas que viven con el VIH / SIDA, varios laboratorios han creado
para facilitar el acceso de los pacientes a las determinaciones
VL.Una prueba de Roche Molecular Systems, que ha sido validado
para muestras de plasma humanos, se utiliza para este propsito.Sin
embargo, el procesamiento de muestras y el transporte para el
ensayo se ven obstaculizados en las zonas rurales y montaosas.

Esta prueba no ha sido bien evaluado con DBS, pero este tipo de muestra tiene
ventajas que la hacen atractiva. Ellos incluyen su estabilidad, a pesar de la alta
temperatura, y la facilidad de transporte, por el cual especmenes incluso pueden
ser enviadas a travs del sistema postal.Por lo tanto, decidimos evaluar DBS con el
VIH-1 prueba cobas Ampliprep / cobas Taqman, versin 2.0 (Roche Molecular
Systems, Inc., Nueva Jersey, EE.UU.), como una alternativa para simplificar el
procesamiento de muestras y transferencia para la determinacin VL en

Material
Y Mtodos

1600 gdurante 20 min .

1,5 ml en tubos de ensayo de

polipropileno estriles y se congel
a -15 C.

Para evaluar la linealidad, la precisin y la

sensibilidad del ensayo con sangre total de
DBS tambin obtuvimos, utilizando EDTA
como anticoagulante, a partir de un paciente
con una VL de plasma de 4,2 10 5 copias /
mL.

Se
deja
secar
a
temperatura ambientes y
se almacenaron a 2-8 C
hasta su anlisis en bolsas
de plstico

Se prepararon diluciones seriales sobre

una base de 5, de 1: 5 a 1:15 625

Se utiliz como un diluyente y se

aplico para el secado y preservacin

Linealidad fue evaluada por tres ensayos.

El VL se cuantific en la
muestra DBS puro y en los
seis
diluciones
en
serie
preparadas a partir de ella

Tres
repeticiones
de
todas
las
concentraciones utilizadas fueron probados,
y los ensayos se realizaron en diferentes
das, por lo que los resultados podran ser
utilizados para analizar la precisin y
determinar la sensibilidad.

Para el procesamiento de la muestra DBS

dos manchas se cortaron

(equivalente a 100 l)

se colocaron en un tubo
de
ensayo
de
polipropileno estril

Ms tarde, 1 ml se recuper a
partir del contenido del tubo de
ensayo, para su anlisis

Se aadieron para la elucin

de sangre para 2 h, a 2-8 C;

Un total de 1,2 ml
de
la
solucin
reguladora
TrisEDTA

El CobasAmpliprep / CobasTaqman

Esta prueba, centradas en las regiones gag y LTR

del genoma del VIH-1, para su amplificacin y
deteccin, y con una sensibilidad de 20 copias. se
llev a cabo en la plataforma para la PCR en tiempo real

Resultados y
Discusin

Los valores de RNA en el plasma de los 43 especmenes estudiados estaban en el rango

de 40 a 2 450 000 copias / ml, con una media de 10 000 copias / mL.No se detect ARN
en cuatro muestras de DBS, para una tasa de deteccin total de 90,7% (Tabla 1).

El VL en las 39 muestras de DBS con ARN detectado un promedio de 2.250 copias / mL

y vari de 40 a 155 000 copias / mL.El VL en el plasma de cuatro muestras, donde no se
detect el ARN en el DBS, estaba en el intervalo de 40 a 216 copias / mL.El ARN viral
se cuantific en un 63,6% de la SPE-cimens que muestran niveles de LV en el plasma
inferior a 1.000 copias / ml, al utilizar DBS.

En los 39 pares de muestras donde se detect ARN, se obtuvo una alta correlacin de
la VL (r = 0,964, p <0,0001) (Figura 1).

En otro estudio se observ una diferencia promedio de

log10,utilizando el instrumento cobas TaqMan y con
procedimiento de extraccin que difera de la nuestra .

1,0
un

De acuerdo con el modelo de Bland-Altman, los lmites de

concordancia fueron 0,378 (0,178 a 0,577) y 1,771 (1,571-1,969)
log10copias / ml (media 1,96 veces la desviacin estndar),
respectivamente, y el 94,8% de los valores estaban en de ese
rango.Este mostr un alto nivel de acuerdo entre los valores de la VL
para ambos tipos de muestras (Figura 2).

El anlisis de regresin en la evaluacin de linealidad con la muestra de DBS, en los tres

ensayos, mostr valores de regresin que estaban muy cerca de 1, con un promedio de
0.98.Este valor es muy similar a la reportada por el fabricante de la prueba para la
muestra de plasma (0.989).La deteccin de ARN en DBS fue lineal en un amplio rango
dinmico de 134 a 420 000 (2.1 a 5.6 log 10)copias / mL.El lmite inferior de deteccin
(LLD) en este estudio fue menor que la LLD encontrado por otros investigadores en
estudios similares.

Dado que el volumen de entrada y el tipo de muestra que influyen en la sensibilidad

de estas pruebas, y en este estudio se estn probando un tipo diferente de la muestra
y un volumen inferior a la recomendada por el fabricante, el reto est en saber
cundo un resultado con DBS debe ser considerado con cautela.Esto depende de una
posible contradiccin con otros factores y parmetros analizados en el paciente en
este estudio. Probablemente, en determinados casos, puede ser necesario y
conveniente analizar el VL en el plasma.

Los resultados de la comparacin entre

los valores reales y predichos de la VL,
en el plasma de las muestras
estudiadas, se muestran en lafigura 3.

Se demostr que no hay diferencia

estadstica
significativa
entre
las
medias de ambos valores, para un nivel
de confianza de 95%.

Por lo tanto, esta forma de calcular el

valor de la carga viral del VIH-1 en el
plasma de personas infectadas, podra
ser eficaz si se considera que el modelo
debe ser validada con un mayor nmero
de muestras.

 CONCLUSIONES
Se obtuvieron resultados satisfactorios en
este studyafter cuantificacin del ARN del
VIH-1 a DBS especmenes con el VIH-1
prueba
cobas
Ampliprep
/
cobas
Taqman, versin 2.0 (Roche Molecular
Systems,
Inc.,
Nueva
Jersey,
EE.UU.),
endosando su uso.

Esto puede ser beneficioso para las personas

que viven con el VIH / SIDA que tienen que
venir de reas cubanos ubicados lejos de los
laboratorios para el anlisis de la carga
viral.

Tambin es til para aquellas personas que viven en

zonas donde las condiciones no son apropiadas para
el procesamiento de la sangre, de almacenamiento
de plasma y su transporte refrigerado.

Despus de validar el modelo para la prediccin de

la VL en el plasma mediante el uso de DBS, puede
ser posible recomendar la utilizacin de este tipo de
muestra de una manera fiable.