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Les mthodes du diagnostic

virologique
Le diagnostic dune maladie virale associe
lisolement du virus responsable (ou la
dtection directe de ses composants
structuraux) cest--dire le diagnostic direct
et le diagnostic indirect (ou dtection
danticorps anti-viraux par diffrentes
techniques).
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Aussi, le laboratoire de virologie intervient dans


diffrentes situations.
1- Apporter la preuve de l'origine virale des
signes cliniques observs (ex : identification
d'un virus Herpes dans une lsion gnitale).
2- Permettre la mise en uvre des mesures de
prophylaxie et le contrle des pidmies
(example : fivres hmorragiques...).
3- Suivre l'volution biologique de l'infection
(example : tude des diffrents marqueurs du
virus de l'hpatite B...).
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4- Permettre une dcision thrapeutique et


juger de son efficacit (ex : traitement par
l'Acyclovir au cours d'une infection
herptique).
5- Apprcier l'tat immunitaire (ex : la rubole).
6- Etudier les rservoirs, les vecteurs et la
transmission des infections virales.
7- Eviter la transmision des virus l'occasion
des dons d'organe et de tissus.

A- Diagnostic direct
1- Technique utilisant les cultures cellulaires:
Strictement dpendants des cellules pour leur
rplication, les virus ne sont cultivables quen
cellules vivantes dont il existe 3 sources: les
animaux vivants, luf de poule embryonn et
les cellules en culture.
Chaque virus possde un tropisme cellulaire
propre. Le laboratoire doit entretenir un
minimum de 2 3 lignes cellulaires pour
obtenir la rplication du plus grand nombre de
virus pathognes pour lhomme.
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Quand un virus est inocul en culture cellulaire,


plusieurs ventualits sont possibles:
- absence de rplication: la nappe cellulaire
reste intacte;
- rplication peu cytolytique, sans modifications
morphologiques des cellules: diffrentes
caractristiques rservs certaines familles
virales sont utilises pour montrer la prsence
du virus dans la nappe cellulaire;

- rplication cytolytique, altrant la morphologie


de la nappe cellulaire: on parle deffect
cytopathique (ECP).
Une fois le virus dtect en culture cellulaire, un
diagnostic probabiliste du virus en cause est
souvent possible; on peut savoir la famille ou le
genre du virus en fonction du type de cellules
sur lesquelles il sest multipli, du delai
dapparition , des caractristiques de lECP, de
lorigine du prlvement. Gnralement on
nisole pas de virus envelopp dans les selles.
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Les techniques didentification sont


immunologiques: immunofluorescence (IF) ou
immunoperoxydase (IP), sroneutralisation
(SN), inhibition de lhmagglutination (IHA),
hybridation avec des sondes nucliques ou les
techniques damplification de squence
nuclique.
Mme si elles sont parfois longues, ennuyeuses
et onreuses, les techniques de culture
cellulaire sont sensibles pour les virus
facilement cultivables.
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2- Dtection du virus entier par microscopie


lectronique (ME): aprs coloration, les virus en
grande quantit, la microscopie lectronique est
utilise pour dtecter les agents non cultivables
responsables de gastro-entrites: rotavirus, .
On augmente la sensibilit en mettant un srum
dirig contre le virus suspect: les virus
apparaissent sous forme dagrgats.
La microscopie lectronique ne diffrencie pas
des virus de la mme famille, comme les HSV-1
et 2 et le VZV.
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3- Dtection directe dantignes viraux: on


recourt des techniques rapides (quelques
minutes quelques heures) en terme de
spcificit et de reproductibilit.
Mais ces techniques manquent de sensibilit et
ne sappliquent qu certains prlvements
(prlvement, virus, techniques).

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4- Dtection de gnomes viraux par hybridation


sans amplification: lhybridation se fait entre le
gnome viral prsent dans lchantillon tester
(aprs dnaturation thermique sil sagit dun
acide nuclique bicatnaire) et une squence
nuclotidique connue, la sonde, marque par un
isotope radioactif (sonde chaude) ou par un
produit non radioactif (sonde froide).
Lhybridation simple manque de sensibilit et ne
sapplique qu certains prlvements (verrues,
sang de sujet atteint dhpatite B chronique,
..).
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hybridation: fcondation entre des sujets despces


diffrentes, mais voisines, ou de mme espce, mais
de varit diffrente.
amplification gnique: technique moderne danalyse
de lADN. Cette technique fait augmenter la quantit
ADN provenant du prlvement tudi.

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On distingue 3 variantes mthodologiques pour


hybridation sans amplification:
- hybridation sur membrane (de nylon ou de
nitrocellulose): quand les acides nucliques sont
dposs sur la membrane, on parle de
technique de dot-blot.
Quand les ADN extraits sont digrs par des
enzymes de restriction puis spars par
lectrophorse avant dtre transfrs sur la
membrane, il sagit de la technique de Southern
blot.

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- lhybridation in situ, partir dune coupe de tissu


(par exemple, dtection dADN de papillomavirus sur
biopsie de lsion verruqueuse); elle renseigne sur le
nombre et le type histologique des cellules infectes.
- Lhybridation en milieu liquide (en tube ou en
micro-plaque); lintensit du signal, proportionnelle
la quantit de matriel viral prsent dans lchantillon,
permet dapprcier la charge virale. La mthode est
utilise pour mesurer la charge virale dans le srum au
cours de linfection par HIV et des hpatites
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chroniques B et C.

5- Dtection de gnomes viraux par les techniques


damplification de squence nuclique (PCR): ces
techniques sont applicables tous les agents viraux
qui sont difficiles ou impossibles multiplier in vitro.
Le prototype des techniques damplification est la
raction damplification en chane par polymrases
ou PCR (Polymerase Chain Reaction).
Ces techniques sont trs sduisantes pour leur grande
sensibilit et leur extrme polyvalence.

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6- Squenage: avec les techniques froides utilisant


des fluorochromes, des squenceurs automatiques et
des logiciels dalignement de squences, les
techniques de squenage des gnomes viraux (
partir des produits de clonage ou de produits de PCR)
servent ltude des dterminants de rsistance dite
gnotypique aux antiviraux (HIV) et au typage
molculaire de virus comportant une grande diversit
gntique, example: HCV, HIV, HPV (papillomavirus
humain).

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B- Diagnostic indirect: caractrisation des


anticorps viraux dans le srum. Par cette
mthode, on peut savoir une infection rcente
ou ancienne.
1- Technique permettant de distinguer lisotype
des anticorps:
Les techniques ELISA sont les plus utilises en
srologie virale et sont automatises.

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La technique dimmunofluorescence demeure la


rfrence pour la dtection des anticorps de
lEBV (Epstein Barr virus). Les techniques
dimmuno-blot, Western blot sont utilises
comme tests de confirmation de linfection par
HIV, HTLV (virus du lymphome humain cellules
T) ou EBV (cest- dire ltude analytique des
anticorps dirigs contre diffrentes protines
virales).

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2- Techniques ne distinguant pas lisotype des


anticorps: la sroneutralisation et linhibition de
lhmagglutination sont utilises pour mettre en
vidence des anticorps et pour valuer la
protection dun individu vis--vis dun virus.
Lagglutination passive (ou conditionne) est
utilise pour le diagnostic dune infection
rcente.

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3- Dosage de linterfron alpha: le dosage


biologique de linterfron alpha se fait dans le
sang ou le LCR.
Linterfron alpha est inductible par une infection
virale.
En association avec dautres investigations plus
spcifiques, ce test est utile dans le diagnostic
de la rubole congnitale et des encphalites.

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C- Indications des examens de diagnostic


virologique: toute infection prsume virale ne
justifie pas la prescription dun examen
virologique.
Les indications de ces examens sont la svrit
ou le caractre proccupant de linfection, soit
pour le patient, soit pour la collectivit.
Les examens virologiques participent de plus en
plus au suivi des traitements antiviraux.

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1- Donnes du diagnostic direct: la dcouverte dun


virus ou de ses constituants dans un prlvement
est utile quand le virus est dtect dans un site
correspondant au processus pathologique (liquide
cphalo-rachidien au cours dune mningite, lavage
broncho-alvolaire au cours dune peneumopathie).
2- Donnes du diagnostic indirect: les
renseignements cliniques fournis avec le
prlvement (ge dun trs jeune enfant, des
anticorps maternels, notion de srothrapie,
transfusion, vaccination rcente) sont
indispensables au biologiste pour fournir une
interprtation.
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Les srologies virales ont 3 indications:


a- le diagnostic dune infection actuelle,
aigu ou persistante,
b- la dtermination du statut immunitaire dun
individu vis--vis dun virus un moment
donn,
c- lvaluation de lefficacit dune
vaccination antivirale.

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Le diagnostic srologique dinfection rcente est


difficile et repose sur 2 notions:
a- laugmentation significative des anticorps
entre 2 prlvements successifs, ce qui suppose
la quantification de la rponse humorale;
lexpression des rsultats est variable selon le
virus, la technique et le laboratoire.

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b- la mise en vidence danticorps antiviraux de


classe IgM. Thoriquement ils signent une
primo-infection. En fait, il arrive quon les trouve
au cours dinfections secondaires ou
persistantes; dautre part, leur prsence est
inconstante ou retarde, en particulier en cas de
dficit immunitaire.
Compte tenu de la permabilit de la barrire
placentaire aux IgG, la prsence d anticorps
IgM ou IgA est un argument srologique
permettant daffirmer une infection chez le
nouveau-n et le nourrisson.
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D- Evaluation de la rsistance aux antiviraux:


outre leur intrt diagnostique, les tests
virologiques sont utiliss dans le suivi des
infections virales chroniques et dans leur
traitement, comme infections HIV, hpatites
virales chroniques, infections virales des
personnes immunodprimes.
Regardons la rsistance aux antiviraux: au
laboratoire, il existe 2 faons d valuer cette
rsistance antivirale.

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- valuer la quantit du virus en culture cellulaire


en prsence de lantiviral; on parle de tests
phnotypiques; on voit la concentration
inhibitrice 50 ou 90% (CI 50 ou CI 90 ), cest la
concentration dantiviral rduisant la production
de virus en culture de 50 ou 90%;
- rechercher des mutations connues comme
cause de rsistance; on parle de tests
gnotypiques.

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a- Tests phnotypiques: ils sont effectus en


microplaques de 24, 48 ou 96 puits sur des
cultures cellulaires traites par diffrentes
concentrations dantiviral.
La multiplication virale dans la culture cellulaire
peut tre mesure par une quantification de
lECP (dnombrement des plages de lyse ,
dnombrement des cellules vivantes par
colorimtrie, pourcentage de puits ayant un
ECP) ou par une quantification des antignes ou
des acides nucliques produits.
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Les tests phnotypiques sont utiles pour


surveiller lvolution de la rsistance des virus
aux traitements antiviraux, par example HSV,
CMV, VZV, HIV.
b- Tests gnotypiques: ils sont utiliss pour le
suivi de linfection par HIV, HBV, CMV,
Ils dterminent la rsistance aux antirtroviraux:
type sauvage, mut ou mixte.
Certaines mutations signent la rsistance telle
molcule et certaines mutations induisent une
rsistance croise entre plusieurs molcules de
mme mcanisme.
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Cultures cellulaires: les cultures cellulaires in vitro


sont largement utilises dans les laboratoires de
virologie. Trois grands types de cellules sont utiliss.
- Les cellules de primo-explantation: elles
proviennent dorganes frais trypsins (la
trypsine rompant les ponts inter-cellulaires et
permettant une culture en momocouche); elles
sont sensibles de nombreux virus mais ont
linconvnient de ne pas supporter de passage,
example les cellules de rein de singe (RS).

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Le passage tant le ddoublement aprs trypsination dune


bote de culture dont le tapis cellulaire est arriv
confluence.

- Les cellules diplodes: ce sont des cellules


normales qui peuvent supporter une cinquantaine
de passages et peuvent tre maintenues un certain
temps au laboratoire. Ex. MRC5, fibroblastes humains
dorigine embryonnaire pour lisolement du CMV.
- Les cellules en lignes continues: ces
cellules, gnralement dorigine cancreuse,
souvent htroplodes ont acquis la possibilit de
prolifrer au laboratoire; example la ligne HeLa.
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Immunofluorescence: les antignes recherchs


sont dtects par des anticorps spcifiques lis
une molcule fluorescente. Les virus grippaux,
le virus respiratoire syncytial pourront tre
diagnostiqus dans des frottis de larbre
respiratoire.
La technique dimmunofluorescence demeure la
rfrence pour certaines srologies comme la
dtection des anticorps de lEBV (fig 6B).

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Techniques immuno-enzymatiques (ELISA): des


anticorps dirigs contre un antigne viral sont
fixs sur une plaque de polystyrne; si le
prlvement tudi contient lantigne
correspondant , ce dernier va se fixer; un
deuxime anticorps li une enzyme viendra
saccrocher et aprs lavage, lorsquon rajoutera
le substrat de lenzyme, il se produira une
raction colore.

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Les techniques qualifies de srologie virale


ont pour but la mise en vidence danticorps
spcifiques dun virus, comme tmoins dune
infection rcente ou ancienne. Elles sont trs
diverses dans leur principe et leurs
performances.

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Lagglutination passive est utilise pour le


diagnostic dune infection rcente que pour
dfinir le statut immunitaire dun individu vis-vis dun virus. La fixation du complment
manque de sensibilit chez le jeune enfant et
limmunodprim.
Prlvement: le sang doit tre prlev de faon
aseptique sur tube sec.

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Pour choisir la technique utiliser dans une


situation donne, il faut tenir compte:
de la spcificit de la technique;
de la rapidit dapparition et de la dure de la
rponse en anticorps;
de la sensibilit de la technique et .........de
son cot.

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Par example, il vaut mieux utiliser la


fixation du complment (Fc) que
linhibition de lhmagglutination IHA, pour
le diagnostic srologique des Adnovirus
parce que la fixation du complment
indique un antigne de groupe alors que
linhibition de lhmagglutination est
spcifique de type (il existe 42 types donc
il faudrait 42 IHA).

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Un autre example, dans le cas de la rubole,


les anticorps dtects en IHA apparaissent plus
rapidement et persistent plus longtemps que
les anticorps dtects en Fc. La raction dIHA
est donc plus adapte au diagnsotic de la
rubole.
Application en virologie: la raction de
dviation du complment est utilise en
virologie pour mettre en vidence les Ac
dirigs contre la quasi-totalit des virus.

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Raction de dviation du complment ou fixation du


complment, Fc (fig. 7.10):
Matriel:
- srum tudier qui doit tre au pralable
dcomplment (56o C pendant 30 minutes);
- lantigne (Ag) vis--vis duquel on recherche les
anticorps (Ac);
- du complment de cobaye pralablement titr ( pour
la raction);
- des globules rouges du mouton (GRM);
- du srum de lapin anti-GRM pralablement titr
appel srum hmolytique (SH).
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Premire possibilit: le srum tudier prsente


des Ac spcifiques de lAg connu. Il ny a pas
dhmolyse (fig. 7.10 a). On a comme titre en
Ac, linverse de la dilution laissant au moins 50%
de GRM intacts.
Deuxime possibilit: le srum tudier ne
possde pas dAc spcifique de lAg. Il y a la
lyse des GRM (fig. 7.10 b).

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Inhibition de lhmagglutination (IHA) :


On utilise pour le diagnostic srologique des
infections par des virus hmagglutinants comme
le virus de la rubole, de la grippe, de la
rougeole, les adnovirus, de nombreux
arbovirus......
Principe: la raction est base sur la proprit
du virus de se fixer la surface des hmaties
par lintermdiaire dhmagglutinines, et de
former des ponts entre les hmaties
(hmagglutination virale). Les anticorps
spcifiques du virus se fixent sur le virus.
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Lorsque le virus est entour danticorps, il na


plus daccs la surface de lhmatie: il y a
inhibition de l hmagglutination (fig.7.11).
Chaque virus agglutine les hmaties despces
animales dtermines. Ex:
Rougeole: hmaties de singe;
Grippe: hmaties de cobaye.

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Western blot ou immunoblot


On utilise pour la recherche du VIH et aussi pour
confirmer dun test de dtection ELISA positif.
Aprs avoir cultiv, concentr et purifi du VIH-1,
on peut sparer par lectrophorse les diverses
protines qui le constituent: Gp160, Gp110, p68,
p55, Gp41, p40, p34, p25 et p18. Ces protines
sont alors transfres sur un filtre de
nitrocellulose puis celui-ci est dcoup en
bandes utilises pour le diagnostic srologique.

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Aprs avoir incub avec un srum, rinc puis


incub avec un conjugu anti-immunoglobuline
humaine li une enzyme, puis ajout le
substrat de lenzyme, on voit les bandes
apparaissent; cela signifie que le patient a les
anticorps correspondants (fig. 7.15).

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Raction de neutralisation: cest la neutralisation


de linfectivit dun virus. La technique, trs
ancienne, est souvent la technique srologique
de rfrence.
Principe: la mise en contact dun virus avec un
srum contenant des anticorps dirigs contre lui,
avant son inoculation sur un systme-hte
vivant sensible, inhibe linfectivit du virus
Le systme-hte varie selon le virus: animaux,
oeufs embryonns, cultures de cellules.

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Hmadsorption: lors de la sortie hors des


cellules, par bourgeonnement, des virus
hmagglutinants envelopps, les spicules
hmagglutinants se trouvent la surface des
cellules au niveau des bourgeons. Si on met
dans le milieu des globules rouges, ceux-ci se
fixeront la surface des cellules infectes.

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INTERPRTATION DES RSULTATS


Le plus souvent, l'isolement d'un virus ou la dtection
d'un de ses constituants dans un produit pathologique tel
qu'un LCR, une aspiration nasale, un prlvement de
gorge, des leucocytes, est en faveur de l'tiologie virale
de l'infection observe par le clinicien. Il faut se souvenir
que la prsence d'un virus dans un chantillon est la
traduction de la rplication virale dans les tissus pouvant
aboutir une cytolyse dont dcoulent en partie les
signes cliniques.
La rponse immune est variable d'un sujet l'autre
(certains sujets bons rpondeurs auront des titres
d'anticorps sriques levs,sans pour cela qu'il y ait une
relation avec l'importance de l'expression clinique de
l'infection).

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L'expression des rsultats est souvent variable d'une


technique l'autre, d'un laboratoire l'autre. Les
normes du laboratoire sont en gnral mentionnes
sur la feuille de rsultats.
- Chez les patients immunodprims, du fait de
l'atteinte du systme immunitaire, les srologies
virales sont peu informatives.Il faut privilgier
l'isolement viral.
- Chez le nouveau-n, la prsence dIgG d'origine
maternelle gne l'interprtation des srologies
pendant 6 10 mois. Il faut faire la recherche des
IgM spcifiques (ex: rubole, cytomgalovirus) et
celle du virus.
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