ELECTROFORESIS

La electroforesis es el movimiento de
molculas cargadas en un campo elctrico.
Un aparato de electroforesis consiste de un
nodo (+) y un ctodo (-) separado por acetato
de celulosa en el cual migran las molculas de
Hb.
Cuando una corriente elctrica pasa a travs
del medio permite que las diferentes molculas
de proteinas con cargas elctricas diversas
migren a lo largo de la tira a velocidades
diferentes. Despus de un perodo
especificado, la tira se retira y se tie.
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ELECTROFORESIS
DE SEROPROTENAS

Mtodo p separacin de protenas sricas

(protenas transport., anticuerpos, inhibs
enzims, facts. de la coag., etc.) x su
migracin como partculas cargadas en un
campo elctrico.
Usado p. seroprotenas, lipoprotenas,
isoenzimas, hemoglobinas, haptoglobinas,
glicoprotenas, etc.
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En suero hum. existen + de 125 protenas

identificadas, con diversas funciones.
Protenas sricas totales o las proporciones
de las fracciones proteicas cambian
durante 1 variedad de enfs, por lo que
cuantificarlas es de valor en el diagnstico
clnico.

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SOPORTES:
CLASE I: Separan molculas en base a la carga
molecular neta. Ej.: materiales de capa
delgada: papel, acetato de celulosa y gel de
agarosa.
Se obs. 5 bandas de protenas sricas.
CLASE II: Ade+ de la separacin electrosttica
poseen un efecto de tamizado. Tamao del poro
del gel es del mismo orden que el de las protenas.
Ej.: almidn, gel de poliacril-amida. Actan
como trampas p las grandes molcs y las + peqs.
migran sin impedim. El poder de resolucin de
estos geles es mucho >.
Se visualizan 25 bandas o +.
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BUFFERS y pH:
NH2
|
H
|
R

NH3+
|
COO|
R

NH3+
H

|
COO-

COOH

|
R

pH bsico
pH cido
Punto isoelctrico

pH neutro

Las protenas son molculas anfteras, son partculas no

cargadas o cargadas positiva o negativamente segn el
pH del buffer.
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Conociendo el valor del pH del punto

isoelctrico ( pI ) p. las susts a ser
separadas, se puede elegir un buffer p.
su separacin; ej.: barbital, que no
ppta ni desnaturaliza las protenas y
confiere una carga ( - ) a la mayora
de las protenas sricas a pH 8.6.
En un campo elctrico, las
molculas de protena negativamente
cargadas migran hacia el nodo.
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ELECTROFORESIS EN
ACETATO DE CELULOSA

Permite separar 5 a 6 bandas. C/fraccin

electrofortica representa un conj. de
protenas.
til p. el diagnstico de gammopatas
monoclonales, cirrosis heptica, insufic. renal,
hipogammaglobulinemia, mieloma mltiple,
etc.

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REACTIVOS:
1. BUFFER:
Tris
6.05 g
Barbital Na
10.30
Barbital
2.57
Agua c.s.p. 1 Litro
0.05)

( pH 8.6;

f.i.

Usar 100 mL p. humedecer tiras y 200 mL p. la cmara.

Refrigerado sirve para 4 a 6 corridas.
2. COLORANTE: Disolver 1 cps. de Rojo Ponceau S en 100
mL
de c. tricloroactico al 5 %
3. LAVADO: 300 mL de c. actico 5 % (3 baos de 100 mL
c/u)
4. SOLUCION DESHIDRATANTE: 100 mL. de metanol
absoluto
5. SOL. CLARIFICADORA: 100 mL. de 12 % de c. actico
en metanol.
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PROCEDIMIENTO:
A)
B)
C)
D)
E)
F)

SEPARACIN
COLORACIN
DECOLORACIN
DESHIDRATACIN
CLARIFICACIN
CUANTIFICACIN:
a) Scanneado en el densitmetro:
b) Elucin en NaOH 0.1 N
c) Disolucin en Acetona: Ac. actico
glacial (1:1)
Leer a 517 - 525 m vs el Bl. (disolucin de
1 porcin
de la tira no coloreada).
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Rangos normales de fracciones

proteicas
por electroforesis en acetato de celulosa
Fraccin
Albmina
Globulinas:
1
2

% del Total
54.0 - 74.0
1.1
4.6
7.3
8.1

4.2
13.0
13.5
19.9

Protenas totales: 100.0

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g/dL
3.7 - 5.7
0.1 - 0.3
0.4 - 1.0
0.5 - 1.0
0.5 - 1.5
6.5 - 8.2

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Principales protenas encontradas en

cada fraccin:

Albmina:
Globulinas:
1: 1-antitripsina, 1-lipoprotenas, 1-

glucoprotena,
Protrombina, Glob. fijadora
de hormona tiroidea
2: 2-macroglobulina, Haptoglobina,
Ceruloplasmina, 2-lipoprotenas,
Eritropoyetina.

Transferrina, -lipoprotenas, C3 y C4
componentes
del complemento,
Inactivador de estereasa C1,
Hemopexina,

IgG, IgA, IgM, IgD, IgE.

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ELECTROFORESIS DE
SEROPROTEINAS NORMAL Y
PATOLGICAS

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ELECTROFORESIS DE
HEMOGLOBINAS

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Pauling e Itano en 1949: 1a identif. de

1 variante de Hb: HbS.
Hb normal de un adulto en
acetato de celulosa pta.:
HbA:
95-98 %
HbA2: < 3.5 %
Anhidrasa carbnica I y II.

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Electroforesis en acetato
de celulosa a pH alcalino

Principio: En tampn alcalino de trisEDTA-borato, pH 8,4, la > parte de las

Hbs. tienen una carga negativa y en un
campo elctrico migran desde el punto de
aplicacin catdico hacia el nodo ( + ).
La electroforesis en acetato de celulosa
es un mtodo semicuantitativo de
screening para las Hbs A, A 2, F, S, G, C, E,
OyD
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Preparacin
del hemolizado
Principio: La cuantificacin y

diferenciacin de las Hbs requiere de

sangre hemolizada. La sangre anticoag.
se conc. x centrifug. y hemoliza por
adicin de:
Agua+congelamiento+cloroformo,
Agua+ tolueno o solucin de saponina.
Glbs bls, plaquetas, estroma y
protenas plasms se eliminan x centrifug
y lavado con sol. salina.
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Macromtodo

Centrif. 5 mL de sangre anticoag., remover

el plasma y lavar los GRs 3 v. con sol. salina
fisiolg. Elim. la sol. salina sobrenad. final y
registrar el volumen de GR empaquetados.
Por c/mL de GR aadir 1.5 mL de agua
dest., agitar, y poner congelar. Remover y
dejar descong 15. Agregar 0.4 mL de
cloroformo x mL de GR empaquetados.
Agitar vigorosam. x 5 y centrif. x 15 a
3000 rpm. El hemolizado est en la capa
superior.
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Micromtodo

Reactivo: Reactivo lisante

saponina:
1. Solucin de reserva:
Polvo de saponina
1 g.
Agua c.s.p.
100 mL.
2. Solucin de trabajo:
Solucin de reserva: 10 mL
Agua
90 mL
KCN al 3 %.
2 mL

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Procedimiento:

Llenar 2 tubos heparinizados con sangre

de puncin dactilar. Cerrar 1 extremo con
plastilina y centrifugar x 5. Muestra
estable x 1 sem. en nevera. Con lima
realizar una muesca en c/tubo de Hcto a
1.6 cm x encima de la plastelina y romper
el tubo. Vaciar la columna de GR
empaquetados en un tubo de ensayo q
contenga 6 gotas de Sol. de trabajo de
saponina como agente hemolizante.
Sacudir x 15 p. sacar la sangre del tubo y
hemolizarlo.
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Procedimiento:
Separacin:
Igual que para seroprotenas, usando en vez
de suero el hemolizado de los GR.
Buffer: Tampn Tris-EDTA-cido brico, pH
8.4:

Tris
10.2 g;
EDTA 0.6 g,
cido brico 3.2 g
Agua c.s.p. 10 dL.

Conectar a la fuente de poder a 250 voltios

por 30 minutos.
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Interpretacin y comentarios:

Todas las Hbs se desplazan del pto de

aplicacin hacia el nodo (+). El pto de
aplicacin puede ser poco visible y al
mismo nivel 1 banda tenue de anhidrasa
carbnica.
Segn su movilidad las variantes de la Hb
pueden clasificarse en:
Hbs lentas (A2, C, CHarlem, E y O)
agrupadas en las proximidades del ctodo
Hbs intermedias que se ubican entre la
Hb C y A (S, Lepore, D, (G) y F)
Hbs ms rpidas (ms andicas) que la
Hb A: (K-Woolwich, J, N, I, Barts y H).
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Las Hbs con idntica movilidad

electrofortica pueden diferenciarse x
otros mtodos. Ej.: pruebas de
drepanocitemia, solubilidad,
desnaturalizacin alcalina y electroforesis
en agar-citrato. Tambin pueden
diferenciarse por consideraciones
cuantitativas.

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La cantidad de Hb en cada banda se cuantifica

mediante densitometra y luego son comparadas
con la muestra normal. Las variantes de Hb
anormal tienen alteracin en las cargas debido a
sustituciones nicas de aminocido en sus
cadenas de globina y este cambio en la carga
elctrica permite la separacin entre la mayor
parte de las variantes anormales de la Hb y la Hb
A en un pH alcalino.
Se puede cambiar el medio (de acetato de celulosa
a gel de almidn) o su pH (de 6.2 a 8.6) para
separar claramente las Hbs y expandir el rango de
esta prueba ms all de las Hbs A1, A2, S y C

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Resultados normales:
En los adultos las sgtes. Hbs son las
ms frecuentes:
Hb A1: 95% a 98%
Hb A2: 2% a 3%
Hb F:
0,8% a 2%

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