Mtodos de

estudios de las
clulas y los
tejidos
TECNICA HISTOLOGICA, TECNICA HISTOQUIMICAS

Tcnica
Histolgica

Tcnica Histolgica
Esta tcnica tiene como finalidad conservar las estructuras celulares

y tisulares, asi como tambin conservar los componentes qumicos

de estas.
Consiste en colorear las estructuras celulares, ya que que estas son

transparentes, debido a su alto contenido en agua y a otros factores.

Pero estas sustancias (colorantes) son toxicas para las clulas,

provocando la destruccin de las extructuras internas y externas de

la clula. Por tal motivo antes de ser coloreados, los tejidos deben
sufrir los siguientes procesos:
1.

Fijacin

2.

Inclucion

3.

Corte

Tcnica
Histolgica
Toma de Muestra

Histolgica
Toma de
muestra

a) Debe ser rpida.

b) Puede provenir de:
biopsias quirrgicas,
material obtenido de necropsias,
utilizando animales de

laboratorio,
estudios experimentales en

animales,
material de cultivos de tejidos,
frotis o extendidos.

Tcnica
Histolgica
Fijacin

Tcnica Histolgica
Fijacin
Consiste en la muerte de las clulas de una
manera tal que las estructuras que posean
en vida se conserven con un minumo de
modificaciones, al igual que sus componentes
qumicos.
Caracteristicas de un buen fijador
Accion rpida, matando a las clulas antes que

aparezcan los fenmenos agnicos;

Poseer un alto grado de penetracin, con el fin

de que todas las estructuras celulares se fijen

Asi como conservar los detalles estructurales;
Evitar

la
desaparicin
qumicos tisulares (lpidos)

Favorecer

los pasos
corte y coloracin)

de

componentes

posteriores

(inclucion,

F. Qumicos: Se utilizan
solo para conservar los
detalles estructurales mas
no la composicin qumica.
Cuando se requiere una buena
conservacin de la estructuras
tisulares, el fijador se
administra por va sangunea.
Todos los fijadores qumicos
reaccionan con componentes
tisulares como las protenas.
Ej.: Formol 10%, Liquido de
flemming.

F.

Fsicos:

Se utilizan
para mantener intacta la
composicin qumica de los
tejidos.
Ej.. Mtodo de congelacin.desecacin

Tcnica
Histolgica
Fijacin

Mtodo de congelacion-desecacin
Consiste en la congelacin rpida del tejido y su
deshidratacin al vacio a bajas temperaturas.
1. Congelacion: Introduccion de pequeas piezas

de tejido a temperaturas de -160 a -190,

logrado por Nitrogeno liquido. (algunas veces
hielo liquido a 0 grados).
2. Deshidratacion:

Se
realiza
al
vacion,
temepraturas que van de -30 a -40 grados.

Ventajas:
a. El tejido no se retrae,
b. El tejido se fija de manera homognea,
c.

No extraccin de sustancia solubles,

d. Composicion qumica y estructural de tejidos y

clulas se mantienen sin cambios.

Tcnica
Histolgica
Inclusin

Tcnica
Histolgica
Inclusin

Consiste en preparar el material para

que resista el cortado en laminillas

muy delgadas.
Para este proceso se suele utilizar

parafina,
en
el
cual
el
tejido
previamente deshidratado en baos
de alcohol etlico de graduaciones
crecientes (78, 90, 96 y 100 grados).
Se

sumerge
en
un
pequeo
recipiente cubico con parafina liquida
fundida a unos 55 grados, esta al
enfriar se convierte en un bloque
solido llamado vulgarmente taco, con
el tejido en su interior.

Tcnica
Histolgica
Corte del material

Tcnica
Histolgica
Corte

Estudio estructurales

Se realiza por instrumentos llamados

micrtomos; estos permiten obtener
laminillas de 2 a 15 um de espesor,
suficientemente delgados como para
que la luz pueda atravesarlas, luego
son montadas en un portaobjetos y
despojados de la parafina mediante
baos de xileno, luego baos de
alcohol etlico, rematado con agua
pura.

Estudios citoquimicos

Cuando
se
desea
mantener
la
composicin
qumica
de
los
compoenentes celulares se emplean
micrtomos
dentro
de
cmaras

Tcnica
Histolgica
Coloracin

Tcnica
Histolgica
Coloracin

Se emplean colorantes, que son sales

de naturaleza orgnica:
a) cidos: Tienen cargas negativas. Se
unen a grupos catinicos como los
grupos aminos de las protenas.
Actan a pH bajo. Eosina, azul de
anilina, fucsina cida Orange G. Son
colorantes citoplasmticos.

b) Bsicos: Presentan cargas positivas.

Se unen a los grupos fosfato de los
cidos nucleicos, grupos sulfato de los
glucosaminoglicanos(Gags) y grupos
carboxilo de protenas. Acta a pH alto
ya que los grupos se ionizan y se unen
al colorante. Hematoxilina, azul de
metileno,
azul
de
toluidina.
Son
colorantes nucleares.

 La Eosina es un colorante cido (predomina

Tcnica
Histolgica
Coloracin
HematoxilinaEosina: Fundamento
de la coloracin

densidad de carga negativa), se asocia y

colorea
a
estructuras
catinicas
del
citoplasma y matriz extracelular, tales
como: filamentos citoplasmticos (como los
de
clulas
musculares);
membranas
intracelulares; y fibras extracelulares (por
sus aminocidos bsicos ionizados).
La Hematoxilina se asocia con mordientes

para actuar como un colorante bsico, por

lo cual se asocia y colorea estructuras
anicnicas (que posean fosfatos, sulfatos
y/o
carboxilos
ionizados):
Heterocromatina
y
nuclolos
RNA
ribosoma Matriz extracelular.
Hematoxilina-eosina

Hematoxilina; Ncleo: violeta.

Eosina; Citoplasma: rojizo.

Tcnica
Histolgica
Montaje - Observacin

Tcnica
Histolgica
Montado observacin
Colocacin del cubreobjetos: con la

finalidad de proteger el preparado,

se lo recubre con un cubreobjetos.
Para adherir el cubreobjetos al
portaobjeto se emplean resinas, por
ejemplo: el Blsamo de Canad y se
lleva a observar en el microscopio.

Tcnicas
Histoqumicas
Histoqumica, Inmunohistoquimica, radioautografia

Tcnica Histoqumica
Son mtodos fsicos, que consiste en reacciones qumicas, en los cuales se

emplean colorantes, que se unen selectivamente a los grupos qumicos de

las molculas tisulares (cidos nucleicos, protenas, lpidos, hidratos de
carbono).
1. Reactivo de Schiff; Este reactivo es selectivo de los grupos aldehdos, de

modo que permite detectar el ADN y algunos lpidos y carbohidratos.

Esta preparado con fucsina bsica (parafucsina) con acido sulfuroso. Compuesto incoloro
que cuando reacciona con los grupos aldehdos de las molculas tisulares se recolaran.

2. Reaccin de Feulgen; Tambin permite detectar el ADN.

En este mtodo la pieza de tejido previamente fijado y cortado se somete a una
hidrolisis acida dbil y luego se trata con el reactivo de Schiff.
a.

La hidrolisis; va ha extraer el ARN y las purinas del ADN (guanina, adenina), en

esa extraccin va a liberar los grupos aldehdos de la pentosa (desoxirribosa), y
estas van a reaccionar con el reactivo de Schiff.

Tcnica Histoqumica
Reaccin

de PAS; Esta reaccin se basa en la oxidacin,

mediante el acido peryodico, de los grupos glicolicos 1,2 de los
polisacridos, que va a permitir la liberacin de los grupos
aldehdos que luego van a reaccionar con el reactivo de Schiff.
Se utiliza para detectar mucinas, el acido hialuronico. Etc.

Colorantes

liposolubles; Permite la detencin de lpidos en

tejidos fijados por congelacin, Se utiliza:

1.

el tetroxido de osmio, que es colorante liposubles que tie de negro

a los cidos grasos no saturados de los triacilgliceroles.

2.

Sudan IV y rojo escarlata, tienen mayor valor histolgico debido a

que actan por solubilidad y difusin.

3.

Sudan negro B; brinda un mayor contraste, y tiene la ventaja de

disolverse en los fosfolpidos y el colesterol.

Tcnica Histoqumica
Tcnicas enzimticas; se basan en la detencin de las enzimas

tisulares mediante un sustrato. La fijacin se puede realizar en

algunas enzimas mediante el criostato, o a otras enzimas
resistentes mediante acetona fra, formaldehido o glutarldehido.
Ej.; Mtodo de Gomori; Para detectar la Fosfatasa alcalina se utiliza
como sustrato esteres fosfricos de glicerol.
Fluorescencia;

Los
componentes
qumicos
descubiertos por la fluorescencia que emiten:

tisulares

1. Natural: derivada de sustancias normales del tejido.

2. Secundaria: inducida por colorantes fluorescentes (fluorocromos)

Tambin se le puede aplicar para el estudio de desplazamientos de

protenas en las membranas celulares.

son

Tcnica Histoqumica
Trazadores; Se utilizan para el estudio de ciertos procesos

celulares, endocitosis.
Estos trazadores suelen ser enzimas que poseen un alto grado de
opacidad a los electrones que permiten detectar las vas de
transporte de ciertas sustancias, tanto dentro como afuera de la
clula.
Ej.. La peroxidasa se detecta mediante la diaminobencidina en
presencia de perxido de hidrogeno.

Positividad lnmunohistoquimica perivascular para actina

de msculo liso. (Diaminobencidina x200).

La compleja estructura de la retina

en el ojo de un ratn. Las clulas
fueron resaltadas con un colorante
fluorescente

Imagen de un corte de 60 m de grosor de cerebro obtenida con un

criostato y procesada para histoqumica enzimtica que pone de
manifiesto una actividad diaforasa perteneciente a la enzima xido
ntrico sintasa neuronal que aparece en algunas neuronas (clulas

Tcnica
Inmunohistoqui
mica

En

esta
tcnica
se
utilizan
anticuerpos
y
la
propiedad
antignica de las protenas tisulares.

Los

anticuerpos se unen con el

antgeno,
formando
el
complejo
anticuerpo-antgeno,
el
cual
se
conjuga con marcadores especiales,
que se revelan con la ayuda del
microscopio
ptico
comn,
Microscopio
de
fluorescencia
(colorantes
fluorescentes)
o
el
microscopio electrnico (ferritina,
partculas de oro coloidal)

Tambin
Clulas epiteliales teidas con
DAPI (azul) y dos anticuerpos
(verde y rojo) mediante tcnica de
inmunofluorescencia

el

complejo anticuerpoantgeno
puede
ser
revelado
mediante radioautografia cuando se
marca con tritio.

Tcnica de
Radiautogra
fia

Se basa en la marcacin de ciertas

sustancias
tisulares
radioistopo.

con

un

El preparado (el tejido marcado con

el radioistopo) se pone en contacto

con una emulsin fotogrfica que
presenta cristales de bromuro de
plata durante breve periodo.
El radioistopo interactan con los

cristales de bromuro de plata y se va

revelar
mediante
una
fotografa
comn, (En forma de pequeos
puntitos
brillantes),
el
cual
se
observa al microscopio electrnico.

GRACIAS POR SU
ATENCION