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PLAN DU COURS
Chapitre.1
Structure des acides nucliques & relations
structure / fonction.
Chapitre. 2
Expression gntique & systmes de rgulation.
Transcription & traduction
Cycle cellulaire & rplication de lADN
Chapitre. 3
Systmes de mutation & de rparation de lADN in
vivo.
Chapitre. 4
Biologie molculaire du cancer
(Proto-oncognes, oncognes, apoptose & agents
anti-cancer).
Chapitre. 5
Biologie molculaire des virus, virodes & prions
(Analyse molculaire & moyens gntique de
diagnostique & de traitement).
Chapitre. 6
Outils, techniques & applications de biologie
molculaire.
OBJECTIFS DU COURS :
Partie Biologie Molculaire
Transmettre ltudiant :
1. Les bases essentielles de la Biologie Molculaire.
2. Une comprhension spcifique des mcanismes
molculaires clef & communs diffrent organismes.
3. La capacit danalyser ces diffrents processus
molculaires.
Chapitre. 1.
Structure des acides nucliques
& relations structure / fonction.
Objectifs:
1. Connatre la structure des acides nucliques;
2. Savoir reconnatre les molcules simples dont ils sont
constitus;
3. Connatre leurs fonctions dans lexpression gntique.
1. 1. Ribose, dsoxyribose
Bases puriques
Bases pyrimidiques
Nuclosides
Nuclotide AMP
Nuclotide GMP
Nuclotide CMP
Nuclotide UMP
Hybridation A - T
Hybridation G - C
Acide dsoxyribonuclique
La double hlice
Dans lespace les deux brin dADN antiparallles &
complmentaire prsentent une configuration
hlicodale.
Elles senroulent autour dun axe imaginaire pour
constituer une double hlice rotation droite
(dans les formes A et B de lADN)
La forme B de lADN
La forme biologique la plus importante de lADN;
10 paires de bases par tour de spire;
Le pas de lhlice 3,4 nm;
Le diamtre de lhlice est de 2,4 nm;
Les bases puriques et pyrimidiques sont
lintrieur de lhlice
Les groupements phosphates et les dsoxyriboses
sont lextrieur;
Deux types de sillons appels :
sillon majeur (1,2 nm de large) et sillon mineur
(0,6 nm de large).
La forme Z de lADN
Double hlice rotation gauche;
12 paires de bases par tour dhlice;
Le pas dhlice est 4,6 nm;
Diamtre de lhlice est plus petit 1,8 nm;
Les bases sont enchanes avec une alternance de
conformation;
Le Z-ADN a t dcel dans des chromosomes de
mammifres;
Fonction prcise mal connue, (rgulation structurale de
lexpression gntique).
TOPOISOMRES.
Les topoisomres sont deux molcules dADN qui ont
la mme squence & diffrent uniquement par le
nombre denlacements ( superenroulement ou le
nombre de tours que fait lun des brins autour de lautre
brin). Il existe Diffrents tats des topoisomres.
LADN peut exister:
ltat relch avec une contrainte minimale dans la
molcule. Cest la forme la plus stable de la molcule.
Cependant, laxe de la double hlice dADN peut
senrouler sur lui-mme en formant un super
enroulement.
LES TOPOISOMRASES
Les topoisomrases sont des enzymes qui modifient le
nombre denlacements. Elles augmentent ou diminuent le
nombre de supertours dans les molcules dADN double
brin.
Les topoisomrases de type I: Coupent transitoirement et
ressoudent un seul brin dADN double brin. Ils peuvent
agir sur de lADN superenroul positif ou ngatif.
Les topoisomrases II : coupent de manire transitoire
les deux brins de lADN, puis les ressoudent et agissent
uniquement sur lADN superenroul ngatif (exemple:
gyrase bactrienne).
Les topoisomrases I & II permettent de dsenrouler
(relacher) lADN.
STRUCTURE DE LA CHROMATINE
Condensation de la chromatine dans les cellules
somatiques
de
nuclosomes
forme
des
Chez lhomme :
3 109 pb,
100.000 gnes,
46 chromosomes
(2 x 23)
LES TLOMRES.
Les tlomres constituent les extrmits des chromosomes
eucaryotes.
Ils sont forms par des squences rptitives dADN.
A lextrmit 3 des chromosomes, on retrouve des copies rptes
de squences de type TTGGGG (retrouves chez un protozoaire
cili: Ttrahymena) ou TTAGGG (retrouves chez lHomme).
A lextrmit 5, on a les squences complmentaires riches en
cytosine.
Le problme majeur lors de la rplication de lADN est llimination
potentielle de lamorce dARN la plus externe ce qui pourrait
entraner un raccourcissement de lADN chaque cycle de
rplication.
La protection des extrmits des chromosomes des eucaryotes est
assure par une enzyme spcifique: la tlomrase.
TLOMRASE
La rplication de lADN lextrmit des chromosomes
eucaryotes fait donc intervenir une enzyme particulire
appele tlomrase.
Cette enzyme ajoute des squences spcifiques en 3 dun brin
dADN.
La tlomrase va se positionner lextrmit 3 du brin dADN.
La tlomrase possde une matrice qui lui est propre et qui est
une matrice dARN, elle va se fixer lextrmit 3:
(3 brin parental + tlomrase)
Une rptition de motifs: TTGGGG est synthtise.
Elle constitue le tlomre.
I.6. PSEUDOGENES
Certains gnes apparus par duplication au cours de
lvolution ont subi des mutations gntiques
(substitutions, insertions, dltions, etc...) qui empchent la
transcription ou la traduction;
Exemple: (codon Stop prmatur)
Il en rsulte que mme si la transcription conduit un ARN
messager, celui-ci ne peut tre traduit
Ce codon stop prmatur transform le gne fonctionnel
pseudo gne non traduit.
en
Conversion de gne:
Les squences de gnes peuvent tre
transformes par change dexons complets
(par une transposition partir dun autre gne).
La transposition dun exon peut ajouter un
domaine nouveau dans la structure dune protine
ou restaurer un domaine devenu non fonctionnel
au cours de lvolution.
INFORMATION GENETIQUE
Expression Gntique :
Transcription &Traduction
Rplication & Cycle Cellulaire
Expression Gntique
Dfinitions :
La double hlice
Gne
5.AGCTTAACGCGTA. 3
3.TCGAATTGCGCAT. 5
Transcription
5.AGCUUAACGCGUA. 3
antisens=transcrit.
mRNA
1.A. La transcription
Cis- et trans-rgulateurs
Les squences de nuclotides du promoteur=(facteurs cisrgulateurs), sont reconnues par une classe de protines
spcifiques=(facteurs trans-rgulateurs) dont la structure permet
une liaison avec lADN (DNA binding proteins).
La structure secondaire et tertiaire des DNA binding proteins
comprend
des
domaines
spcifiques
permettant
la
reconnaissance des squences rgulatrices du gne : - domaines
en doigts de zinc/ structures riches en leucine en forme de
fermeture Eclair (Leu zipper)/ homodomaines, bHLH = rgion
basique, hlice a, boucle, hlice a/ - domaines riches en
glutamine/ domaines riches en proline/ - hlices a acides (Asp,
Glu).
Les squences qui reconnaissent les DNA binding proteins
(facteurs cis-rgulateurs=promoteur) ont des effets sur la vitesse
de la transcription: activateurs = (squences enhancer) ou
inhibiteurs = (s-quences silencer). Leur liaison avec les protines
dpend le plus souvent de circonstances physiologiques qui
induisent ou rpriment lexpression du gne.
Initiation de la transcription
La RNA polymrase II est lenzyme de la transcription des gnes
exprims sous forme de protines.
Elle est prsente dans tous les noyaux cellulaires. Sa masse
molculaire est de 500 kilo daltons pour 10 sous-units.
La transcription quelle catalyse ncessite des ribonuclosides
triphosphates comme substrats (ATP, CTP, GTP et UTP), plusieurs
cofacteurs protiniques (transcription factors)
Lnergie de la raction est fournie par lhydrolyse des liaisons
riches en nergie des nuclosides triphosphates (42 kJ/mol).
Initiation de la transcription
Linitiation de la transcription sur un promoteur humain implique
plusieurs facteurs de transcription, connus sous les noms de TFIIA,
TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH et TFIIJ en plus de la RNA
polymrase II elle-mme.
Au centre de ce mcanisme initial, il y a lassociation de TBP, la
sous-unit reconnaissant lADN du facteur TFIID, avec la bote TATA
du promoteur. Ladjonction successive de TFIIB et de RAP30, petite
sous-unit de TFIIF , sont ensuite ncessaires pour la fixation de la
polymrase et dterminent la fois le brin transcrit et le sens de la
transcription. A ce complexe ADN-TFIID-TFIIB-RAP30-polymrase II,
sajoutent encore successivement la grande sous-unit de TFIIF
(RAP74), TFIIE et TFIIH.
Alors la transcription peut commencer si les ribonuclotides
substrats sont prsents.
Elongation de la transcription
Exon
Exon 1
Fin de la transcription
Modifications du transcrit
Excision - pissage
Formation du lasso
Lexcision des introns et lpissage des exons est ltape la plus importante
de la maturation du transcrit dans le noyau cellulaire.
Elle fait appel des facteurs spcifiques : ribonucloprotines contenant
des petits ARN (snR-NP), ribozymes (ARN ayant des proprits catalytiques),
protines codes par les introns eux-mmes (maturases)...
La structure secondaire du transcrit met en contact trois squences de
lintron : la squence du dbut de lintron (extrmit 5 ou site donneur), la
squence de la fin de lintron (extrmit 3 ou site accepteur) et une squence
riche en pyrimidines (C ou U) contenant un nuclotide adnine (A du
branchement).
Le site donneur commence habituellement par un nuclotide guanine
dont le phosphate est dtach de lexon prcdent pour tre transfr sur le
carbone 2 de lA du branchement. Le dernier nuclotide du site accepteur,
aussi une guanine, est dtach de lexon suivant, dont le premier nuclotide
est li par son phosphate 5 au carbone 3 du dernier nuclotide de lexon
prcdent.
Lintron, libr sous forme de lasso, est dtruit par des nuclases. Le
transcrit perd successivement tous ses introns et les exons pisss
constituent la squence codante du messager.
RNA Messager
La traduction
Lors de la traduction:
la structure transcrite sur lARNm, sexprime par la
synthse de protines dont la squence traduit en
acides amins linformation porte par la structure
primaire de lADN.
La traduction est faite dans le cytoplasme des
cellules :
soit pour librer des protines cytoplasmiques,
soit pour conduire ces protines dans les membranes
ou les organites de la cellule (reticulum
endoplasmique, appareil de Golgi, membrane
plasmique, lysosomes, mitochondries, noyau, etc...),
soit pour excrter ces protines travers les
membranes vers lextrieur de la cellule.
Codon
Code gntique
Ribosome eucaryote
Les
Polyribosomes
ARN de transfert
Initiation de la traduction
Cadre de lecture
Facteurs dinitiation
Elongation
Un ARNt charg vient se fixer sur le site A libre. Le codon du messager au fond
du site A va se lier complmentairement avec lanticodon de lARNt du nouvel
acide amin ce qui va permettre lincorporation de cet acide amin dans le
peptide en cours de synthse.
Transfert du peptide
Le ribosome catalyse alors le transfert du peptide situ sur lARNt du site P sur
la fonction amine de lacide amin de lARNt du site A. Il utilise pour cela,
lnergie de lhydrolyse de la liaison ester riche en nergie entre le peptide et
lARNt du site P.
Terminaison de la traduction
Lorsque le site A se trouve en regard dun codon nonsens annonant la fin de la traduction, le complexe va
se dissocier du messager en prsence dun dernier
cofacteur eRF.
Les deux sous-units du ribosome se dissocient, la
protine synthtise est libre, ainsi que le dernier
ARNt.
Signal-peptide
Lorsquune protine est synthtise, sa structure secondaire ou
tertiaire se construit au fur et mesure de la traduction et elle est libre
dans le cytoplasme.
Lorsque cette protine est destine tre incorpore dans les
membranes ou les organites de la cellule, la partie codante de lARN
messager commence par une squence de quelques acides amins qui
sert dadresse pour lincorporation de cette protine dans la membrane.
Ces peptides orientent la destine de la protine : incorporation dans
les membranes (reticulum endoplasmique, appareil de Golgi, membrane
plasmique, lysosomes...), entre dans les mitochondries, excrtion hors
de la cellule via lappareil de Golgi, etc...
Le signal-peptide est un peptide dadressage situ lextrmit NH 2
-terminale des protines excrter. Parce que sa fonction est de pntrer
dans la membrane du reticulum endoplasmique, sa structure est riche en
acides amins hydrophobes (Phe, Leu, Ile, Met, Val).
Polyribosomes lis
Les polyribosomes qui se forment sur un messager comportant
un signal peptide ont une volution lgrement diffrente. La
traduction sarrte peu aprs la synthse du signal-peptide, ds
que celui-ci apparat hors de la structure du ribosome et se lie avec
la SRP (SRP = Signal Recognition Particle), qui inhibe llongation.
Pour que llongation puisse se poursuivre, il faut que la SRP soit
reconnue spcifiquement par un rcepteur de la membrane du
reticulum endoplasmique. Ds que cette liaison est tablie, le
ribosome est li par la ribophorine, toujours dans la membrane du
reticulum, prs dune protine qui ouvre un pore travers cette
membrane. Le SRP cart, llongation va reprendre.
La rplication
Au cours de la vie de la cellule (cycle cellulaire, dune
division mitotique la suivante), lADN doit tre ddoubl
pour que chaque cellule fille reoive un gnome complet
dans son noyau.
Cette synthse se produit la phase S (au milieu du cycle
cellulaire) grce lactivit de la DNA-polymrase a.
Dautres DNA-polymrases participent la rparation de
lADN ls ou la rplication de lADN mitochondrial.
Le cycle cellulaire
La vie de la cellule se droule entre deux mitoses. Chez les Mammifres,
cette priode dure en moyenne 30 heures bien quil y ait des cellules dont la
vie soit trs courte ou au contraire trs longue.
Durant ces trente heures la cellule traverse quatre phases :
la phase G1 o le gnome tant diplode, chaque gne est reprsent en
deux exemplaires. La chromatine est accessible aux RNA-polymrases qui
transcrivent les gnes en messagers, qui seront leur tour traduits. Phase de
prparation la synthse dADN.
vers la moiti du cycle commence la rplication de lADN : les DNApolymrases vont mettre environ 8 heures (phase S) pour recopier en double
lADN de chaque chromosome. Durant cette phase la transcription est
inhibe. Phase de synthse dADN.
puis la cellule entre en phase G2 o chaque gne est reprsent en quatre
exemplaires. La chromatine est nouveau accessible aux RNA-polymrases
qui recommencent transcrire. Phase de rparation des mutations.
enfin survient la mitose, qui donne naissance deux cellules filles.
Chacune recevra une des copies identiques de lADN de chaque
chromosome et chaque gne y sera reprsent en deux exemplaires.
DNA polymrase
Les DNA-polymrases sont des enzymes du noyau
cellulaire qui agissent en phase S du cycle pour doubler
systmatiquement lensemble du gnome diplode.
Elles utilisent des dsoxyribonuclotides triphosphates
(dATP, dCTP, dGTP et dTTP) et des amorces de RNA
synthtises par une DNA primase (RNA polymrase
capable de synthtiser un court brin de RNA
complmentaire dun brin de DNA).
Elles synthtisent lADN nouveau par fragments qui sont
lis entre eux par une DNA-ligase.
Elles ont aussi une activit exonuclasique, qui leur permet
en particulier dhydrolyser lARN des amorces.
Rplication
Les DNA-polymrases commencent leur synthse en de nombreux
points dinitiation de la rplication. La synthse de DNA commence sur
des amorces de RNA constitues par la DNA-primase.
La rplication se poursuit dans une direction : dans ce sens lun des
deux brins de lADN (brin avanc ) est parcouru par lenzyme dans
le sens 3 -- 5 ce qui permet la synthse dun autre brin dans le sens
5-- 3. Les DNA-ligases assurent ensuite la liaison entre les diffrents
fragments de lADN nouveau.
La synthse de lautre brin (brin retard ) est plus complexe parce
que lenzyme parcourt ce brin de 5 -- 3. La DNA primase synthtise
des amorces de quelques nuclotides en avant de la zone de rplication,
et la DNA polymrase construit la suite de petits fragments dADN
dans le sens 5---3. La DNA polymrase hydrolyse en avanant lamorce
de RNA du fragment prcdent (activit exonuclasique).
Les petits fragments seront ensuite relis entre eux par la DNA-ligase.
LADN polymrase III utilise lADN comme matrice (sens 53), lARN comme
amorce & comporte 7 sous-units catalytiques. les amorce dARN sont
synthtises par une ARN polymrase ou primase. lADN polymrase III allonge
cette amorce dARN
Lhydrolyse et le remplacement des amorces dARN,
intervention de la RNAse H, lADN polymrase I et une DNA-ligase.
Les ADN polymrases I et III impliques dans la rplication de lADN
prsentent plusieurs fonctions enzymatiques:
une fonction polymrasique: ajoute un nuclotide lextrmit 3 OH dun acide
nuclique, une fonction exonuclasique 53 (activit de rparation de lADN) &
une fonction exonuclasique 35 (lenzyme vrifie le dernier nuclotide mis en
place).
Terminaison de la rplication.
IL existe au moins 6 sites de terminaison ou sites (ter) de terminaison dans le
gnome bactrien. Une protine spcifique appele Tus peut se lier aux sites de
terminaison.
Cette liaison arrte la protine dnaB (hlicase).
Les microlsions.
Dans ce cadre, on range les mutations ponctuelles de
lADN.
dltion, insertion ou substitution, dun nuclotide par
un autre.
La substitution dune paire de bases par une autre peut
sagir
dune transition ou dune transversion;
La transition: correspond au remplacement dune base
purique par une autre base purique ou
une base pyrimidique par une autre base
pyrimidique.
La transversion: correspond au remplacement dune
base purique est par une pyrimidine ou
dune pyrimidine par une purine.
substitution non-synonyme:
Dltion
dltion, cest dire suppression dun ou de plusieurs nuclotides
Les dltions sont dimportance variable selon le nombre de
nuclotides suprims:
de 1 ou 2 nuclotides, elles dcalent le cadre de lecture
(codons)
de 3 nuclotides, elles aboutissent la suppression dun
acide amin dans la protine ex-prime
de grande longueur, elles peuvent supprimer lexpression
dun ou de plusieurs exons, voire dun gne entier.
Insertion:
Insertion, cest dire addition dun ou de
plusieurs nuclotides.
Les insertions sont dimportance variable selon
leur longueur :
de 1 ou 2 nuclotides, elles dcalent le cadre
de lecture (codons)
de 3 nuclotides, elles aboutissent
laddition dun acide amin dans la protine
exprime
de grande longueur, elles peuvent modifier
compltement la traduction des exons
dans les introns ou dans les exons nontraduits, on rencontre souvent de longues
insertions de structure variable qui ont des
effet ??? sur lexpression du gne.
Lexcision-rparation de base.
Ce type de rparation est communment utilis pour liminer les
bases incorrectes (comme luracile) ou les bases transformes par
des agents alkylants.
Il comprend trois tapes successives:
Tout dabord, une limination de la base incorrecte par une
ADN N-glycosylase avec apparition dun site AP.
Puis, une coupure du brin dADN endommag en
AP, crant ainsi un -OH (3) adjacent au site AP.
5 du site
mthyles
Lexcision-rparation de nuclotide.
Bien que lexcision-rparation de base joue un rle trs important
comme processus de rparation de lADN, elle ne peut pas suffire
corriger toutes les erreurs dans lADN.
En particulier, la disponibilit des ADN N-glycosylases ne peut pas tre
tendue toutes les altrations possibles des bases de lADN.
Un autre mcanisme plus flexible de rparation est impliqu. Ce
mcanisme est appel excision-rparation de nuclotide. Il est disponible
dans tous les organismes vivants et il implique les tapes suivantes:
Tout dabord, la reconnaissance du dommage sur lADN.
Puis une liaison dun complexe multi-protique avec le site
endommag.
Une double excision du brin endommag suit avec coupure
plusieurs nuclotides en 5 et en 3 de celui-ci.
La lacune prsente est comble par une ADN polymrase.
Une soudure finale est ensuite assure par une ADN-ligase.
Chez E. coli,
trois protines, les produits des gnes uvrA, uvrB et uvrC sont
responsables de la reconnaissance du dommage et de la coupure de
lADN
Le modle actuel implique la formation initiale dun complexe entre
deux protines uvrA et uvrB et ceci avec hydrolyse dATP
Ce complexe se lie avec lADN prfrentiellement au niveau de la zone
endommage (dimres de thymine)
Une autre protine uvrC se lie avec uvrB
ceci entrane une coupure en 5 (7 nuclotides avant le dommage) et en
3 (4 nuclotides aprs le dommage)
Intervient, la proteine du gne uvrD, qui est une hlicase II, elle dplace
loligonuclotide endommag
lADN polymrase I ou lADN polymrase II comble la lacune rsultante
La soudure finale est assure par une ADN-ligase.
Le systme S.O.S.
Le systme S.O.S. a t dcrit initialement chez les
bactries. Il concerne au moins une vingtaine de gnes
dont les produits protiques sont impliqus dans les
mcanismes de rparation et de recombinaison. Ce
systme est remarquable parce quil est inductible, cest-dire mis en oeuvre par lagression physique ou
chimique.
La protine de recombinaison RecA joue un rle central
dans un tel mcanisme de sauvegarde.
La synthse de cette protine est normalement rprime
par une protine appele LexA ou rpresseur.
Si un besoin important de protine RecA apparat, la
rpression est leve grce une proprit particulire de
la protine RecA qui est capable de cliver son
rpresseur.
MECANISME DE L'ONCOGENESE
L'ADN = sige des altrations successives
Lorigine monoclonale de la population de cellules formant
une tumeur a pu tre vrifie dans de nombreux cas l'aide
de marqueurs gntiques
L'analyse d'une tumeur maligne indique que toutes les
cellules expriment la mme forme et donc que la masse
tumorale correspond l'expansion d'un clone cellulaire.
Filire virale
Le chef de file des retrovirus tumorignes est le Virus du
Sarcome de Rous (RSV), virus ARN, dont l'intgration dans
le gnome d' une cellule est possible grce la retrotranscriptase, (une enzyme qui permet la transcription de
l'ARN en ADN).
Son pouvoir transformant est entirement contenu dans le
gne src, dont l'insertion dans le gnome de la cellule hte
peut provoquer la transformation cancreuse. On en retrouve
un quivalent dans le gnome de toutes les cellules normales
de l'hte et de nombreuses autres espces.
Cet homologue cellulaire d'un oncogne viral est un gne
cellulaire non transformant ou protooncogne.
Oncogenes Retroviraux
Les proto oncognes codent pour des protines qui jouent un rle
central dans la stimulation de la division cellulaire. Les oncognes
dorigine retro virale sont classs en 4 groupes:
1. Facteurs de croissance, (C-sis) & rcepteurs de facteurs de
croissance (C fms & CerbB);
2. GTP-binding proteins, (C h-ras, C k-ras, C n-ras);
3. Tyrosine specific protein kinases (C abl, C fes, C fgr, C fps,
Cros, C src, and C yes);
serine/threonine specific protein kinases (C mil, C mos, C
raf).
4. Transcription regulators(C fos, C jun, C erb A, C myc, C myb,
&Cets).
Les protines produites par les Proto oncognes, sont alteres
par des mutations, infections viral, ou agents carcinognique. Ces
protines oncogniques codent pour des protines modifies et
sur exprimes qui stimulent une division cellulaire anormale.
Pouvoir transformant
La technique de transfection de fragments d'ADN extraits de
lignes cellulaires malignes ou de cellules tumorales fraiches
des cellules fibroblastiques en culture (cellules NIH 3T3)
permet d'identifier des gnes porteurs d'un pouvoir transformant
puisque capables de confrer ces cellules un phnotype malin.
La premire mise en vidence de gnes transformants non viraux
a t ralise par transfection de petits fragments d'ADN
permettant la transformation maligne.
Les oncognes ainsi isols sont nombreux. Le chef de file en est
la famille des gne ras, isols partir d'une tumeur spontane de
la vessie chez l'homme et dont l'activation se fait toujours par une
mutation ponctuelle sur un seul codon. Cette altration conduit
la production d'une protine mute, ne diffrant de la protine
native que par un acide amin, modle de mutation purement
qualitative.
Filire cytogntique
L'amlioration des techniques de cytogntique a permis de
reconnatre, parmi les trs nombreuses anomalies chromosomiques
retrouves dans diffrents types de cancers, la spcificit de
certains remaniements non alatoires.
Les trois types de lsions morphologiques connues sont:
les amplifications gniques, les translocations chromosomiques et
les dltions.
Amplifications de proto-oncognes
L'amplification correspond l'accumulation d'un grand nombre de
copies d'un mme gne. Son existence est souponne en analyse
cytogntique sur la prsence de rgions chromosomiques se
colorant de manire uniforme appeles Homogeneous Staining
Rgions (HSR) ou se prsentant comme des mini chromosomes
surnumraires (chromosomes "double minute").
Les techniques de biologie molculaire ont permis de montrer que
ces anomalies correspondent une amplification gnique, portant
sur certains proto-oncognes.
fusions de 2 gnes
Dltions chromosomiques
Elles ont t mises en vidence dans le cadre de l'tude des cancers
hrditaires o elles ont conduit la notion danti-oncognes".
La constatation de la perte de la tumorignicit d'une cellule hybride
obtenue par fusion entre une cellule maligne et une cellule normale,
a conduit la notion de "gnes suppresseurs" dont l'inactivation
pourrait tout aussi bien tre responsable de la croissance tumorale
que l'activation des oncognes.
Le modle tumoral choisi pour vrifier leur existence a t le
rtinoblastome, une tumeur maligne dans laquelle on distingue 2
formes cliniquement bien distinctes :
la forme familiale, hrditaire, o s'observent frquemment des
atteintes occulaires bilatrales et o les cellules tumorales
prsentent souvent une dltion sur le bras long du chromosome 13,
et la forme sporadique, plus frquente, o les atteintes sont le
plus souvent unilatrales.
Retinoblastome
Origine Molculaire & Genetique
Perte de fonction du gne RB
gne suppresseur de tumeurs
mutation Germinale du gne suppresseur de
tumeurs RB
Substitution: C T
chromosome 13
inactivation de son expression
Retinoblastome hrditaire ou sporadique,
Cancer infantile
cause des tumeurs multiples impliquant les
deux yeux,
Ou une tumeur isol au niveau dun oeil
Neurofibromatoses
Origine Molculaire & Genetique
Perte de fonction du gne NF1
gne suppresseur de tumeurs
locus du gne: sur le chromosome 17
Le gne NF1 produit:
la Neurofibromine
(une protine activatrice de la GTPase)
Maladie gntique autosomique & dominante
Cause des neurofibromes multiples
& une prdisposition au tumeurs du systme
nerveux
gne P53:
localis sur chromosome 17
Code pour une protine de 53 kD
DNA-binding nuclear protein
Transcription factor
Facteur clef de la rgulation du cycle
cellulaire
Perte de fonction de P53
Cause des types multiples de cancer
Virus de lhpatite
Types: A, B, C, D, E;
diffrents structures, modes de contamination & pouvoir pathogne
HBV
Virus ADN, gnome < 5 kb,
Gnome double brin partiel:
Brin long (-) antisens = 3,2 kb
Brin court (+) sens =longeur variable
Gnome circulaire, complmentarit partielle (200nt) lextrmit 5des
deux brins.
Gnome particulier: Gnes chevauchants permettent un petit gnome
3,2 kb de coder pour plusieurs protines
Une sequence 3 cadres ouvert de lecture (ORF): transcrit 3 RNA &
traduit 3 protines
protines code
DNA polymerase
C (core)
Pr C
Pr S1
Pr S2
S
Rplication de HBV
Rplication sans intgration dans le DNA de la cellule
hte.
Virus ADN
Le transcrit RNA 3,5 kb traduit protines:
polymerase, HBc &Hbe
Le mme RNA 3,5 kb donne :
RNA pregnomique qui donne DNA genomique
Par reverse transcriptase.
Dtection de HBV:
Analyse du sang et dtection de lAg HBs avec lAc anti HBs
Dtection de lADN virale par PCR Polymerase Chain Reaction
Prevention de HBV:
Vaccins:
Protine Ag = HBs
Pptide synthtique = oligopeptide antignique de HBs
Vaccins recombinant spars par Gnie gntique:
Construction gntique: Vecteur, promoteur& gne S
Introduction dans les levures, production de HBs non glycosyle
Vaccin recombinant + immunognique
Construction gntique: Vecteur, promoteur sequences pr S2 & S
Cellules drives dovaires de hamster chinois (CHO)
Produit HBs courte & moyenne glycosyl = augmente immunogncit
Essais de vaccins recombinant vivant = modifier gntiquement
(non virulent).
Virus HCV
Variante dtecte grce la biologie molculaire par
squenage
Virus ARN monobrin = 10 kb
RNA gnomique brin codant (+)
Gnes codent pour protines structurales
nuclocapside, lenveloppe & les prots trans membranaires
les gnes qui codent pour la rplicase
Patient prsence Ac Anti HCV = dtction tardive
Dtection prcoce de lARN virale Rt PCR
Virus HIV 1
Virus RNA = Rtrovirus,
RNA donne DNA par la Reverse transcriptase
DNA viral intgre DNA de la cellule hte C T4 = T CD4+
Test ELISA (Enzyme Linked Immuno essay) detecte prsence dAc anti HIV
Test de confirmation: Western blot
Tests tardifs
Tests precoces : Rt PCR dtection RNA viral,
PCR dtection DNA viral
Virodes
Structure + Simple que le virus
Une molcule de RNA non protge par protines
Structure en btonnet permet de rsister aux attaques par nuclases
2/3 de complmentarit de squence de lARN
Rsponsable de maladie chez les plantes
Homme??
Hypothse Prusiner:
Conversion de PrPc ( structure en hlice )en PrPsc (structure en
Feuillet ) provoque par: PrPsc.
Formation d un htro dimre entre PrPc & PrPsc.
Transformation de PrPc en PrPsc.
Accumulation de PrPsc dans les lysosymes qui clatent & les enzymes
Lysosomales endommagent les cellules nerveuses.
Les prions librs attaquent dautres cellules.
VECTEURS:
MATRICE:
SONDES:
Enzymes de restriction
Ligases
Nuclases
polymerases/ Taq polymerase
Squanases
Phosphatases/kinases
Plasmidiques
Viraux
hybrides
ADN, ARN, Protines
ADN, ARN, Oligonuclotides, Biopuces
Enzymes de restriction:
Endonuclases dorigine bactrienne, coupent lADN des squences
de reconnaissance,
Nomenclature:
Exemples:
EcoRIExtraitedeEscherichiacoliRYBsitereconnu:G/AATTC
SmaIExtraitedeSerratiamarcescenssitereconnu:CCC/GGG
PstIExtraitedeProvidenciastuartiisitereconnu:CTGCA/G
Typedecoupure:
Cohesiveends=cosends
cibles
RD
FISH
FISH
FDA-approved kit for HER-2 testing by FISH and follow the scoring and interpretation
recommended by the manufacturer. In this procedure, the chromosome 17 centromere
is marked with a green florescent signal and HER-2 gene with an orange florescent
signal. A tumor is designated as positive for gene amplification if gene-tochromosome (17) ratio is >2.0
Microarrays: Biopuces
La biopuce ADN est une plaque de verre ou de silicium sur laquelle sont graves un
grand nombre de microcuvettes.
Sur chacune dentre elles, on accroche une squence de bases dADN, qui joue le rle
de sonde et qui est caractristique dun gne, dune mutation ou dune maladie.
On prlve alors de lADN sur le patient et on le verse dans les microcuvettes.
LADN-sonde se liera avec lADN du prlvement si et seulement si les squences sont
complmentaires. On lave ensuite la biopuce.
Pour permettre la lecture du rsultat, on a pralablement accroch lextrmit de
lADN du prlvement une molcule fluorescente.
Ainsi, dans les microcuvettes o il y a eu appariement, lADN du prlvement est rest
accroch lADN-sonde et est visible la lumire ultraviolette grce la molcule
fluorescente.
Dans les microcuvettes o il ny a pas eu dappariement, lADN du prlvement a t
enlev par le lavage et il ny a pas de signal lumineux.