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BIOLOGIE MOLECULAIRE

1re ANNEE PHARMACIE


2015

Pr. Alami Ouahabi Nama


1

PLAN DU COURS
Chapitre.1
Structure des acides nucliques & relations
structure / fonction.
Chapitre. 2
Expression gntique & systmes de rgulation.
Transcription & traduction
Cycle cellulaire & rplication de lADN
Chapitre. 3
Systmes de mutation & de rparation de lADN in
vivo.

Chapitre. 4
Biologie molculaire du cancer
(Proto-oncognes, oncognes, apoptose & agents
anti-cancer).
Chapitre. 5
Biologie molculaire des virus, virodes & prions
(Analyse molculaire & moyens gntique de
diagnostique & de traitement).
Chapitre. 6
Outils, techniques & applications de biologie
molculaire.

OBJECTIFS DU COURS :
Partie Biologie Molculaire
Transmettre ltudiant :
1. Les bases essentielles de la Biologie Molculaire.
2. Une comprhension spcifique des mcanismes
molculaires clef & communs diffrent organismes.
3. La capacit danalyser ces diffrents processus
molculaires.

4. La capacit de distinguer les processus


molculaires cibls des fins thrapeutiques.
5. La capacit de slectionner les outils
molculaires ncessaires ce ciblage
thrapeutique.
6. Une comprhension globale de limportance des
techniques de Biologie molculaire dans
la pharmacologie, le diagnostique ainsi que la
thrapie prsente & future.

Chapitre. 1.
Structure des acides nucliques
& relations structure / fonction.
Objectifs:
1. Connatre la structure des acides nucliques;
2. Savoir reconnatre les molcules simples dont ils sont
constitus;
3. Connatre leurs fonctions dans lexpression gntique.

I. Structure des acides nucliques


Les acides nucliques ont t isols initialement des
noyaux des cellules. On peut en distinguer deux grands
types:
les acides dsoxyribonucliques (ADN): essentiellement
localiss dans le noyau des cellules
les acides ribonucliques (ARN): essentiellement
localiss dans le cytoplasme cellulaire.
Ces molcules biologiques (les acides nucliques)
contiennent linformation gntique.
Les acides nucliques (ADN et ARN) sont des
macromolcules composs de molcules simples et
comportent des sous-units appeles nuclotides.
Un nuclotide comporte trois composants:
un ose, une base & de lacide phosphorique.

1. 1. Ribose, dsoxyribose

Bases puriques

Bases pyrimidiques

Nuclosides

Nuclotide AMP

Nuclotide GMP

Nuclotide CMP

Nuclotide UMP

Les Acides Nucliques


Acide ribonuclique

Hybridation A - T

Hybridation G - C

Les polymres de nuclotides:


La molcule dADN est constitue en rgle de
deux chanes (ou brins) de nuclotides.
Les molcules d ARN sont le plus souvent sous
forme dun seul brin

Structure de lARN en forme d Epingle cheveux


(hair-pin loops)
Les nuclotides des acides ribonucliques peuvent quelquefois
sautohybrider en formant des structures secondaires

Acide dsoxyribonuclique

La double hlice
Dans lespace les deux brin dADN antiparallles &
complmentaire prsentent une configuration
hlicodale.
Elles senroulent autour dun axe imaginaire pour
constituer une double hlice rotation droite
(dans les formes A et B de lADN)

Sens de lecture dun acide nuclique.


Par convention,
on lit toujours un acide nuclique
de lextrmit 5 (groupement phosphate)
vers lextrmit 3 (OH libre).
on indique seulement La squence des bases dun ADN
(A, T, G ou C), en prcisant les extrmits 5 et 3.
Les 4 nuclotides de lADN avec les 4 bases (A, T, G ou C),
se combinent en une infinit de squences de la mme
manire que les 7 notes de musique composent une infinit
de symphonies.

La forme B de lADN
La forme biologique la plus importante de lADN;
10 paires de bases par tour de spire;
Le pas de lhlice 3,4 nm;
Le diamtre de lhlice est de 2,4 nm;
Les bases puriques et pyrimidiques sont
lintrieur de lhlice
Les groupements phosphates et les dsoxyriboses
sont lextrieur;
Deux types de sillons appels :
sillon majeur (1,2 nm de large) et sillon mineur
(0,6 nm de large).

La forme Z de lADN
Double hlice rotation gauche;
12 paires de bases par tour dhlice;
Le pas dhlice est 4,6 nm;
Diamtre de lhlice est plus petit 1,8 nm;
Les bases sont enchanes avec une alternance de
conformation;
Le Z-ADN a t dcel dans des chromosomes de
mammifres;
Fonction prcise mal connue, (rgulation structurale de
lexpression gntique).

Proprits physico-chimiques de lADN.

A la temprature Tm (de fusion), lADN est dnatur;


La dnaturation est rversible dans certaines
conditions;
Elle entrane des modifications physico-chimiques:
Augmentation de labsorption dans lultra-violet,
diminution de la viscosit, augmentation de la
densit.
Tm varie selon le pourcentage de bases (G+C) de
lADN tudi;
La prsence des bases puriques et pyrimidiques
permet aux acides nucliques (ADN et ARN)
dabsorber dans lultra-violet (UV) 260 nm.

I LA CONFORMATION DES ADN LES

TOPOISOMRES.
Les topoisomres sont deux molcules dADN qui ont
la mme squence & diffrent uniquement par le
nombre denlacements ( superenroulement ou le
nombre de tours que fait lun des brins autour de lautre
brin). Il existe Diffrents tats des topoisomres.
LADN peut exister:
ltat relch avec une contrainte minimale dans la
molcule. Cest la forme la plus stable de la molcule.
Cependant, laxe de la double hlice dADN peut
senrouler sur lui-mme en formant un super
enroulement.

Deux formes de superenroulement sont alors possibles:


-Un superenroulement qui correspond :
une augmentation du nombre denroulements dans la mme
direction que la rotation de lhlice B (rotation droite).
On parle de superenroulement positif.
-Un superenroulement de lADN autour de son axe dans la direction
oppose au sens des aiguilles dune montre.
Il y a donc au niveau de lADN relchement de la pression de
torsion. On parle de superenroulement ngatif.
Le superenroulement de lADN a des consquences importantes:
- Il permet de le rendre plus compact et diminuer ainsi le volume
occup dans la cellule.
- Ces modifications du degr denroulement de la double hlice
dADN influencent les interactions de lADN avec dautres
molcules
(protines qui rgulent lexpression gntique).

LES TOPOISOMRASES
Les topoisomrases sont des enzymes qui modifient le
nombre denlacements. Elles augmentent ou diminuent le
nombre de supertours dans les molcules dADN double
brin.
Les topoisomrases de type I: Coupent transitoirement et
ressoudent un seul brin dADN double brin. Ils peuvent
agir sur de lADN superenroul positif ou ngatif.
Les topoisomrases II : coupent de manire transitoire
les deux brins de lADN, puis les ressoudent et agissent
uniquement sur lADN superenroul ngatif (exemple:
gyrase bactrienne).
Les topoisomrases I & II permettent de dsenrouler
(relacher) lADN.

Rle des topoisomrases


Les deux types de topoisomrases ont une
importance capitale dans la rplication , la
transcription et la recombinaison de lADN. chez les
procaryotes et les eucaryotes.
Ces enzymes sont galement la cible dagents
mdicamenteux, soit par exemple :
les agents anti-bactriens de la classe des quinolones
qui inhibent les gyrases bactriennes
ou les agents anti-cancreux, (le taxol )qui agissent
en tant que anti topo isomrases I.
Exemple de poison anti topoisomrase I : ts HMG

STRUCTURE DE LA CHROMATINE
Condensation de la chromatine dans les cellules
somatiques

la molcule dADN nuclaire est fortement associe des


protines pour constituer la chromatine.
Les complexes protines-ADN sont appels nuclosomes.
Le nuclosome contient de lADN enroul autour dun
core constitu de 8 protines appeles histones
2x (H2A H2B, H3 et H4).

Les histones sont des protines de petit poids molculaire


(11-14 k Da);
Les histones sont riches en acides amins basiques (+);
Lhistone H1 nappartient pas au nuclosome, mais permet le
contact entre deux nuclosomes.
L enroulements successif
structures de type solnode.

de

nuclosomes

forme

des

Les solnodes forment des domaines (boucles de solnodes) de


60 kb (60. 000 pb).
Les boucles de solnodes senroulent ou sempilent afin de
former une mini bande chromosomale
Les mini bandes sempilent pour former un chromosome

Chez lhomme :
3 109 pb,
100.000 gnes,
46 chromosomes
(2 x 23)

Le projet du Gnome Humain


le squenage complet des 3 109 pb en juin 2001

Condensation de la chromatine dans les


spermatides
la spermiogense (maturation de la spermatide en spermatozode);
Changements morphologiques et physiologiques de la spermatide;
saccompagnent de changements drastiques au niveau nuclaire;
Les histones somatiques sont remplaces par des protines tsHMG
et des protamines;
Changement de la structure de la chromatine;
Augmentation de la condensation de lADN spermatique;
Inhibition de lexpression gntique transcription & traduction;
Autre model de la structure de la chromatine;
Assure transport sans danger du patrimoine gntique vers lovule.

Les travaux de recherche in vitro effectus sur la protine


tsHMG par N. Alami-Ouahabi & al, ont montr que cette
nouvelle protine nuclaire est implique dans:
La condensation et superenroulement de lADN;
Linhibition de la transcription donc de lexpression
gntique & de lactivit de division cellulaire;
Ces travaux ont galement montrs que tsHMG agit
comme agent anti topoisomerase I;
Pourrait tre un potentiel agent anticancer pour les
traitements par Thrapie Gnique.

LES TLOMRES.
Les tlomres constituent les extrmits des chromosomes
eucaryotes.
Ils sont forms par des squences rptitives dADN.
A lextrmit 3 des chromosomes, on retrouve des copies rptes
de squences de type TTGGGG (retrouves chez un protozoaire
cili: Ttrahymena) ou TTAGGG (retrouves chez lHomme).
A lextrmit 5, on a les squences complmentaires riches en
cytosine.
Le problme majeur lors de la rplication de lADN est llimination
potentielle de lamorce dARN la plus externe ce qui pourrait
entraner un raccourcissement de lADN chaque cycle de
rplication.
La protection des extrmits des chromosomes des eucaryotes est
assure par une enzyme spcifique: la tlomrase.

TLOMRASE
La rplication de lADN lextrmit des chromosomes
eucaryotes fait donc intervenir une enzyme particulire
appele tlomrase.
Cette enzyme ajoute des squences spcifiques en 3 dun brin
dADN.
La tlomrase va se positionner lextrmit 3 du brin dADN.
La tlomrase possde une matrice qui lui est propre et qui est
une matrice dARN, elle va se fixer lextrmit 3:
(3 brin parental + tlomrase)
Une rptition de motifs: TTGGGG est synthtise.
Elle constitue le tlomre.

Pour synthtiser le brin tlomre complmentaire riche en C,


une primase interviend avec synthse dune amorce dARN par
copie de lextrmit 3.
Puis lADN polymrase allonge la chane partir de lamorce dARN.
Finalement, une ligase assure la soudure finale.
Lactivit des tlomrases est trs rduite ou nulle dans les cellules
normales en culture. Aprs plusieurs rplications, les chromosomes
perdent leurs tlomres et deviennent instables.
Par contre dans les cellules cancreuses, lactivit des tlomrases
est augmente.
Les tlomres ainsi que les gnes & les activits des tlomrases
ont un intrt primordial dans la recherche des phnomnes
molculaires de vieillissement, de longvit & dimmortalit
cellulaire.

TERMES CLE EN BIOLOGIE


MOLECULAIRE

I.6. PSEUDOGENES
Certains gnes apparus par duplication au cours de
lvolution ont subi des mutations gntiques
(substitutions, insertions, dltions, etc...) qui empchent la
transcription ou la traduction;
Exemple: (codon Stop prmatur)
Il en rsulte que mme si la transcription conduit un ARN
messager, celui-ci ne peut tre traduit
Ce codon stop prmatur transform le gne fonctionnel
pseudo gne non traduit.

en

Au cours de lvolution des espces, le gnome sagrandit


continuellement par suite de duplications de gnes et de
transpositions.
Les duplications:
se produisent en tandem, une squence se trouvant rpte deux
fois dans le gnome la suite de la duplication.
Cette duplication permet chacune des copies de la squence
dvoluer pour son propre compte ce qui augmente les chances de
produire des caractres nouveaux.
Les transpositions:
rsultent de lincorporation dacides nucliques synthtiss hors du
gnome :
soit par incorporation du DNA dun virus,
soit par transcription reverse dun RNA de la cellule ou dun virus,
au moyen dune reverse-transcriptase qui produit un DNA
complmentaire (cDNA) et dune transposase qui lincorpore au
gnome de la cellule.

Conversion de gne:
Les squences de gnes peuvent tre
transformes par change dexons complets
(par une transposition partir dun autre gne).
La transposition dun exon peut ajouter un
domaine nouveau dans la structure dune protine
ou restaurer un domaine devenu non fonctionnel
au cours de lvolution.

Les phnomnes de transformation de gnes en


Pseudo gnes, de transpositions & de coversions de
gnes
Jouent un rle primordial dans lvolution, ladaptation
& la diversit gntique.
effet positif sur lexpression gntique.
Peuvent avoir un effet nfaste sur la rgulation de
lexpression gntique.
En effet un transposon peut lors de son mouvement
interrompre un gne codant pour un facteur important
de la rgulation du cycle cellulaire ou un facteur
biochimique vital & peut ainsi causer des mtastases
ou des pathologies.

LES ACIDES RIBONUCLIQUES (OU ARN)


CARACTRISTIQUES GNRALES
Les ARN sont caractriss par:
-Lose= ribose:
remplace le 2-dsoxyribose prsent dans les ADN.
-Les bases pyrimidiques et puriques rencontres sont:
A, C, G et U (cette dernire est remplace par T dans les ADN).
Une seule chane nuclotidique (au lieu de deux dans les ADN).
Cette unique chane est plus courte que les chanes dADN.
Les rgles dappariement entre les bases complmentaires
peuvent sobserver dans les ARN.
Dans certains cas: une mme chane dARN peut sauto hybrider
o les portions bi catnaire ont un appariement suivant la rgle:
A appari avec U (deux liaisons hydrogne) et C appari avec G
(trois liaisons hydrogne).
Ainsi les rgions apparies donnent des tiges & les rgions non
apparies donnent des boucles (structure en cruciforme) .

LES DIFFRENTS TYPES DARN.


Les cellules contiennent essentiellement quatre types
dARN:
- Les ARN ribosomiques (ou rARN).
- Les ARN de transfert (ou tARN).
- Les ARN messagers (ou mARN).
- Les ARN nuclaires de petite taille (ou snRNA)(ou
small nuclear RNA)(snRNA)
Dans la cellule, les rARN sont les plus abondants (au
moins 80% de lensemble des ARN de la cellule) et les
snRNA les moins abondants.

LES ARN RIBOSOMIQUES.


Ils constituent les ribosomes;
Les ribosomes sont des organites intra-cellulaires situs dans le
cytoplasme (galement dans les mitochondries) et qui sont
lusine de fabrication des protines de la cellule.
On peut distinguer les rARN des procaryotes (E. coli) et les rARN
des eucaryotes.
Les rARN des procaryotes (E. coli): constituent les ribosomes
dits 70 S (S = unit de sdimentation ou Svedberg) qui sont
forms de deux sous-units, une grande sous-unit (50 S) et une
petite sous-unit (30 S).
Chaque sous-unit comporte des protines dites protines
ribosomales (ou r-protines) et des rARN.

Les rARN des eucaryotes.


Chez les eucaryotes, les ribosomes sont plus gros (80 S) avec
galement une structure deux sous-units (40 S et 60 S).
La sous-unit 60 S contient trois rARN diffrents (5 S, 5,8 S et
28 S), et la petite sous-unit 40 S ne contient quun seul rARN
18 S).
Le nombre de protines ribosomales lintrieur de chaque
sous-unit est plus important que chez les procaryotes.
.

LES ARN DE TRANSFERT (tARN).


Les tARN sont les vecteurs qui vont transfrer les acides amins
jusqu lusine ribosome o seffectue la synthse protique.
Structure des tARN.
Les tARN prsentent bien entendu la structure gnrale des ARN.
Mais ils possdent en plus quelques particularits propres.
Des bases inhabituelles.Tout dabord, ils contiennent des
nuclotides inhabituels par les bases quils renferment. Ainsi,
lhypoxanthine, dont le nuclotide correspondant est lIMP (I =
inosine monophosphate), mais aussi la thymine ou des bases
mthyles.
La structure spatiale des tARN. Les chanes de tARN sont
constitues dune centaine environ de nuclotides. Surtout, il
existe des zones dappariement selon la rgle de complmentarit
et des zones appeles boucles sans appariement o sont
prsentes les bases inhabituelles.
La forme gnrale est celle dun L. En structure spatiale, on
prsente souvent les tARN sous forme de trfle ou un cruciforme.

Les sites importants dans les tARN.


Plusieurs sites sont importants dans les tARN. Tout dabord:
leur extrmit 3-OH. Il existe trois nuclotides caractristiques -CC-A-3-OH. Cest par cette extrmit que sera fix lacide
amin qui sera vhicul par le tARN.
Puis, lanticodon qui correspond un groupe de trois nuclotides
(ou triplet) situ sur une boucle du tARN. Ce triplet prsente un rle
trs important puisquil doit sapparier avec le codon correspondant
prsent sur lARN messager.
Cet appariement entre lanti-codon et le codon se fait par des
liaisons hydrogne et suivant les rgles de complmentarit.
Le codon et lanti-codon sont disposs de manire antiparalllle.

LES ARN MESSAGERS (mARN).


Les ARN messagers (ou mARN) constituent le support essentiel de
linformation gntique entre lADN et le ribosome o seffectuera la
synthse protique.
Leur dure de vie est trs courte la diffrence des tARN par
exemple. Chez les bactries, la dure de vie dun mARN est de
quelques minutes environ.
Les mARN sont trs rapidement synthtiss et dgrads.
Ils sont forms dune seule chane de nuclotides avec les bases
communes aux ARN: A, U, C et G.
Cette chane comporte une succession de triplets nuclotidiques.
Chaque triplet nuclotidique constitue un codon spcifique
dun acide amin donn.

Il existe naturellement une vingtaine dacides amins et


on dnombre 61 codons diffrents !
Ceci signifie quun acide amin pourra tre vhicul
par plusieurs tARN spcifiques (diffrent par leur
anticodon).
Enfin, lextrmit 5 des tARN comporte un groupement
phosphate.
Les tARN jouent un rle capital dans la biosynthse
protique.

LES PETITS ARN NUCLEAIRES.


Les petits ARN nuclaires (ou snRNA) sont
prsents dans le noyau des cellules et sont
impliqus dans certaines tapes de la rgulation
post transcriptionnelle (pissage alternatif).

II. Relation entre les structures des acides nucliques


et leurs fonctions lord de lexpression gntique
Les diffrentes structures des acides nucliques & des protines
associes la chromatine ont une grande influence sur la rgulation
de lexpression gntique.
En effet: La structure de la double hlice dADN, sa forme A, B ou Z,
sa charge ngative et son degr de superenroulement jouent un rle
Dterminant dans laccessibilit des gnes au facteurs dinitiation,
Dactivation ou dinhibition de la transcription.
Donc la structure de lADN est dj en soi un facteur rgulateur
de lexpression gntique.
Les interactions ADNADN , ADNARN, ADNProtines &
Protines----Protines sont galement des lments clef de
La rgulation de lexpression des gnes.

INFORMATION GENETIQUE
Expression Gntique :
Transcription &Traduction
Rplication & Cycle Cellulaire

Expression Gntique
Dfinitions :
La double hlice

Lacide dsoxyribonuclique (ADN ou DNA), constitu de deux


chanes de nuclotides monophosphates, lis chacun par une
liaison ester entre son carbone 3 et le carbone 5 du nuclotide
suivant.
Ces deux chanes de nuclotides sont unies entre elles par des
liaisons hydrognes pour former un hybride en forme de double
hlice dont les deux brins sont : antiparallles & complmentaires.
Chaque adnine (A) dun des deux brins est lie par deux liaisons
hydrogne avec une thymine (T) de lautre brin, et chaque guanine
(G) dun brin est lie par trois liaisons hydrogne avec une cytosine
(C) de lautre brin.
De sorte que si on dsigne les nuclotides par les lettres A, C, G et
T en fonction des bases azotes quils contiennent, on peut lire sur
cette figure le texte suivant :
AGAGTCGTCTCGAGTCA...
...TCTCAGCAGAGCTCAGT

crire la suite les lettres A, C, G et T dans lordre o on rencontre les


nuclotides sur lun des brins de lADN de lextrmit 5 lextrmit 3
aboutit un texte.
Le texte ainsi transcrit contient toute linformation ncessaire pour la
synthse dune protine). Cest pourquoi on appelle ce brin dADN le brin
sens . Lautre brin est le brin complmentaire ou brin antisens .
Lensemble de linformation gntique transmise par chacun des parents
un enfant (gnome haplode) est contenue ainsi en 3 x 10 9 nuclotides.
Ces 3 x 109 nuclotides dinformation gntique constituent
des gnes = squences codantes = exons = cadres ouvert de lecture (Open
Reading Frames = ORF).
Ces gnes sont copis dans le noyau en
Transcription.

tRNA ou rRNA ou mRNA =

Seuls les mRNA sont traduit dans le cytoplasme en protines = Traduction.

Gne

Pour permettre la biosynthse dune protine, il doit y avoir dans la


structure de lADN, une squence de nuclotides qui constitue le
gne de cette protine.
Il existe des squences rgulatrices = lments rgulateurs ou
promoteur:
gnralement proximal en amont du gne
Le promoteur peut tre en aval ou distal du gne et ne devient
proximal que lors de la transcription et ceci via des remaniements
structuraux de la chromatine).
Le promoteur est une squence non-transcrite et non-traduite.
Une rgion gnique ou locus peut contenir une suite variable
dexons (ORFs transcrites et traduites) et dintrons ( sequences
non-codantes)
Lensemble des mcanismes qui partir de la squence du gne
(ADN) conduisent la production dun acide ribonuclique (ARN) est
dsign sous le terme de Transcription
ARNm
proteine == traduction
Transcription & traduction == expression gntique.

Brin sens & Brin antisens


Tout le DNA nest pas transcrit seuls les gnes = exons = ORFs
Sont transcrits.
En plus mme si lADN est double brin seul un brin est transcrit ou
copi en mRNA.
Le mRNA est complmentaire & antiparallle au brin dADN transcrit
(nomm: Brin antisens)
Le mRNA est identique lautre brin non transcrit
(nomm: Brin sens).

5.AGCTTAACGCGTA. 3
3.TCGAATTGCGCAT. 5

Brin DNA sens=


non transcrit=informatif.
Brin de DNA

Transcription
5.AGCUUAACGCGUA. 3

antisens=transcrit.
mRNA

1.A. La transcription

Les nuclotides qui prcdent lexon contiennent de nombreuses


squences reconnues par des protines nuclaires qui permettent
le dbut (initiation) & la rgulation de la transcription. Cest le
promoteur
On distingue en particulier :
vers -20 -30 (20 30 nuclotides en amont de lexon 1 en
direction de lextrmit 5 du brin sens) une squence TATATA
appele bote TATA , qui est spcifiquement reconnue par la
protine TFIID, cofacteur de la RNA-polymrase II ;
vers -80 une squence GGCCCATCCAT la fois bote CAT ou
CAAT et bote GC , sur laquelle viennent se fixer dautres
protines de la transcription (CTF et Sp-1) ;
de nombreuses autres squences sont des sites de fixation des
protines rgulatrices de la transcription. Par exemple, une
squence TRE (TGACTCA) au dbut de la troisime ligne de la
sequence, sur laquelle vont se fixer des protines de la famille AP-1
pour activer la transcription.

Cis- et trans-rgulateurs

Les squences de nuclotides du promoteur=(facteurs cisrgulateurs), sont reconnues par une classe de protines
spcifiques=(facteurs trans-rgulateurs) dont la structure permet
une liaison avec lADN (DNA binding proteins).
La structure secondaire et tertiaire des DNA binding proteins
comprend
des
domaines
spcifiques
permettant
la
reconnaissance des squences rgulatrices du gne : - domaines
en doigts de zinc/ structures riches en leucine en forme de
fermeture Eclair (Leu zipper)/ homodomaines, bHLH = rgion
basique, hlice a, boucle, hlice a/ - domaines riches en
glutamine/ domaines riches en proline/ - hlices a acides (Asp,
Glu).
Les squences qui reconnaissent les DNA binding proteins
(facteurs cis-rgulateurs=promoteur) ont des effets sur la vitesse
de la transcription: activateurs = (squences enhancer) ou
inhibiteurs = (s-quences silencer). Leur liaison avec les protines
dpend le plus souvent de circonstances physiologiques qui
induisent ou rpriment lexpression du gne.

Initiation de la transcription
La RNA polymrase II est lenzyme de la transcription des gnes
exprims sous forme de protines.
Elle est prsente dans tous les noyaux cellulaires. Sa masse
molculaire est de 500 kilo daltons pour 10 sous-units.
La transcription quelle catalyse ncessite des ribonuclosides
triphosphates comme substrats (ATP, CTP, GTP et UTP), plusieurs
cofacteurs protiniques (transcription factors)
Lnergie de la raction est fournie par lhydrolyse des liaisons
riches en nergie des nuclosides triphosphates (42 kJ/mol).

Initiation de la transcription
Linitiation de la transcription sur un promoteur humain implique
plusieurs facteurs de transcription, connus sous les noms de TFIIA,
TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH et TFIIJ en plus de la RNA
polymrase II elle-mme.
Au centre de ce mcanisme initial, il y a lassociation de TBP, la
sous-unit reconnaissant lADN du facteur TFIID, avec la bote TATA
du promoteur. Ladjonction successive de TFIIB et de RAP30, petite
sous-unit de TFIIF , sont ensuite ncessaires pour la fixation de la
polymrase et dterminent la fois le brin transcrit et le sens de la
transcription. A ce complexe ADN-TFIID-TFIIB-RAP30-polymrase II,
sajoutent encore successivement la grande sous-unit de TFIIF
(RAP74), TFIIE et TFIIH.
Alors la transcription peut commencer si les ribonuclotides
substrats sont prsents.

Le complexe dinitiation de la transcription recouvre une


squence denviron 100 nuclotides (100pb avant Nt: +1)
du brin antisens de lADN, en provoquant louverture et le
droulement partiel de la double hlice cet endroit.
La transcription commence environ 22 nuclotides de
la bote TATA en direction oppose celle des lments
GC-CAAT et se poursuit en remontant le brin antisens
=(transcrit), en direction de son extrmit 5.
La formation de ce complexe est active ou inhibe par
les facteurs trans-rgulateurs lis aux squences cisrgulatrices du mme promoteur.

Elongation de la transcription

Chaque nucloside triphosphate est choisi spcifiquement


pour tre complmentaire de la base du brin antisens qui va
lui faire face. La liaison riche en nergie entre le premier
phosphate estrifiant le carbone 5 du ribose et les deux
autres
phosphates
est
hydrolyse,
librant
un
pyrophosphate qui sera hydrolys ensuite par une
pyrophosphatase.
Le phosphate restant est li par une liaison ester au carbone
3 OH libre du dernier nuclotide du transcrit en cours de
synthse.
La RNA polymrase construit un ARN hybrid avec le
brin antisens de lADN, dont la squence primaire est la
copie du brin sens mais compose de ribonuclotides au lieu
des dsoxyribonuclotides et duracile la place des
thymines.

Exon

Les exons sont des fragments de squence primaire


dun gne qui seront recopis dans la structure
primaire de lARN messager, aprs lpissage.
Un exon code le plus souvent pour un domaine
fonctionnel de la protine ou une partie dun tel
domaine.
Au cours de lvolution le gne peut tre modifi par
la substitution, linsertion ou la dltion dun exon
entier (conversion de gnes) ce qui modifie, apporte ou
retire la protine un domaine fonctionnel en entier.

Exon 1

Aprs la fixation de la RNA-polymrase sur la bote TATA par


lintermdiaire du facteur TFIID, la transcription va commencer 23
nuclotides au del de cette bote.
A ce point, la squence du brin sens est 5AGGCACAGA...3, celle
du brin antisens est donc 3TCCGTGTCT...5 (complmentaire et
antiparallle).
En choisissant comme substrats les ribonuclotides
complmentaires de ce brin antisens, la RNA-polymrase va
composer 5AGGCACAGA...3 qui sera le dbut de la squence de
lARN transcrit. Lorsque la polymrase rencontre un A sur le brin
antisens, elle incorpore un nuclotide Uracile dans le mRNA :
5 UGGCUCUGU...3.
La squence de lARN transcrit recopie donc celle du brin sens de
lADN.
La transcription se poursuit alors tout au long du brin antisens en
incorporant les nuclotides dans lARN transcrit.

Fin de la transcription

Vers la fin du gne la RNA-polymrase rencontre une


squence 3-TTATTT-5 quelle reconnat comme un
signal de fin dactivit. La transcription sarrte en effet
peu aprs ce signal qui est transcrit en AAUAAA.
La RNA-polymrase quitte lADN et libre le transcrit
dARN qui contient linformation gntique recopie
pour permettre lexpression du gne sous forme de
protine.

Modifications du transcrit

Chapeau = Capping: une enzyme ajoute un nuclotide Guanine


sur les phosphates du Carbone 5 du premier nuclotide du transcrit
et transfre des radicaux mthyles sur les premiers nuclotides. Ces
modifications font un dbut commun tous les transcrits primaires,
prcurseurs des RNA messagers.
Queue poly-A : une enzyme coupe le transcrit environ 10 20
nuclotides au del de la squence AAUAAA et synthtise sur le
Carbone 3 libre du dernier nuclotide du transcrit restant une longue
chane de 500 2000 nuclotides Adnine polymriss.
dition : Des enzymes peuvent diter (au sens anglais du terme)
la structure primaire du transcrit en modifiant certaines bases
(exemple : C en U par une cytosine dsaminase spcifique
Excision - pissage : les parties non codantes de la structure
primaire du transcrit sont coupes et les parties codantes r
assembles

Les ARN messagers sont dtruits par des ribonuclases dans le


cytoplasme. Leur hydrolyse libre des nuclotides qui seront
remploys la synthse de nouveaux acides nucliques.
Pour protger les ARN messagers de ce catabolisme, une
structure particulire dissimule lextrmit 5 terminale de ces
ARN aux exonuclases spcifiques de cette partie de lARN.
Cette structure est appele chapeau du messager (cap).
Au minimum, il y a fixation dun GMP sur le deuxime phosphate
du nucloside triphosphate qui se trouve lextrmit 5 du
transcrit. Ce GMP est mthyl sur son azote n7.
Si le nuclotide initial comprend une adnine celle-ci peut tre
mthyle sur lazote n6. Les riboses des nuclotides initiaux
sont quelquefois mthyls sur loxygne de la fonction alcool en
2.

Le transcrit primaire contient des nuclotides.


Il a reu un chapeau (cap), GMP mthyl qui se fixe sur
le phosphate b de lATP en 5 du transcrit primaire.
Il reoit une queue poly-A synthtise en 3 aprs la fin
du transcrit.
les introns exciss seront reconnus par :
un site donneur GU en 5 de chaque intron,
un site receveur AG en 3 de chaque intron.
Aprs cette maturation le transcrit primaire devenu ARN
messager sera transport vers le cytoplasme pour la
traduction.

Excision - pissage

Les introns, parties non codantes des gnes des eucaryotes,


sont coups (excision) de la structure primaire des ARN au
cours de la maturation des messagers.
Les exons, parties codantes, sont ensuite lis entre eux bout
bout (pissage), pour tablir la squence primaire de lARN
messager.
Lexcision et lpissage reprsentent donc laction
denzymes et de ribozymes qui catalysent la coupure de lARN
(endoribonuclase) et la fermeture de la brche (ARN ligase).
Lpissage peut tre alternatif, cest dire peut conduire
plusieurs structures dARNm : les ARNm alternatifs ont
chacun en propre certains exons ainsi que des exons en
commun.

Formation du lasso

Lexcision des introns et lpissage des exons est ltape la plus importante
de la maturation du transcrit dans le noyau cellulaire.
Elle fait appel des facteurs spcifiques : ribonucloprotines contenant
des petits ARN (snR-NP), ribozymes (ARN ayant des proprits catalytiques),
protines codes par les introns eux-mmes (maturases)...
La structure secondaire du transcrit met en contact trois squences de
lintron : la squence du dbut de lintron (extrmit 5 ou site donneur), la
squence de la fin de lintron (extrmit 3 ou site accepteur) et une squence
riche en pyrimidines (C ou U) contenant un nuclotide adnine (A du
branchement).
Le site donneur commence habituellement par un nuclotide guanine
dont le phosphate est dtach de lexon prcdent pour tre transfr sur le
carbone 2 de lA du branchement. Le dernier nuclotide du site accepteur,
aussi une guanine, est dtach de lexon suivant, dont le premier nuclotide
est li par son phosphate 5 au carbone 3 du dernier nuclotide de lexon
prcdent.
Lintron, libr sous forme de lasso, est dtruit par des nuclases. Le
transcrit perd successivement tous ses introns et les exons pisss
constituent la squence codante du messager.

RNA Messager

LARN messager comprend plusieurs squences :


une squence 5 non-codante, qui ne sera pas traduite, qui correspond
lexon 1 et une partie de lexon 2 dans le gne de lapoA-II ;
un codon AUG qui fixe le tARN de la mthionine initiale ;
des squences de codons pour incorporer les acides amins du
signal-peptide et du propeptide;
la squence des codons dont les acides amins formeront la squence
primaire de la protine ;
le codon de terminaison (ici, UGA) ;
une squence 3 non-traduite qui sachve par la queue poly-A.
Sur la squence 5 non-traduite, va se construire le complexe dinitiation
de la traduction o les ribosomes vont sassembler successivement pour
commencer la traduction.

La traduction

Lors de la traduction:
la structure transcrite sur lARNm, sexprime par la
synthse de protines dont la squence traduit en
acides amins linformation porte par la structure
primaire de lADN.
La traduction est faite dans le cytoplasme des
cellules :
soit pour librer des protines cytoplasmiques,
soit pour conduire ces protines dans les membranes
ou les organites de la cellule (reticulum
endoplasmique, appareil de Golgi, membrane
plasmique, lysosomes, mitochondries, noyau, etc...),
soit pour excrter ces protines travers les
membranes vers lextrieur de la cellule.

Codon

La liaison de lARN de transfert (ARNt) avec lARN messager


(ARNm) porteur de linformation, se fait par complmentarit entre
3 nuclotides de chacun de ces deux ARN.
Les 3 nuclotides de lARNm constituent un codon et les 3
nuclotides de lARNt un anticodon.
Au cours de la traduction lanticodon et le codon se lient de
manire antiparallle, et lacide amin port par lARNt est
incorpor la protine en cours de synthse.
La squence primaire de lARNm est donc traduite par groupes
de 3 nuclotides (codons). Un nuclotide de lARNm au cours de la
traduction peut se trouver en position 1, 2 ou 3 dans un codon si le
nombre de nuclotides qui le sparent du codon dinitiation AUG
est ou nest pas un multiple de 3. Cette position porte le nom de
cadre de lecture.

Code gntique

La squence codante est une suite de codons dont


chacun permet dincorporer spcifiquement un acide
amin dans la synthse dune protine.
Le code gntique est le mme pour tous les tres
vivants de la biosphre (universel). Il existe quelques
variations (codons propres la biosynthse des protines
dans les mitochondries).
Le code gntique comporte 61 codons pour signifier les
20 acides amins qui participent la synthse des
protines :
chaque acide amin peut tre cod par plusieurs codons
(de un six) qui diffrent en gnral par leur troisime
nuclotide. On dit que le code est dgnr.

Ribosome eucaryote

Les

acides ribonucliques ribosomiaux et les


protines ont des sites de fixation pour la squence
du messager,
Les ARN de transfert portent lacide amin
incorporer (site A) et le peptide en cours de synthse
(site P), un site catalytique pour former les liaisons
peptidiques, des sites de fixation pour les cofacteurs
protiques de linitiation (eIF2, eIF3), de llongation et
de la terminaison et des sites de rgulation (protine
S6).

Polyribosomes

Linitiation est un phnomne permanent lextrmit 5


dun ARN messager et les ribosomes se succdent sur
le mme messager raison dun tous les 100
nuclotides environ, formant un polyribosome.
Les polyribosomes prsentent un aspect diffrent
selon la rgulation des diffrentes tapes de la
traduction. Plus linitiation est active plus les ribosomes
sont nombreux sur le messager. Si llongation est
lente, les ribosomes vont mettre plus de temps lire la
squence codante. Une activation de la terminaison
dissocie tous les ribosomes du messager.
De nombreux antibiotiques sont capables dinterfrer
avec chacune des tapes de la synthse des protines
(streptomycine, cycloheximide, puromycine).

ARN de transfert

Les ARN de transfert constituent le lien chimique ncessaire


entre la structure du codon, reconnu par lanticodon, et lacide
amin spcifique port par lARNt. Cest en quelque sorte le
dictionnaire de la traduction.
Lanticodon est une squence de trois nuclotides situe
lextrmit de la boucle infrieure de lARNt, complmentaire et
antiparallle de la squence du codon de lacide amin correspondant.
Chaque acide amin est li spcifiquement (code gntique)
par une aminoacyl-tRNA-synthtase lextrmit 3 de lARNt
dont lanticodon lui correspond (ARNt charg).
Les ribosomes lient les ARNt chargs sur le site A de
llongation si leur anticodon sapparie avec le codon du
messager cet endroit. Llongation transfre alors le peptide
sur lacide amin nouveau, lui-mme port par lARN de transfert.

Srine tRNA synthtase

Cystine tRNA synthtase

Les aminoacide-tRNA-synthtases sont les enzymes qui


chargent les acides amins libres du cytoplasme sur les ARN de
transfert correspondants. Le coenzyme ATP est hydrolys en AMP
et en pyrophosphate pour fournir lnergie ncessaire. La liaison
ester constitue entre lacide amin et son ARNt est riche en
nergie et sera hydrolyse au cours de ltape dlongation de la
traduction.
Les aminoacide-tRNA-synthtases ont une double spcificit trs
troite pour les deux substrats : lacide amin reconnu (ici, la
cystine) et les ARNt dont les anticodons sont complmentaires
des codons correspondant cet acide amin dans le code
gntique. Lexactitude de la traduction repose entirement sur
cette double spcificit.
La reconnaissance de lARNt se fait par lanticodon dans certains
cas (lenzyme ne tenant pas toujours compte de la premire base
de lanticodon, ce qui explique la dgnrescence du code
gntique) ou bien encore par dautres squences de lARNt
communes aux ARNt synonymes. Certaines aminoacide-tRNAsynthtases sont rgules par phosphorylation.

Initiation de la traduction

Linitiation de la traduction est ltape limitante de la


traduction.
Les sous-units des ribosomes sont dissocies dans le
cytoplasme. Une cascade dvnements vont former un
complexe dinitiation.
Le facteur eIF2 (eucaryotic initiation factor 2) est porteur
dun GDP, coenzyme quil vient dhydrolyser ltape
prcdente. En prsence du facteur eIF2B, un nouveau
GTP est substitu ce GDP. Le facteur eIF2 ainsi activ,
peut alors lier lARNt charg dune mthionine dont
lanticodon est complmentaire du codon dinitiation (AUG)
du messager.
En prsence du cofacteur eIF4C, la petite sous-unit va
fixer le facteur eIF3 et le facteur eIF2 activ qui porte lARNt
charg de la mthionine initiale. Lnergie de la formation
de ce complexe a t fournie par lhydrolyse de la liaison
riche en nergie du GTP port par le facteur eIF2.

La squence 5 non traduite de lARN messager est


reconnue par les cofacteurs eIF4A, eIF4B et eIF4F qui sy
fixent. Grce lhydrolyse dun ATP pour fournir
lnergie, le messager est alors transfr sur la petite
sous-unit, en regard du site P, de faon hybrider les
nuclotides du codon dinitiation avec ceux de
lanticodon de lARNt de la mthionine initiale.
En prsence du dernier cofacteur eIF5, le complexe va
se lier une grande sous-unit pour constituer un
ribosome fonctionnel. Les cofacteurs dinitiation sont
librs et la traduction commence.
Le cofacteur eIF2 toujours porteur de son GDP, se libre
pour recommencer un nouveau complexe.

Cadre de lecture

Le positionnement du messager par rapport lARN de


transfert de la Mthionine initiale dtermine le cadre de
lecture de la traduction du messager.
LARN de transfert de la mthionine occupe un des
deux sites de fixation des tRNA sur le ribosome : site P
(ou peptidique, car il contiendra le peptide en cours de
synthse). Le codon AUG du messager, en shybridant
dans le site P avec lanticodon CAU de lARN de transfert
de la mthionine, place le messager de telle sorte que le
codon suivant (N1N2N3) apparaisse dans lautre site de
fixation : site A (ou acide amin, car il servira la fixation
des nouveaux acides amins incorpors).
Le nuclotide N1 sera toujours le premier de chaque
codon.

Facteurs dinitiation

La formation du complexe dinitiation fait appel a de nombreux


facteurs qui participent la structure, lactivation ou la
rgulation de ce complexe.
Parmi ces facteurs on reconnat les deux sous-units des
ribosomes (Unit L ou 60S et unit S ou 40S), le Met-tARN initiateur,
lARN messager et les coenzymes donneurs dnergie ATP et GTP.
Les cofacteurs protiniques de cette tape sont classifis sur ce
Tableau. Certains participent lactivation du Met-tARN initiateur
ou sa liaison avec la sous-unit S, dautres la reconnaissance
de lextrmit 5 de lARN messager ou sa liaison avec le
complexe dinitiation, dautres enfin la liaison finale avec la sousunit L.
Certains de ces facteurs protiniques et une au moins des
chanes protiniques de la petite sous-unit sont rgules par
phosphorylation ou dphosphorylation sur des Ser ou des Thr.

Elongation

Incorporation dun acide amin

Un ARNt charg vient se fixer sur le site A libre. Le codon du messager au fond
du site A va se lier complmentairement avec lanticodon de lARNt du nouvel
acide amin ce qui va permettre lincorporation de cet acide amin dans le
peptide en cours de synthse.

Transfert du peptide

Le ribosome catalyse alors le transfert du peptide situ sur lARNt du site P sur
la fonction amine de lacide amin de lARNt du site A. Il utilise pour cela,
lnergie de lhydrolyse de la liaison ester riche en nergie entre le peptide et
lARNt du site P.

Translocation des codons


LARNt libre du site peptidique quitte le ribosome.
Le messager, lARNt restant et le peptide en cours de synthse sont alors
dplacs (translocation) du site A vers le site P, sans quil y ait fusion de
lhybride entre le codon et lanticodon

Terminaison de la traduction
Lorsque le site A se trouve en regard dun codon nonsens annonant la fin de la traduction, le complexe va
se dissocier du messager en prsence dun dernier
cofacteur eRF.
Les deux sous-units du ribosome se dissocient, la
protine synthtise est libre, ainsi que le dernier
ARNt.

Facteurs dlongation ou de terminaison


Llongation ou la terminaison de la protine naissante font
appel a de nombreux facteurs qui participent aux tapes
successives de la traduction.
Parmi ces facteurs on reconnat les ribosomes, les aminoacyltARN activs, lARN messager et le coenzyme donneur dnergie
GTP.
Les cofacteurs protiniques de ces tapes sont classifis sur
Tableau. Certains participent lactivation des aminoacyl-tARN
ou leur liaison au site A du ribosome, dautres la translocation du tARN porteur du peptide naissant du site A vers le
site P. Le dernier facteur en-gendre la dissociation du ribosome
et la libration de la protine synthtise.

Signal-peptide
Lorsquune protine est synthtise, sa structure secondaire ou
tertiaire se construit au fur et mesure de la traduction et elle est libre
dans le cytoplasme.
Lorsque cette protine est destine tre incorpore dans les
membranes ou les organites de la cellule, la partie codante de lARN
messager commence par une squence de quelques acides amins qui
sert dadresse pour lincorporation de cette protine dans la membrane.
Ces peptides orientent la destine de la protine : incorporation dans
les membranes (reticulum endoplasmique, appareil de Golgi, membrane
plasmique, lysosomes...), entre dans les mitochondries, excrtion hors
de la cellule via lappareil de Golgi, etc...
Le signal-peptide est un peptide dadressage situ lextrmit NH 2
-terminale des protines excrter. Parce que sa fonction est de pntrer
dans la membrane du reticulum endoplasmique, sa structure est riche en
acides amins hydrophobes (Phe, Leu, Ile, Met, Val).

Polyribosomes lis
Les polyribosomes qui se forment sur un messager comportant
un signal peptide ont une volution lgrement diffrente. La
traduction sarrte peu aprs la synthse du signal-peptide, ds
que celui-ci apparat hors de la structure du ribosome et se lie avec
la SRP (SRP = Signal Recognition Particle), qui inhibe llongation.
Pour que llongation puisse se poursuivre, il faut que la SRP soit
reconnue spcifiquement par un rcepteur de la membrane du
reticulum endoplasmique. Ds que cette liaison est tablie, le
ribosome est li par la ribophorine, toujours dans la membrane du
reticulum, prs dune protine qui ouvre un pore travers cette
membrane. Le SRP cart, llongation va reprendre.

Le peptide en cours de synthse est alors dirig


travers cette membrane pour se dvelopper dans la
lumire du reticulum endoplasmique.
A la face interne de la membrane une
endopeptidase spcifique va couper le signal
peptide et la synthse se poursuivra jusqu la
terminaison. La protine sera enfin incorpore dans
une membrane ou exporte, travers lappareil de
Golgi, vers lextrieur de la cellule.
Ladressage des protines vers les mitochondries
fait appel un autre type de peptide dadressage qui
conduit les peptides traverser la membrane
mitochondriale.

modifications chimiques se produisent aprs lincorporation


des acides amins dans la structure primaire de la protine
(traduction); on les appelle:
modifications post-traductionnelles.
On distingue des modifications cotraductionnelles qui se
produisent alors que la traduction se poursuit encore et que le
peptide naissant est encore attach au ribosome qui la
construit, des modifications post-traductionnelles proprement
dites qui ont lieu dans la cellule, dans les organites ou hors de
la cellule.
On appelle protine mature la forme chimique dfinitive que
la protine montrera au moment o elle remplira sa fonction
dans lorganisme.

Addition de sucres: Glycosylation

La rplication
Au cours de la vie de la cellule (cycle cellulaire, dune
division mitotique la suivante), lADN doit tre ddoubl
pour que chaque cellule fille reoive un gnome complet
dans son noyau.
Cette synthse se produit la phase S (au milieu du cycle
cellulaire) grce lactivit de la DNA-polymrase a.
Dautres DNA-polymrases participent la rparation de
lADN ls ou la rplication de lADN mitochondrial.

Le cycle cellulaire
La vie de la cellule se droule entre deux mitoses. Chez les Mammifres,
cette priode dure en moyenne 30 heures bien quil y ait des cellules dont la
vie soit trs courte ou au contraire trs longue.
Durant ces trente heures la cellule traverse quatre phases :
la phase G1 o le gnome tant diplode, chaque gne est reprsent en
deux exemplaires. La chromatine est accessible aux RNA-polymrases qui
transcrivent les gnes en messagers, qui seront leur tour traduits. Phase de
prparation la synthse dADN.
vers la moiti du cycle commence la rplication de lADN : les DNApolymrases vont mettre environ 8 heures (phase S) pour recopier en double
lADN de chaque chromosome. Durant cette phase la transcription est
inhibe. Phase de synthse dADN.
puis la cellule entre en phase G2 o chaque gne est reprsent en quatre
exemplaires. La chromatine est nouveau accessible aux RNA-polymrases
qui recommencent transcrire. Phase de rparation des mutations.
enfin survient la mitose, qui donne naissance deux cellules filles.
Chacune recevra une des copies identiques de lADN de chaque
chromosome et chaque gne y sera reprsent en deux exemplaires.

DNA polymrase
Les DNA-polymrases sont des enzymes du noyau
cellulaire qui agissent en phase S du cycle pour doubler
systmatiquement lensemble du gnome diplode.
Elles utilisent des dsoxyribonuclotides triphosphates
(dATP, dCTP, dGTP et dTTP) et des amorces de RNA
synthtises par une DNA primase (RNA polymrase
capable de synthtiser un court brin de RNA
complmentaire dun brin de DNA).
Elles synthtisent lADN nouveau par fragments qui sont
lis entre eux par une DNA-ligase.
Elles ont aussi une activit exonuclasique, qui leur permet
en particulier dhydrolyser lARN des amorces.

Rplication
Les DNA-polymrases commencent leur synthse en de nombreux
points dinitiation de la rplication. La synthse de DNA commence sur
des amorces de RNA constitues par la DNA-primase.
La rplication se poursuit dans une direction : dans ce sens lun des
deux brins de lADN (brin avanc ) est parcouru par lenzyme dans
le sens 3 -- 5 ce qui permet la synthse dun autre brin dans le sens
5-- 3. Les DNA-ligases assurent ensuite la liaison entre les diffrents
fragments de lADN nouveau.
La synthse de lautre brin (brin retard ) est plus complexe parce
que lenzyme parcourt ce brin de 5 -- 3. La DNA primase synthtise
des amorces de quelques nuclotides en avant de la zone de rplication,
et la DNA polymrase construit la suite de petits fragments dADN
dans le sens 5---3. La DNA polymrase hydrolyse en avanant lamorce
de RNA du fragment prcdent (activit exonuclasique).
Les petits fragments seront ensuite relis entre eux par la DNA-ligase.

LA RPLICATION DE LADN CHEZ LES PROCARYOTES


Caractristiques gnrales.
rplication dite semi-conservatrice. Ceci signifie que sur les deux brins
dADN, on a toujours un brin dADN qui provient dun des deux brins de
lADN parental et un brin nouvellement form. A chaque rplication, les deux
brins dADN parental se sparent, chacun de ces deux brins sert de matrice
pour la synthse dun brin complmentaire.
Les lments ncessaires la rplication de lADN.
La rplication de lADN ncessite:
- Tout dabord, une matrice dADN constitue par un brin parental.
- La prsence de nuclotides propres lADN, cest--dire contenant du 2dsoxyribose, des bases A, T, G et C et sous forme de nuclosides triphosphates:
dATP, dTTP, dCTP et dGTP (on crit souvent pour les dnommer dNTP).
- La prsence de nombreux enzymes ( P dna A, Pdna B= hlicase, P SSB
=stabilisateur de sb, Primases, polymrases, exonuclases, ligases & P
Tus=terminaison ).
- La prsence de certains ions (cations bivalents: Mg 2+ , ce cation est
indispensable pour la rplication de lADN).

Les mcanismes de linitiation de la rplication


Lunit dADN o se produit la rplication est appele le rplicon. Il
a une origine o est initie la rplication et une terminaison o est
arrte la rplication.
LADN bactrien constitue lui seul un rplicon. A partir dun
point dinitiation, la rplication peut progresser soit de manire
unidirectionnelle, soit de manire bidirectionnelle.
Chez les procaryotes, partir dune origine de la rplication (ou
oeil de rplication), la rplication progresse dans les deux sens:
bidirectionnel
Chez E. coli, lADN bicatnaire a une origine unique de la
rplication appele OriC. Le locus OriC est une squence de 250 pb:
tandem de trois squences presque identiques de 13 nuclotides
(squences de type GATCTNTTNTTTT).

Au locus OriC, quatre sites de liaison comportant un motif de paires de


bases lient Des copies multiples dune protine appele dnaA ou
protine dinitiation de la rplication, code par le gne dnaA.
Ces liaisons ncessitent de lATPet sont indispensable la
transformation localise de lADN double brin en ADN simple brin.
Ces complexes vont ensuite fixer 2 ADN hlicases, ou protine dnaB,
une hlicase pour chacun des brins dADN code par le gne dnaB.
Lhlicase droule lADN (en prsence dATP et dune autre protine
appele dnaC) et dfinit la fourche de rplication.

Les brins spars de lADN sont stabiliss sous forme simple


brin grce la fixation de protines appeles SSB (pour
single strand binding ). Ces protines SSB empchent les
deux brins dADN de se rapparier.
le complexe primosome entre lhlicase et une enzyme
primase (ou protine dnaG) permet la Synthse des amorce
dARN (9-12 nuclotides).
LADN polymrase III sinsre au niveau de la fourche de
rplication et utilise lamorce dARN pour la synthse de
lADN.
LADN polymrase III possde deux sites actifs capables de
synthtiser les nouveaux brins dADN au niveau de la
fourche de rplication.

La rplication nest pas identique entre les deux brins dADN.


Pour lun des brins: la rplication seffectue de manire
continue, brin avanc, sens 5 3
Pour lautre brin elle est discontinue, brin retard, orient de
manire anti-parallle 3 5 synthse discontinue des
fragments dOKAZAKI.
le brin matrice du brin retard forme une boucle autour dun
des deux sites actifs de lADN polymrase III.
intervention de la primase et de lADN polymrase III pour la
synthse du brin retard dADN dans le sens 53
Aprs synthse la boucle est dfaite et une nouvelle est
reforme au niveau de louverture de la fourche de rplication.

LADN polymrase III utilise lADN comme matrice (sens 53), lARN comme
amorce & comporte 7 sous-units catalytiques. les amorce dARN sont
synthtises par une ARN polymrase ou primase. lADN polymrase III allonge
cette amorce dARN
Lhydrolyse et le remplacement des amorces dARN,
intervention de la RNAse H, lADN polymrase I et une DNA-ligase.
Les ADN polymrases I et III impliques dans la rplication de lADN
prsentent plusieurs fonctions enzymatiques:
une fonction polymrasique: ajoute un nuclotide lextrmit 3 OH dun acide
nuclique, une fonction exonuclasique 53 (activit de rparation de lADN) &
une fonction exonuclasique 35 (lenzyme vrifie le dernier nuclotide mis en
place).
Terminaison de la rplication.
IL existe au moins 6 sites de terminaison ou sites (ter) de terminaison dans le
gnome bactrien. Une protine spcifique appele Tus peut se lier aux sites de
terminaison.
Cette liaison arrte la protine dnaB (hlicase).

LA RPLICATION DE LADN CHEZ LES EUCARYOTES


Caractristiques gnrales.
La rplication de lADN chez les eucaryotes est tout fait
comparable la rplication de lADN chez les procaryotes.
Elle est gnralement bidirectionnelle, elle est discontinue entre les
deux brins dADN. Des amorces dARN sont ncessaires. Cette
rplication est galement complmentaire, antiparallle et dans le
sens 5 3.
Caractristiques particulires.
La rplication se fait en de nombreux points dinitiation. Elle fait
intervenir un nombre dADN polymrases plus important que chez
les procaryotes. De nombreuses protines interviennent comme
facteurs de rplication.
Les changements subis par les nuclosomes au cours de la
rplication de lADN eucaryote & la rplication de lADN des
extrmits chromosomiques (ou tlomres) ont un rle primordial
dans la rgulation du cycle & de la division cellulaire.

Mutations gntiques & systmes de rparations


LES TYPES DE MUTATION DE LADN.
Les mutations sont dfinies comme un changement
transmissible dans le matriel gntique.
Ces mutations peuvent concerner les cellules germinales
ou les cellules somatiques.
Elles peuvent tre spontanes ou conscutives des
altrations des bases puriques ou pyrimidiques.
Elles peuvent tre provoques par des dysfonctionnements
au cours de la rplication ou de la rparation de lADN.
On peut classer les mutations selon ltendue de la lsion
de lADN: les macrolsions et les microlsions.

Les macrolsions de lADN.


Dans ce groupe, on peut ranger:
- Les dltions (amputations de matriel gntique
damplitude variable).
- Les duplications.
- Les amplifications (multiplication de squences.
- Les fusions de gnes.
- Les inversions (changement dorientation tte-bche dun
segment variable dADN).
- Les insertions de squences dADN.

Les microlsions.
Dans ce cadre, on range les mutations ponctuelles de
lADN.
dltion, insertion ou substitution, dun nuclotide par
un autre.
La substitution dune paire de bases par une autre peut
sagir
dune transition ou dune transversion;
La transition: correspond au remplacement dune base
purique par une autre base purique ou
une base pyrimidique par une autre base
pyrimidique.
La transversion: correspond au remplacement dune
base purique est par une pyrimidine ou
dune pyrimidine par une purine.

substitution non-synonyme:

incorporation dun acide amin diffrent dans la protine


substitution synonyme
incorporation du mme acide amin dans la protine
Les substitutions synonymes rsultent de la dgnrescence du
code gntique.
Lorsquune substitution non-synonyme se produit dans le DNA
(gnotype) aboutit lincorporation dun acide amin
fonctionnellement diffrent dans la structure primaire dune
protine,
il en rsulte lapparition dun caractre diffrent (mutation) dans
le phnotype de lindividu.
Toute autre modification entranant une protine traduite plus
longue ou plus courte, ou encore un dcalage de la lecture
des codons, se traduit par une squence primaire diffrente et
donc la plupart du temps une mutation dans le phnotype de
lindividu.

Dltion
dltion, cest dire suppression dun ou de plusieurs nuclotides
Les dltions sont dimportance variable selon le nombre de
nuclotides suprims:
de 1 ou 2 nuclotides, elles dcalent le cadre de lecture
(codons)
de 3 nuclotides, elles aboutissent la suppression dun
acide amin dans la protine ex-prime
de grande longueur, elles peuvent supprimer lexpression
dun ou de plusieurs exons, voire dun gne entier.

Insertion:
Insertion, cest dire addition dun ou de
plusieurs nuclotides.
Les insertions sont dimportance variable selon
leur longueur :
de 1 ou 2 nuclotides, elles dcalent le cadre
de lecture (codons)
de 3 nuclotides, elles aboutissent
laddition dun acide amin dans la protine
exprime
de grande longueur, elles peuvent modifier
compltement la traduction des exons
dans les introns ou dans les exons nontraduits, on rencontre souvent de longues
insertions de structure variable qui ont des
effet ??? sur lexpression du gne.

LES SYSTMES DE SAUVEGARDE ET RPARATEURS


DE LADN
GNRALITS.
LADN est sensible des agressions soit chimiques soit
physiques. Ces agressions peuvent entraner la perte
dune base (purique ou pyrimidique), mais aussi
entraner la rupture dun brin ou des deux brins dADN.
La gravit des lsions que lADN subit en permanence
est lie au fait que cette molcule est unique au sein
dune cellule et au caractre transmissible de ces
atteintes. Des mcanismes puissants, cependant non
infaillibles sont prsents dans la cellule pour dceler et
corriger les lsions de lADN.

ORIGINE DES ALTRATIONS DE LADN.

Les agents physiques.


LADN peut tre agress par des agents physiques
comme les rayons X, les rayons gamma, les rayons
ultra-violets (UV). Ces agents physiques sont des
agents mutagnes (mutagnes= qui provoquent des
mutations dans lADN) les plus anciennement
connus. Les rayons UV provoquent la formation de
dimres de thymine mais aussi de dimres de
thymine-cytosine. La prsence de tels dimres
entrane un blocage de la rplication de lADN et de
la transcription. Sans rparation, leur prsence serait
donc lthale pour la cellule.

Les agents chimiques.


LADN peut tre agress par un nombre considrable de drivs
chimiques. Nous citerons plus spcialement:
- Les agents alkylants. Ils entranent laddition de groupes alkyles
aux bases (souvent des groupes -CH 3 ). Les agents alkylants
sont utiliss comme mdicaments anticancreux.
- Lacide nitreux (produit driv des nitrates ou nitrites prsents
dans les produits alimentaires ou dans les engrais). Cet agent
chimique transforme par exemple, par dsamination oxydative,
ladnine en hypoxanthine.
- Certains composs chimiques ressemblent des bases puriques
ou pyrimidiques. Ils peuvent tre incorpors dans lADN la place
des bases normales (cas du bromouracile qui ressemble la
thymine).
- Enfin, certains agents sintercalent entre les deux brins dADN,
ce sont des agents intercalants. Ils perturbent ainsi la rplication.
Cest le cas du rvlateur de lADN utilis dans de nombreux
laboratoires de biologie molculaire: le bromure dthydium ou
B.E.T.

LES TYPES DE DOMMAGES DE LADN.


Perte dune base.
La liaison glycosylique liant dans lADN les bases avec le
dsoxyribose est relativement labile dans des conditions
physiologiques. A lintrieur dune cellule de mammifre,
plusieurs milliers de bases puriques et plusieurs
centaines de bases pyrimidiques sont spontanment
perdues dans le gnome dune cellule haplode et par
jour. La perte dune base purique ou pyrimidique cre un
site appel apurinique ou apyrimidique (ou site AP).
Modification dune base.
La damination.
Les groupes -NH 2 des bases peuvent tre instables. Ils
sont convertis en groupes ctoniques =C=O. Ainsi, la
cytosine dsamine est transforme en uracile, ladnine
en hypoxanthine etc...

Les modifications chimiques.


Beaucoup dagents chimiques peuvent ragir avec les bases des
acides nucliques. Il peut sagir des espces oxygnes ractives
(peroxyde dhydrogne, radicaux hydroxyles et peroxyles) mais
aussi des radiations ionisantes (rayons X, rayons gamma). Ces
espces peuvent conduire des hydroxylations sur les noyaux
des bases (ajout de groupes -OH).
Lalkylation peut tre facilement ralise sur les bases de lADN
par addition de groupes mthyles ou alkyles par de trs nombreux
agents alkylants ou mme par laction de simples donneurs de
groupes mthyles prsents dans la cellule (sous forme de Sadnosylmthionine, par exemple).

Laction des rayons ultra-violets.


La lumire UV est absorbe par les bases des acides nucliques et
des modifications chimiques peuvent en dcouler. Les produits les
plus courants fournis par ces ractions photochimiques sont
surtout les dimres thymine-thymine (T-T), suivis des dimres
thymine-cytosine (T-C) et les dimres cytosine-cytosine. Il sagit de
structures stables entranant une distorsion considrable de la
structure de lADN.

Les erreurs de la rplication.


Nous avons vu quau cours de la rplication de lADN, les ADN
polymrases prsentent une activit exonuclasique 3 5 qui leur
permet de vrifier si la dernire base introduite correspond bien aux
conditions classiques dappariement. Cette activit ddition diminue
considrablement les erreurs possibles. Au cours de la rplication, il a
t estim que lADN polymrase III introduit un nouveau nuclotide
avec un taux derreur de 1/100 nuclotide incorpor, mais avec la
fonction ddition, finalement le taux derreur passe 1/1000
nuclotide incorpor. Cette diffrence considrable correspond la
fidlit de la rplication.
Cependant, la probabilit de produire des mauvais appariements ou
des petites insertions ou dltions pendant la rplication est loin
dtre ngligeable. Ds lors des mcanismes efficaces de rparation
doivent tre mis en oeuvre.

Formation de ponts entre les brins de lADN ou entre


des protines et lADN.
Certains agents chimiques (psoralnes par exemple) ou
physiques (UV, radiations ionisantes) peuvent conduire des
interactions stables ( crosslinks ) entre les deux brins dADN.
Des interactions stables peuvent tre galement observes entre
des protines et les brins dADN.

Les coupures des brins dADN.


Les radiations ionisantes peuvent conduire des coupures dun
brin dADN ou des cassures des deux brins dADN.

LES MECANISMES RPARATEURS DE LADN.


La possibilit de rversibilit des dommages sur lADN.
Cest la possibilit de rparer lADN la plus simple, mais
dans bien des cas elle est impossible raliser pour des
raisons cintiques et / ou thermodynamiques. Dans
certains cas, des enzymes spcifiques comme les
photolyases peuvent transformer rversiblement un ADN
ls avec prsence de dimres pyrimidiques en un ADN
normal en absorbant de la lumire. Les photolyases sont
prsentes dans les bactries, les plantes, les
champignons mais elles sont absentes chez les
mammifres.

Correction des erreurs dappariements.


Beaucoup derreurs dappariements (ou mismatches ) sont dues
des erreurs au cours de la rplication de lADN. Cependant, des
erreurs dappariements peuvent tre galement produites la suite
dune dsamination de la 5-mthyl cytosine pour produire de la
thymine qui ne sapparie pas correctement avec G.
Chez E. coli, la prsence dun mauvais appariement localis est
dcele par une protine spcifique appele protine MutS.
La protine MutS reconnat des erreurs dappariements mais
aussi des insertions ou des dltions de quelques nuclotides.
Une protine supplmentaire, la protine MutL stabilise le
complexe form entre MutS et la portion dADN double brin qui
prsente le mauvais appariement.
Ce complexe va activer une protine MutH qui va couper le
brin nouvellement synthtis. Il est remarquable que ce

systme de coupure diffrencie le brin parental et le brin


nouvellement synthtis par methylation.

En effet, dans lADN dE. coli, les squences GATC sont


normalement mthyles. Dans le brin nouvellement synthtis, la
mthylation nest pas immdiatement ralise.
La protine MutH va couper le brin nouvellement
synthtis loppos de la squence GATC mthyle du brin
parental.
Une coopration avec la protine uvrD (hlicase II) est
ncessaire.
Le brin nouvellement form est alors partiellement dgrad
et resynthtis correctement par lADN polymrase III.
La soudure finale est assure par lADN ligase.
Les organismes eucaryotes possdent de nombreux systmes de
rparation des erreurs dappariements.

Certains malades atteints dune forme hrditaire de


cancer du colon (syndrome de Lynch) prsentent des
mutations dans les gnes des enzymes de rparation
des erreurs dappariements.

Lexcision-rparation de base.
Ce type de rparation est communment utilis pour liminer les
bases incorrectes (comme luracile) ou les bases transformes par
des agents alkylants.
Il comprend trois tapes successives:
Tout dabord, une limination de la base incorrecte par une
ADN N-glycosylase avec apparition dun site AP.
Puis, une coupure du brin dADN endommag en
AP, crant ainsi un -OH (3) adjacent au site AP.

5 du site

Enfin, lextension partir de cet -OH (3) par une ADN


polymrase est ralise avec excision du site AP.
La soudure finale est assure par une ADN-ligase.

chez les mammifres et lHomme, les doublets


nuclotidiques CG peuvent tre mthyls au niveau de
la cytosine et que cette mthylation tait en relation
directe avec linactivation des gnes correspondants.
La dsamination des cytosines
aboutit la formation de la thymine.

mthyles

Une ADN glycosidase particulire reconnat


spcifiquement le msappriement TG et limine T.
T
Cependant, lefficacit de ce systme est loin
dtre parfaite.
Souvent, les mutations ponctuelles de lADN
concernent ces cytosines mthyles, on parle de
points chauds de mutation.

Lexcision-rparation de nuclotide.
Bien que lexcision-rparation de base joue un rle trs important
comme processus de rparation de lADN, elle ne peut pas suffire
corriger toutes les erreurs dans lADN.
En particulier, la disponibilit des ADN N-glycosylases ne peut pas tre
tendue toutes les altrations possibles des bases de lADN.
Un autre mcanisme plus flexible de rparation est impliqu. Ce
mcanisme est appel excision-rparation de nuclotide. Il est disponible
dans tous les organismes vivants et il implique les tapes suivantes:
Tout dabord, la reconnaissance du dommage sur lADN.
Puis une liaison dun complexe multi-protique avec le site
endommag.
Une double excision du brin endommag suit avec coupure
plusieurs nuclotides en 5 et en 3 de celui-ci.
La lacune prsente est comble par une ADN polymrase.
Une soudure finale est ensuite assure par une ADN-ligase.

Chez E. coli,
trois protines, les produits des gnes uvrA, uvrB et uvrC sont
responsables de la reconnaissance du dommage et de la coupure de
lADN
Le modle actuel implique la formation initiale dun complexe entre
deux protines uvrA et uvrB et ceci avec hydrolyse dATP
Ce complexe se lie avec lADN prfrentiellement au niveau de la zone
endommage (dimres de thymine)
Une autre protine uvrC se lie avec uvrB
ceci entrane une coupure en 5 (7 nuclotides avant le dommage) et en
3 (4 nuclotides aprs le dommage)
Intervient, la proteine du gne uvrD, qui est une hlicase II, elle dplace
loligonuclotide endommag
lADN polymrase I ou lADN polymrase II comble la lacune rsultante
La soudure finale est assure par une ADN-ligase.

Un tel systme de rparation existe galement chez les


cellules eucaryotes.
On connait dailleurs chez lHomme,
des anomalies gntiques du systme de rparation par
excision-rparation
responsables
de
maladies
gntiques graves,
la xrodermie pigmentaire (entranant une sensibilit
accrue aux rayons solaires et une augmentation du
risque de cancers cutans),
mais aussi le syndrome de Bloom ou la maladie de
Fanconi.

Les recherches thrapeutiques

Le petit nombre de malades et le faible dbouch commercial qu'offrent les


maladies rares telles que le XP
Mais depuis quelques annes, les recherches se sont multiplies et elles ont
permis de mieux comprendre les mcanismes de la maladie. Evolution des
recherches:
En 1988: Caractristiques cliniques gntiques et cellulaires. Dveloppement
d'un test antnatal. Activation des oncognes dans les tumeurs pithliales
isoles de malades atteints du XP
En 1990: Une carence en ADN hlicase serait responsable de certaines formes de
XP et du syndrome de Cockayne. Clonage du gne et de l'ADNc de groupe A du
XP
En 1996: La thrapie gnique envisageable. Une nouvelle technique de
correction gntique des cellules a t mise au point.
Elle permet, grce une construction rtrovirale, de produire des lignes de
fibroblastes de peau de malades au phnotype guri.
Cela constitue donc une premire tape vers la correction des kratinocytes de
malades et peut-tre un jour la production in vitro d'un pithlium
gntiquement corrig pouvant servir de greffon.
En 1998: Comment l'absence d'interaction entre une hlicase et son rgulateur
est l'origine d'une maladie gntique.
En 2001: Reconstruction in vitro de peau de patients atteints de XP

Les rparations post-rplicatives.


Si le systme de rparation par excision-resynthse de lADN est
dbord, et surtout si les zones dADN rparer concident avec la
prsence de fourches de rplication, il est vident que le brin
porteur de la lsion devient impropre servir de matrice.
Dans de telles conditions, le brin parental contiendra un dimre de
thymine et lautre brin fils contiendra une lacune, on parle de
lacune post-rplicative. Cest une lsion grave de lADN.
Pour traiter de telles lsions, un systme de rparation appropri
va tre mis en oeuvre. Il sagit du systme des protines Rec
(pour Recombinaison). Ce systme de rparation fait donc
intervenir une recombinaison.
La recombinaison correspond un change dADN ente deux
segments homologues. Cette correction fera galement intervenir
le systme de rparation par excision-resynthse de lADN.
Chez E. coli, la production de la protine de recombinaison appele
RecA est rduite dans les conditions normales. Ceci est li une
rpression de la synthse par un rpresseur protique appel LexA
(voir contrle de la transcription).

Le systme S.O.S.
Le systme S.O.S. a t dcrit initialement chez les
bactries. Il concerne au moins une vingtaine de gnes
dont les produits protiques sont impliqus dans les
mcanismes de rparation et de recombinaison. Ce
systme est remarquable parce quil est inductible, cest-dire mis en oeuvre par lagression physique ou
chimique.
La protine de recombinaison RecA joue un rle central
dans un tel mcanisme de sauvegarde.
La synthse de cette protine est normalement rprime
par une protine appele LexA ou rpresseur.
Si un besoin important de protine RecA apparat, la
rpression est leve grce une proprit particulire de
la protine RecA qui est capable de cliver son
rpresseur.

Biologie molculaire du cancer


Mcanisme de loncognse
INTRODUCTION

La survenue dans un organisme d'une tumeur cancreuse est


lie l'mergence d'un clone cellulaire chappant aux lois qui
rgissent la prolifration et la cohabitation cellulaire normales.
La cellule cancreuse se caractrise par 2 proprits
fondamentales :
1/ la capacit de se reproduire au del des limites fixes par le
renouvellement naturel du tissu auquel elle appartient et
2/ le pouvoir de coloniser des territoires tissulaires
normalement rservs d'autres catgories cellulaires.
Ces 2 proprits sont communes l'ensemble des cellules
d'une mme tumeur ce qui suggre que toute la population est
issue d'une seule cellule devenue anormale.

MECANISME DE L'ONCOGENESE
L'ADN = sige des altrations successives
Lorigine monoclonale de la population de cellules formant
une tumeur a pu tre vrifie dans de nombreux cas l'aide
de marqueurs gntiques
L'analyse d'une tumeur maligne indique que toutes les
cellules expriment la mme forme et donc que la masse
tumorale correspond l'expansion d'un clone cellulaire.

L'anomalie responsable de la transformation cancreuse,


virale ou non, est transmissible par division cellulaire et
consiste en une altration majeure de l'information
gntique, c'est dire une mutation de l'ADN. Du reste, la
majorit des agents carcinognes s'avrent tre
galement des agents mutagnes.

Mise en vidence des oncognes


Les "oncognes" apparaissent comme des homologues de gnes
cellulaires physiologiquement impliqus dans le contrle des
processus de maturation, de division et de diffrenciation
cellulaire et dont l'altration ("activation") peut entrainer la
transformation d'une cellule normale en cellule maligne.
La comprhension des mcanismes d'activation des oncognes
passe par la description des modles exprimentaux qui ont
permis de les tudier:
L'intgration virale dans le gnome,
La transfection d'ADN tumoral,
Anomalies cytogntiques caractristiques de certaines tumeurs,
ADN tumoral mut dans les cas de cancers hrditaires,
ADN constitutionnel dans des formes familiales de cancers.

Filire virale
Le chef de file des retrovirus tumorignes est le Virus du
Sarcome de Rous (RSV), virus ARN, dont l'intgration dans
le gnome d' une cellule est possible grce la retrotranscriptase, (une enzyme qui permet la transcription de
l'ARN en ADN).
Son pouvoir transformant est entirement contenu dans le
gne src, dont l'insertion dans le gnome de la cellule hte
peut provoquer la transformation cancreuse. On en retrouve
un quivalent dans le gnome de toutes les cellules normales
de l'hte et de nombreuses autres espces.
Cet homologue cellulaire d'un oncogne viral est un gne
cellulaire non transformant ou protooncogne.

De nombreux retrovirus tumorignes possdant des gnes


transformants v-onc homologues de gnes cellulaires
normaux c-onc ont t identifis.
L'tude systmatique des retrovirus capables de transformer
les cellules in vitro a permis d'identifier de nombreux autres
oncognes viraux correspondant chacun la version un peu
modifie d'un ou plusieurs oncogne(s) cellulaire(s).
Leur origine animale ainsi que l'emplacement chromosomique
de leur homologue humain sont connus.

Oncogenes Retroviraux
Les proto oncognes codent pour des protines qui jouent un rle
central dans la stimulation de la division cellulaire. Les oncognes
dorigine retro virale sont classs en 4 groupes:
1. Facteurs de croissance, (C-sis) & rcepteurs de facteurs de
croissance (C fms & CerbB);
2. GTP-binding proteins, (C h-ras, C k-ras, C n-ras);
3. Tyrosine specific protein kinases (C abl, C fes, C fgr, C fps,
Cros, C src, and C yes);
serine/threonine specific protein kinases (C mil, C mos, C
raf).
4. Transcription regulators(C fos, C jun, C erb A, C myc, C myb,
&Cets).
Les protines produites par les Proto oncognes, sont alteres
par des mutations, infections viral, ou agents carcinognique. Ces
protines oncogniques codent pour des protines modifies et
sur exprimes qui stimulent une division cellulaire anormale.

La haute conservation de ces protooncognes dans


toutes les espces animales tudies, y compris
l'homme, suggre leur intervention dans des fonctions
primordiales communes tous les eucaryotes.
lls diffrent le plus souvent de leur homologue cellulaire
par
des
altrations
minimes
entranent
des
modifications de leur structure ou de leur fonction qui
semblent suffisants leur confrer le pouvoir
transformant.
L'activation peut tre de type qualitatif Ou de type
quantitatif.

Pouvoir transformant
La technique de transfection de fragments d'ADN extraits de
lignes cellulaires malignes ou de cellules tumorales fraiches
des cellules fibroblastiques en culture (cellules NIH 3T3)
permet d'identifier des gnes porteurs d'un pouvoir transformant
puisque capables de confrer ces cellules un phnotype malin.
La premire mise en vidence de gnes transformants non viraux
a t ralise par transfection de petits fragments d'ADN
permettant la transformation maligne.
Les oncognes ainsi isols sont nombreux. Le chef de file en est
la famille des gne ras, isols partir d'une tumeur spontane de
la vessie chez l'homme et dont l'activation se fait toujours par une
mutation ponctuelle sur un seul codon. Cette altration conduit
la production d'une protine mute, ne diffrant de la protine
native que par un acide amin, modle de mutation purement
qualitative.

Filire cytogntique
L'amlioration des techniques de cytogntique a permis de
reconnatre, parmi les trs nombreuses anomalies chromosomiques
retrouves dans diffrents types de cancers, la spcificit de
certains remaniements non alatoires.
Les trois types de lsions morphologiques connues sont:
les amplifications gniques, les translocations chromosomiques et
les dltions.
Amplifications de proto-oncognes
L'amplification correspond l'accumulation d'un grand nombre de
copies d'un mme gne. Son existence est souponne en analyse
cytogntique sur la prsence de rgions chromosomiques se
colorant de manire uniforme appeles Homogeneous Staining
Rgions (HSR) ou se prsentant comme des mini chromosomes
surnumraires (chromosomes "double minute").
Les techniques de biologie molculaire ont permis de montrer que
ces anomalies correspondent une amplification gnique, portant
sur certains proto-oncognes.

Translocations chromosomiques Certaines translocations


provoquent des juxtapositions aberrantes de gnes ou des
fusions de 2 gnes.
juxtapositions aberrantes
une
translocation
chromosomique
interessant
le
chromosome 8 et le chromosome 14.
Il a t dmontr que la translocation entraine un change
de matriel entre la rgion du proto-oncogne c- myc situe
sur le chromosome 8 et une rgion codant pour des gnes
d'immunoglobulines (Ig). L'activation de c-myc se traduit par
son expression anormale en quantit ou en dure dans le
cycle cellulaire. La translocation survient l'occasion d'une
erreur de recombinaison gntique au cours des
rarrangements des gnes des Ig.

fusions de 2 gnes

Elle se caractrise par la prsence dans 90 % des cellules


tumorales d'une translocation entre les chromosomes 9
et 22 au cours de laquelle le proto-oncogne c-abl du
chromosome 9 est fusionn avec une squence du
chromosome 22 toujours retrouve au niveau du point de
cassure et appele pour cette raison "breakpoint cluster
region" (bcr); le produit qui rsulte de cette fusion est
une protine anormale qui prsente l'intrt diagnostique
de pouvoir tre dtecte en l'absence d'anomalie.

Dltions chromosomiques
Elles ont t mises en vidence dans le cadre de l'tude des cancers
hrditaires o elles ont conduit la notion danti-oncognes".
La constatation de la perte de la tumorignicit d'une cellule hybride
obtenue par fusion entre une cellule maligne et une cellule normale,
a conduit la notion de "gnes suppresseurs" dont l'inactivation
pourrait tout aussi bien tre responsable de la croissance tumorale
que l'activation des oncognes.
Le modle tumoral choisi pour vrifier leur existence a t le
rtinoblastome, une tumeur maligne dans laquelle on distingue 2
formes cliniquement bien distinctes :
la forme familiale, hrditaire, o s'observent frquemment des
atteintes occulaires bilatrales et o les cellules tumorales
prsentent souvent une dltion sur le bras long du chromosome 13,
et la forme sporadique, plus frquente, o les atteintes sont le
plus souvent unilatrales.

L'hypothse mise reposait sur les donnes cliniques et tait base


sur la ncessit d'une double mutation sur le mme chromosome
pour que la prolifration tumorale soit possible.
La premire mutation sur le gne en cause, constitutionnelle et
transmissible dans la forme familiale, est acquise dans la forme
sporadique.
Le second vnement mutationnel, acquis dans tous les cas au
niveau de la cellule somatique, entraine l'homozygotie pour le
"gne du rtinoblastome".
Plus rcemment, cette hypothse a t confirme au niveau
molculaire et l'apparition d'un rtinoblastome s'avre lie
l'inactivation des 2 allles d'un gne rcessif normal responsable
du contrle de la croissance normale des cellules rtiniennes.
Ce gne, dit Rb, localis sur le chromosome 13 a t identifi et
clon.
Dans les formes hrditaires de la maladie, la perte
constitutionnelle du premier allle est due une mutation ou une
dltion chromosomique et dans tous les cas la deuxime
mutation est reprsente par la perte de l'allle normal restant.

Le gne Rb est le chef de file de nombreux autres "anti-oncognes"


ou "gnes suppresseurs", identifis dans d'autres tumeurs malignes
et codant pour des protines qui sont des lments cls du
"freinage" exerc en permanence par la cellule pour contrler sa
division, sa maturation et sa diffrenciation normales.
Consquences de l'activation des oncognes : les protines
oncogniques
Le rsultat de l'activation d'un oncogne est la production d'une
protine dite "oncognique" qui ressemble la protine
normalement code par le gne cellulaire correspondant mais qui
est anormale. Il peut s'agir d'une altration :
- soit qualitative, lie une mutation portant sur les squences
codantes du gne et entranant l'apparition d'une protine mute,
- soit quantitative, lie une mutation portant sur les squences
rgulatrices non codantes du gne et entranant la production de
quantits anormales d'une protine.
Le rsultat de linactivation (dltion) d'un anti-oncogne gne su
presseur de tumeur est la perte dune protine qui dclenche
lapoptose des cellules mutantes qui peuvent donc chapper aux
systmes de rparation et de control de la division cellulaire.

Les protines codes par les oncognes peuvent ainsi tre


regroupes en quatre grandes catgories fonctionnelles :
Les protines analogues de facteurs de croissance cellulaires.
La protine code par l'oncogne sis par exemple, reprsente un
analogue mut du PDGF (Platelet Derived Growth Factor) et son
pouvoir transformant dpend de la prsence du rcepteur
correspondant la surface des cellules.
Les protines analogues de rcepteurs de facteurs de croissance.
La protine code par l'oncogne erb B par exemple, reprsente un
analogue mut du rcepteur cellulaire pour l' EGF (Epidermal
Growth Factor).
La fixation du facteur de croissance correspondant au rcepteur
entrane la transmission d'un signal de division cellulaire par
l'intermdiaire d'une activit protine kinase.
La protine oncognique pourrait possder la mme capacit
fonctionnelle mais rpondre diffremment aux systmes de
rgulation, ce qui aurait pour effet le dtournement des processus
de division cellulaire au profit de la prolifration tumorale.

Les protines impliques dans une activit enzymatique.


Les mieux connues dans cette catgorie sont les protines
kinases membranaires dont le chef de file est la protine
oncognique pp60 src, code par le gne src du RSV. Elles
exercent un rle rgulateur important dans le fonctionnement
de nombreuses protines cellulaires, comme les protines du
cytosquelette ou les protines impliques dans le mtabolisme
des prostaglandines.
Les protines activit nuclaire.
Les protines transformantes codes par les gnes c-myc sont
prsentes dans le noyau. Elles agissent vraisemblablement au
dbut du cycle cellulaire, peu avant la duplication, par liaison
directe l'ADN un stade trs terminal de la cascade.

Les protines des antioncognes


La protine oncognique p 105-Rb, code par le gne
"suppresseur" Rb appartient au systme de contrle de la
prolifration cellulaire. Elle reprsente par exemple le point
d'impact de l'activit de certains oncognes comme le E1A,
provenant des adenovirus. La protine code par cet oncogne
d'origine virale (adnovirus) agit par formation d'un complexe avec
p 105-Rb qui entraine l'inactivation de celle-ci.
La protine p53 a t identifie comme la protine cellulaire qui se
couple l'antigne T, produit transformant du virus simien SV 40.
La protine p53 peut tre considre comme la gardienne du
gnme ".
A la suite d'une lsion affectant l'ADN (rayonnement UV, exposition
un mutagne), elle agit comme un agent dcisionnel qui
provoquerait soit l'arrt de la division cellulaire soit l'apoptose.
L'ensemble de ces phnomnes contribue la stabilit de
l'intgrit gntique.

Par contre, les cellules tumorales prsentant une


mutation de p53 ne sont plus capables d'assurer ce
maintien, la cellule ne recevant plus de signal d'arrt de
division. Son gnome devient moins stable et
susceptible d'accumuler des mutations diverses
permettant l'mergence de clones cellulaires de
malignit accrue.
La p53 normale agit comme le produit d'un gne
suppresseur rcessif dans les modles animaux. Du
reste, le gne en cause est situ sur le chromosome 17,
qui est le sige frquent de dltions chromosomiques
au cours de pathologies noplasiques diverses.

Les connaissances actuelles sur la biologie du cancer conduisent


donc considrer la prolifration maligne comme rsultant d'une
succession d'vnements le plus souvent rares et alatoires dont
l'accumulation permet une cellule d'chapper au contrle
gntique, humoral et immunologique exerc en permanence par
l'organisme, et de se diviser de faon autonome, clonale et
anarchique, acqurant au fur et mesure de sa progression de
nouvelles capacits de prolifration, d'extension, et de rsistance
aux tentatives de rgulation endognes et thrapeutiques.
La multiplicit et l'intrication de ces mcanismes constitue la
principale cause d'chec des traitements, qu'ils soient non
spcifiques (cytotoxicit directe) ou plus spcifiques (stimulation
des mcanismes de dfense naturels de l'organisme).

le cancer est une maladie de l'ADN et plusieurs mutations sont


ncessaires au niveau du gnome d'une cellule normale pour
entraner sa transformation en cellule maligne.
Le cancer peut donc tre considr comme une maladie gntique
l'chelon de la cellule somatique.
A l'chelon de la cellule germinale, La prdisposition gntique au
cancer, dpend la fois de facteurs lis l'environnement, de
facteurs gntique et des facteurs lis au simple hasard.
La mise en vidence d'une prdisposition gntique au cancer a des
applications pratiques qui peuvent en dcouler, en matire de
prvention et de dpistage.

Retinoblastome
Origine Molculaire & Genetique
Perte de fonction du gne RB
gne suppresseur de tumeurs
mutation Germinale du gne suppresseur de
tumeurs RB
Substitution: C T
chromosome 13
inactivation de son expression
Retinoblastome hrditaire ou sporadique,
Cancer infantile
cause des tumeurs multiples impliquant les
deux yeux,
Ou une tumeur isol au niveau dun oeil

Neurofibromatoses
Origine Molculaire & Genetique
Perte de fonction du gne NF1
gne suppresseur de tumeurs
locus du gne: sur le chromosome 17
Le gne NF1 produit:
la Neurofibromine
(une protine activatrice de la GTPase)
Maladie gntique autosomique & dominante
Cause des neurofibromes multiples
& une prdisposition au tumeurs du systme
nerveux

Interaction de la protine P53 avec la double


hlice dADN

gne P53:
localis sur chromosome 17
Code pour une protine de 53 kD
DNA-binding nuclear protein
Transcription factor
Facteur clef de la rgulation du cycle
cellulaire
Perte de fonction de P53
Cause des types multiples de cancer

Thrapie Conventionnel du Cancer


Traitements disponibles du cancer :
Radiothrapie, chimiothrapie, immunothrapie & Chirurgie,
Traitements disponibles sont non spcifique aux cellules
cancreuses & causent donc des effets secondaires importants;
La thrapie conventionnel du cancer fait face ces limites dans
les cas de progressions incurable des tumeurs & le cancer
gnralis.
Mdicaments anticancers
Mdicaments alkylants (Endoxan): perturbent la rplication
& empechent les deux brins dADN de scarter.

Thrapie Gnique du Cancer .


Utilisation des gnes suppresseurs des tumeurs qui
existent Naturellement dans la cellule ou des gnes
dantitopoisomerases,
Insertion de ces gnes dans des vecteurs de DNA, portant
des promoteurs tissus spcifique,
La construction gntique recombinante est introduite
dans des cellules cancreuses,
Permet une expression spcifique de protines anti
cancreuses dans des cellules cibles,
Sans effets sur les cellules non carcino gnique.

Gene delivery systems


Retroviral vectors delivery: stratgie de choix pour les essaies
cliniques de thrapie gnique:
Vecteurs retro viraux recombinants & non virulent
Ces vecteurs portent des gnes anti tumoraux
Produisent un ARN gnomique viral & recombinant
Packaging en virions
Utilisation de la Reverse transcriptase virale afin de produire de
lADN double brin ds DNA dans les cellules cibles
La dsDNA recombinante intgre la chromatine des cellules cibles
Les cellules cancreuses transfects ou transduites expriment le
produit du gne anti tumoral dlivr par le vecteur viral recombinant
Moyen efficace de transfert de gnes
Les systmes Adenoviraux, sont les virus recombinants de transfert
les plus utiliss lors des essais cliniques

Gene delivery systems


Il existe des mthodes physique pour transfrer un DNA dans
les cellules :
Lipofection
Ligand DNA conjugates
Adenovirus-ligand DNA conjugates
injection directe de lADN
Complexes Liposome-DNA.

Essays de Thrapie gniques du cancer


& des maladies gntiques, infectieuses et mtaboliques
Premier transferts de gnes ont t approuvs en 1989 marker
gene ,
Premier protocole fdral de thrapie gnique a t approuv en 1990
pour le traitement de l (ADA ): Adenosine DeAminase deficiency
(Une dficience hrditaire, recessive qui cause la Severe Combined
Immunodeficiency Syndrome SCID .
Actuellement, plusieurs protocoles actifs sont en cours concernant la
thrapie gnique des tumeurs et du cancer ainsi que la thrapie
gnique de maladies gntiques, mtaboliques & infectieuse.
Exemples de protocoles actifs de thrapie gnique:
Mlanomes, Neuroblastomes, tumeurs du cerveau, du sein, Colorectal, Ovarien & Renale.
SCID, Gauchers disease, Cystic fibrosis, Hypercholesterolemia
AIDS vaccines

NeoR/Til gene markingdes cellules thrapeutiques


Nouvelle approche, pour le traitement du cancer lors des essais
cliniques implique: Tumor Infiltrating Lymphocytes TILs.
Des lymphocytes modifies gntiquement afin de produire une
protine anti tumorale TNF (Tumor Necrosis Factor).
Ces lymphocytes modifies sont re introduites dans lorganisme
du patient cancreux, elles migrent vers la tumeur, infiltrent les
cellules cancreuses, produisent le TNF & facilitent le
rtrcissement de la tumeur.
TILs peuvent produire et transfrer des cytokines (interleukin
2), qui stimulent le systme immunitaire pour attaquer les
cellules cancreuses.
Le transfert des TILs, dans les patients soufrant dun cancer
avanc est actuellement approuv en tant que protocole de
traitement par gnie gntique.

Catgories de thrapies gniques utilises pour lutter


contre le cancer.
Introduction de gnes suppresseurs de tumeurs dans les cellules
tumorales
Dclencher ou augmenter la raction immunitaire dans les cellules
cancreuses:
Introduction de gnes de cytrokines dans les cellules tumorales
Rintroduction des cellules gntiquement modifie chez le patient
Ainsi la production de Cytokine dans les cellules cancreuses active leur
immunit
Augmenter lantigenecit des cellules tumorales:
Introduire le gne de HLA-B7 dans les mlanomes malignes
(via les vecteurs retroviraux , ou via le complexe DNA/Liposome)
dclencher une forte rponse immunitaire allognique au site tumoral.

Introduction of gnes suicide directement dans les tumeurs:


Le gne de la thymidine kinase du virus herpes simplex
HSV-TK gene .
Cette kinase virale rend les cellules susceptible tre tues par
Ganciclovir .
Transfert Prfrentiel du gne HSV-TK la masse tumorale
radication Complte de la masse tumorale par leffet bystander
Protger le systme hematopoietique du patient des effets toxique
de la chimiothrapie haute dose:
Introduction de gnes de rsistance la chimiothrapie :
Le gne MDR-1 code pour une protine (P glycoprotine), utilis
une pompe (a multi drug efflux pump) qui enlve les agents chimiothrapeutique des cellules.

La recherche continue afin de dcouvrire de nouveaux


gnes & protines naturels anticancer dans la cellule
Gnes Anti topoisomerases :
Bloque le droulement de lADN chromosomale
Inhibition de la transcription & de lexpression gntique
Mort des cellules cancreuses.
Nama Alami-Ouahabi and al:
Clonage du gne de tsHMG
Expression de la protine Recombinante & sa caractrisation
Facteur nuclaire activit Anti topoisomerase I : tsHMG.

Biologie molculaire des Virus, Virodes & Prions


Biologie molculaire des Virus
Agent infectieux Structure simple; Une particule = Virion
Virion:
Acide. Nuclique ADN ou ARN (retrovirus)
Une capside externe, protique &protectrice
(Ou juste une nuclocapside ou nuclode ou core)
Une enveloppe: protge dans certains cas la nucleocapside
Pouvoir pathogne vira, Ncessite cellule hte, Lutte antiviral
Antiviraux:
-Aciclovir (Zovirax) inhibe la DNA polymerase du virus Herpex
(analogue structural de deoxyguanosine = pseudonucloside de
synthse)
-AZT: Azidothymidine inhibe la reverse transcriptase du HIV
(analogue structural de la thymine).
-Interfrons: protines de 17 25 kdaltons, synthtiss par les
leukocytes
Lymphocytes T & fibroblastes en rponse aux infections virales.
(Interfron empche la rplication virale & hydrolyse lARNm virale.

Virus de lhpatite
Types: A, B, C, D, E;
diffrents structures, modes de contamination & pouvoir pathogne

HBV
Virus ADN, gnome < 5 kb,
Gnome double brin partiel:
Brin long (-) antisens = 3,2 kb
Brin court (+) sens =longeur variable
Gnome circulaire, complmentarit partielle (200nt) lextrmit 5des
deux brins.
Gnome particulier: Gnes chevauchants permettent un petit gnome
3,2 kb de coder pour plusieurs protines
Une sequence 3 cadres ouvert de lecture (ORF): transcrit 3 RNA &
traduit 3 protines

Gnes codant & protines de HBV


Gnes codant

protines code

DNA polymerase

C (core)
Pr C

HBc prot de nuclocapside


Hbe derive de HBc

Pr S1
Pr S2
S

grande prot de lenveloppe


moyenne prot de lenvelop
courte prot de lenveloppe
prot Majeur
prots: S1, S2 & S ont activit antignique de surface HBS (test ELISA)
Rgion C & S = 1er cadre de leture
Rgion X = 2me cadre de lecture

Rplication de HBV
Rplication sans intgration dans le DNA de la cellule
hte.
Virus ADN
Le transcrit RNA 3,5 kb traduit protines:
polymerase, HBc &Hbe
Le mme RNA 3,5 kb donne :
RNA pregnomique qui donne DNA genomique
Par reverse transcriptase.

Dtection de HBV:
Analyse du sang et dtection de lAg HBs avec lAc anti HBs
Dtection de lADN virale par PCR Polymerase Chain Reaction

Prevention de HBV:
Vaccins:
Protine Ag = HBs
Pptide synthtique = oligopeptide antignique de HBs
Vaccins recombinant spars par Gnie gntique:
Construction gntique: Vecteur, promoteur& gne S
Introduction dans les levures, production de HBs non glycosyle
Vaccin recombinant + immunognique
Construction gntique: Vecteur, promoteur sequences pr S2 & S
Cellules drives dovaires de hamster chinois (CHO)
Produit HBs courte & moyenne glycosyl = augmente immunogncit
Essais de vaccins recombinant vivant = modifier gntiquement
(non virulent).

Virus HCV
Variante dtecte grce la biologie molculaire par
squenage
Virus ARN monobrin = 10 kb
RNA gnomique brin codant (+)
Gnes codent pour protines structurales
nuclocapside, lenveloppe & les prots trans membranaires
les gnes qui codent pour la rplicase
Patient prsence Ac Anti HCV = dtction tardive
Dtection prcoce de lARN virale Rt PCR

Virus HIV 1
Virus RNA = Rtrovirus,
RNA donne DNA par la Reverse transcriptase
DNA viral intgre DNA de la cellule hte C T4 = T CD4+

Gnes codant du HIV 1


3 gnes de structure:
Gag (prot: interieur de env, majeur de capside & nuclocapside)
pol (rgion code pour retrotranscriptase, integrase & protase)
Env (Glycoprotine de lenveloppe)
6 gnes rgulateurs:
nef ( Negative regulatory factor = latence)
Tat (Transcription trans activator)
Rev (Regulatior of expression of virion protines)
Vif ( virion infectivity factor = augmente pouvoir infectieux)
Vpr
& Vpu ou Vpx

Reconnaissance & affinit pour les protines de surface la c hte


Injection du RNA viral dans c hte
RNA viral donne DNA viral par reverse transcriptase
Intgration de HIV dans DNA de C Hte par les bouts LTR
Latence virale srongatif
Expression DNA virale
Dimrisation du RNA viral
Sortie des particules virales par bourgeonnement
Poursuite de la maturation des particules virales
Priode de Primoinvasion sujet sropositif
HIV augmente apoptose T4, augmentation de DNAase
donc de fragmentation de lADN
HIV diminue limmunit de lorganisme
AIDS = SIDA

Test ELISA (Enzyme Linked Immuno essay) detecte prsence dAc anti HIV
Test de confirmation: Western blot
Tests tardifs
Tests precoces : Rt PCR dtection RNA viral,
PCR dtection DNA viral

Ciblage Molculaire HIV


Contrer la reconnaissance gp 120 / CD4+
(Analogues molculaires structuraux de CD4+)
Contrer laction de la reverse transcriptase
(Analogues structuraux de nuclotides avec perte du 3 OH
Donc blocage de polymrisation donc de transformation de
RNA viral en DNA viral)
AZT = Azidothymine
DDC = Dideoxycytidine
DDI = Dideoxyinosine
Inhiber laction des Protases (maturation des particules
virales) par des inhibiteur: sequinavir, Ritonavir
Bithrapie ( AZT + anti protases) ou Trithrapie

Virodes
Structure + Simple que le virus
Une molcule de RNA non protge par protines
Structure en btonnet permet de rsister aux attaques par nuclases
2/3 de complmentarit de squence de lARN
Rsponsable de maladie chez les plantes
Homme??

BIOLOGIE MOLECULAIRE DES PRIONS


PRIONS: agents infectieux Small proteinaceous infectious particles
Absence dacides nucliques,
Petite protine,
Atteinte du systme nerveux,
Encphalopathie spongiforme,
Cerveau aspect spongieux.
Chez animal: Scarpie = tremblante de mouton &
encphalopathie bovine
Chez lhomme: Kuru (cannibalisme)
Creutzfeld-Jacob (syndrome, 1/ 100 000/an), mutations
200 Glu-----Lys , 178 Asp----Asn , rptition d1 octapeptide.
Gerstmann-strassler-sheinker, mutations:
102 Pro----Leu & 117 Ala----Val

Mise en vidence dans le gnome mammifre d un gne qui code pour


une protine:
Pr P c = Prion endogne exprime normalement dans le cerveau,
Gne sur Chromosome 20, avec 2 exons dont un seul (ex: 2) est codant,
limination lextrmit N-terminale de la protine d1 seq signal
(22aa),
Protine glycosyle PrPc 33-35 cellulaire
Lie la surface externe des cellules (neurones) par un ancrage GPI =
Glycosyl-phophatdyl-inositol
Entierement dgradable par protinase K

Protine Prion infectieux: PrPsc 33-35 qui drive de PrPc,


PrPsc 33-35: ancrage GPI mais localisation intracellulaire,
Trs rsistantes aux attaques protolytiques.
Protolyse partielle coupe 67 aa & laisse une protine glycosyle
infcectieuse de 141 aa : PrP27-30.
Transmission de maladie:
10% 15% hrdit
Contamination: Hormones de croissance (cadavres)
Greffes de corne
Instruments neurochirurgicaux
Consommation dabats ou de viandes contamins

Hypothse Prusiner:
Conversion de PrPc ( structure en hlice )en PrPsc (structure en
Feuillet ) provoque par: PrPsc.
Formation d un htro dimre entre PrPc & PrPsc.
Transformation de PrPc en PrPsc.
Accumulation de PrPsc dans les lysosymes qui clatent & les enzymes
Lysosomales endommagent les cellules nerveuses.
Les prions librs attaquent dautres cellules.

OUTILS & TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE


OUTILS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
ENZYMES:

VECTEURS:
MATRICE:
SONDES:

Enzymes de restriction
Ligases
Nuclases
polymerases/ Taq polymerase
Squanases
Phosphatases/kinases
Plasmidiques
Viraux
hybrides
ADN, ARN, Protines
ADN, ARN, Oligonuclotides, Biopuces

Enzymes de restriction:
Endonuclases dorigine bactrienne, coupent lADN des squences
de reconnaissance,
Nomenclature:
Exemples:
EcoRIExtraitedeEscherichiacoliRYBsitereconnu:G/AATTC
SmaIExtraitedeSerratiamarcescenssitereconnu:CCC/GGG
PstIExtraitedeProvidenciastuartiisitereconnu:CTGCA/G

Typedecoupure:
Cohesiveends=cosends

Blunt ends = coupure droite

TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE


CLONAGE
EXTRACTION ADN, ARN
DIGESTION DE LADN PAR LES ENZYMES DE RESRTICTION
SEPARATION DE LADN & LARN SUR GEL DAGAROSE
SEPARATION DES PROTEINES SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE
VISUALISATION DE LADN: COLORATION AU BROMURE
DETHIDIUM
TRANSFERT DE LADN, LARN & LES PROTEINES SUR
MEMBRANES DE NITROCELLULOSE SOUTHERN, NORTHERN &
WESTERN BLOTS
MARQUAGE DES SONDES, HYBRIDATION & AUTORADIOGRAPHIE
SEQUENAGE DADN.
PCR
ORGANISMES TRANSGENIQUES
EMPREINTES DADN
RFLPS
HYBRIDATION IN SITU.

LA PCR EN TEMPS REL

techniques molculaires de gnotypage en


temps rel

La Polymerase Chain Reaction PCR :


un outil crucial en diagnostic molculaire
permet une dtection sensible et spcifique des
dacides nucliques.

cibles

Le suivie en temps rel de la PCR:


acclration et une simplification considrable
des procdures de laboratoire
quantification, lamplification et la dtection de
mutations au niveau des squences cibles.

Le systme Light Cycler


Le systme Light Cycler
Le LC* est un appareil fond sur
le principe de PCR quantitative
en temps rel.
Il permet donc la dtection et la
quantification de marqueurs
fluorescents dont lmission est
directement proportionnelle la
quantit damplicons gnrs
pendant la raction de PCR.
Les mesures sont effectues en
phase exponentielle , plutt quen
point final
Les systmes de dtection :
-les agents se liant lADN
double brin
( exp : SYBR Green I qui est un
fluorophore capable de se lier au
sillon mineur de lADN double
brin )et ,
-les sondes fluorescentes

RD

Au dbut de lamplification,le mlange ractionnel


contient de lADN dnatur,les amorces et le
fluorophore non li.
Aprs le
couplage
des amorces,le
fluorophore se lie au double brin,ce qui se
traduit par une augmentation de la
fluorescence.

Pendant ltape dlongation, le nombre de


molcules de fluorophores li lADN
synthtis augmente , se traduisant par une
augmentation de la fluorescence.

Les sondes fluorescentes :


deux sondes ( Hybridization probes ) :
Mthode de dtection est base sur le principe FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transfer):
deux sondes oligonuclotidiques linaires complmentaires une
squence cible

1re sonde , dite sonde dancrage , bloque son extrmit 3


afin de prvenir son extension durant ltape dlongation et
transporte en 3 un fluorochrome donneur ( fluorescine )
qui met une lumire verte 530 nm lorsque excit par une
source de lumire

une deuxime sonde dhybridation marque en 5 avec le LC


Red 640 (fluorochrome accepteur ).

En solution, les deux sondes sont libres et


spares .
Lorsque,lors de ltape dhybridation ,les
deux sondes se fixent leur squences
respectives ,
elles se trouvent trs proches lune de
lautre , cette proximit permet le transfert
nergtique de la Fluorescine verte par le
FRET au
fluorochrome accepteur rouge ...
Et provoque son mission rouge dtecte
par le spectrofluorimtre .
Pendant ltape dlongation, les sondes
retournent de faon indpendante en
solution ce qui supprime la fluorescence
rouge .

Les courbes de fusion :


Chaque produit dADN double brin synthtis une temprature de fusion Tm
spcifique dfinie comme tant la temprature laquelle 50 % de lADN est
sous forme double brin et 50% sous forme simple brin .
Tm dpend essentiellement de la longueur du fragment dADN double brin et de
la teneur en GC de ce fragment (et aussi du degr dhomologie entre les deux
brins dADN
Analyse des courbes de fusion utilisant le SYBR Green I :
1/ le SYBR Green I est fluorescent tant quil est li lADN double brin ,
2/ quand la temprature augmente lADN double brin se dissocie , ce qui
entrane la libration du SYBR Green dans le milieu et une diminution
progressive de la fluorescence ,
3/ lorsque 50% de lADN double brin sont dissocis , la fluorescence chute
brutalement , cest cette temprature qui correspond la temprature de fusion
du produit synthtis.
La temprature de fusion est obtenue , en traant la drive premire ngative
de la fluorescence en fonction de la temprature : elle correspond au maximum
de la courbe

Analyse des mutations par le LightCycler :


Par analyse des courbes de fusion en utilisant les sondes
dhybridation(oligonuclotides):
Les deux sondes sont normalement complmentaires une
rgion spcifique au niveau de la squence amplifie.
Si le gne amplifi prsente une mutation ponctuelle au
niveau de cette rgion , on peut avoir un ou plusieurs
msappariements (mismatches).
En effet la Tm ne dpend pas uniquement de la longueur et du
contenu en GC, mais aussi du degr dhomologie entre les deux
brins dADN.
Les sondes dhybridation lis lADN dans un appariement
parfait ncessitent une Tm suprieure pour les sparer que ceux
lies lADN contenant des msappariements qui le
dstabilisent .
Le mismatch rduit donc la Tm de loligonuclotide,cette
diminution peut tre dtecte grce lanalyse des courbes de
fusion.

On remarque que la cible non mute (sauvage ) prsente une Tm


suprieure celle des squences mutes

FISH

FISH

FDA-approved kit for HER-2 testing by FISH and follow the scoring and interpretation
recommended by the manufacturer. In this procedure, the chromosome 17 centromere
is marked with a green florescent signal and HER-2 gene with an orange florescent
signal. A tumor is designated as positive for gene amplification if gene-tochromosome (17) ratio is >2.0

Microarrays: Biopuces

La biopuce ADN est une plaque de verre ou de silicium sur laquelle sont graves un
grand nombre de microcuvettes.
Sur chacune dentre elles, on accroche une squence de bases dADN, qui joue le rle
de sonde et qui est caractristique dun gne, dune mutation ou dune maladie.
On prlve alors de lADN sur le patient et on le verse dans les microcuvettes.
LADN-sonde se liera avec lADN du prlvement si et seulement si les squences sont
complmentaires. On lave ensuite la biopuce.
Pour permettre la lecture du rsultat, on a pralablement accroch lextrmit de
lADN du prlvement une molcule fluorescente.
Ainsi, dans les microcuvettes o il y a eu appariement, lADN du prlvement est rest
accroch lADN-sonde et est visible la lumire ultraviolette grce la molcule
fluorescente.
Dans les microcuvettes o il ny a pas eu dappariement, lADN du prlvement a t
enlev par le lavage et il ny a pas de signal lumineux.

Techniques de diagnostique gntique du cancer


FISH
PCR en temp rel
microarrays ou Biopuces
Permettent
La dtection des mutation de marqueurs gntiques de
cancer
La dtection de l'amplification gnique de marqueurs de
mtastase
Orientent vers un pronostic plus prcis
Des choix thrapeutiques mieux cibls
Une meilleure prise en charge des patients cancereux
Un diagnostic prcoce ou prventif (PCR en temps rel
& microarrays)