CITOMETRIA DE FLUXO

Prof. Ms EDGAR MATIAS BACH HI

Centro Universitrio Lusada - UNILUS

PRINCPIO DE
FUNCIONAMENTO

CITOMETRIA DE FLUXO

Anlise multiparamtrica de partculas em

suspenso, uma a uma.

As partculas podem ser clulas, componentes

celulares ou material no celular (Ex: protenas)

Teste qualitativo e quantitativo

Uso de anticorpos especficos marcados com

fluorocromos (de diferentes espectros de emisso)

Tambm possvel a separao de clulas

PRINCPIO DO MTODO

Partculas em suspenso passam, de uma forma

alinhada, por um feixe de luz. Pode haver
presena de partculas marcadas com
fluorocromos.

Feixe de luz (laser) interage com partculas

A interao gera sinais e fluorescncia,

detectados por detectores apropriados

CITMETRO DE FLUXO

PARTES DE UM CITMETRO DE
FLUXO
Fludos

ptica

Suspenso de partculas

Fluxo laminar

Fonte de iluminao

Cmara de Fluxo

Filtrao da disperso de luz e fluorescncia

Captao da disperso de luz e fluorescncia

Converso dos sinais em valores analgicodigitais

Aquisio, Processamento, Anlise e

Armazenamento no computador

Eletrnica

FLUDO: SISTEMA DE FLUXO

FOCO DO LASER

CONVERGNCIA
HIDRODINMICA

PRESSO DO FILTRO DE AR (SHEAT)

Laminar
Flow

Sheath Amostr Sheath

a

PRINCPIO
FACS Fluorescence
Activated Cell
Sorting

FACS

Microgotculas carregadas
eletricamente
Separadas por placas
defletoras

SEPARAO DE CLULAS (CELL SORTING - FACS)

SISTEMA PTICO

Fonte Luz: LASER

Lentes: moldam e alinham feixe do laser

Coleo de espelhos direcionam a disperso do laser e a luz

fluorescente.

Sistema de espelhos e filtros seletivos direcionam

comprimentos de onda de fluorescncia aos respectivos
detectores.

Cromgenos
Common
Laser
Lines

350
300 nm

457 488
400 nm

514

500 nm

610
600 nm

632
700 nm

PE-TR Conj.
(488nm / 695nm)
Texas Red
(595nm / 615nm)
PI
(488nm / 570nm)
PE
(488nm / 575nm)
FITC
(488nm / 525nm)

SISTEMA TICO
FACSCalibur

FL1
530/30
SSC

FL2

FL4

488/10

585/42

90/10 Beam Splitter

661/16

DM 560SP

DM 640LP
670LP

Half Mirror
Fluorescence
Collection Lens

FL3
Beam Combiner
488 nm
Blue Laser

.
Red Diode Laser
~635 nm

Flow
Flow
Cell
Cell
488/10

Focusing
Lens

FSC Diode

Filtros pticos coletar sinais de luz

Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que
seu nmero deixado passar e menor que seu nmero refletido.
Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de
seu nmero deixado passar e acima de seu nmero refletido.
Espelhos BP (bandpass) = s deixa passar o comprimento de onda
especfico.
Longpass
460

500

540

Shortpass
460

500

Bandpass

540

460

500

540

Filtro
LP 500

SP 500

BP500/30

Detector clula
fotoeltrica

NGULO DE DISPERSO LATERAL (SSC)

LASER

NGULO DE DISPERSO FRONTAL

(FSC)

FLUOROCROMOS E DETECTORES

SISTEMA ELETRNICO

Converso de sinais pticos em sinais eletrnicos

proporcionais

Dados digitalizados em computador

Confeco do grfico de disperso das partculas

analizadas (disperso do laser e fluorescncia)

Parmetro: medida proveniente de cada detector

PARMETROS
Parmetro

1 FSC (Disperso Frontal)

Parmetro

2 SSC (Disperso Lateral)

Parmetro

3 FL1

Parmetro

4 FL2

Parmetro

5 FL3

FLUORESCNCIAS
detector de FL-1 (Fluorescncia 1) capta luz
de comprimento de onda 530 nm, que
corresponde luz verde.

detector de FL-2 (Fluorescncia 2) capta luz

de comprimento de onda 570 nm, o que
corresponde luz laranja.

detector de FL-3 (Fluorescncia 3) capta luz

de comprimento de onda 650 nm, o que
corresponde luz vermelha.

DISPERSO

VOLUME (FS)

BLASTOS

POLIMORFONUCLEARES
MONCITOS

LINFCITOS
DEBRIS/HEMCIAS/PLAQUETAS
GRANULOSIDADE (SS)

400

600

Neutrfilos

200

Moncitos

Linfcitos
0

Side Scatter

800

1000

DISPERSO:

200

400

600

800

Forward Light Scatter

1000

Viso dos dados coletados

DOT PLOT: FSC x SSC
1000
400

600

CD4 PE

800

800
600
400

200

200
0

Side Scatter

FL1 x FL2

1000

0
0

200 400 600 800 1000

Forward Light
Scatter

200

400

600

CD3 FITC

800

1000

ALGUNS MARCADORES
CD3- presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos
timcitos.

CD4- 55% a 65% das clulas T perifricas maduras, especialmente no subtipo

auxiliar, mas tambm em moncitos, macrfagos e clulas dendrticas

CD8- 25% a 35% das clulas T maduras do subtipo citotxica.

CD19- presente em mais de 95% das clulas B.
CD20- assim como o CD19 est presente em todas as clulas B maduras do
tecido linfide e sangue perifrico.

CD45- expresso quase exclusivamente em clulas hematopoiticas podendo

apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO.

CD56- marcador de NK, no est expresso em clulas B, moncitos ou

granulcitos.

LEUCEMIAS
CD3
CD7
HLA DR
CD 42a
CD 61
CD19
CD33
CD13
CD14
CD34
Leucemias mielides

CD10
CD2
CD20
CD3
CD7
CD19
CD22
CD23
CD26
CD5
Leucemias Linfociticas ou
Enfermidade residual
mnima

CD3
CD7
CD2
CD19
CD5
CD56
Linfomas e Mielomas

PARMETROS CELULARES
ANALISADOS
Tamanho (FSC)
Complexidade (SSC)
Fluorescncia relativa.
(FL1, FL2, FL3)
ComplexidadeAntigenos celulares
Tamanho
Metablitos
Enzimas
Receptores

DNA

Citocinas

APLICAES

2%

10

100

45%

27% 3

26%

.1

Log PE Fluorescence (CD4)

Avaliao de sub-populaes
celulares: quadrantes CD4 e CD8.

.1

10

100

Log FITC Fluorescence (CD8)

1000

Anlise de diviso celular.

G2

G0
DNA Analysis

G1

G0G1

s
C
o
u
n
t

s
0

200

400

2N

G2 M
600

4N

800

DNA content

1000

Marcador
DNA dupla fita

Mitose

Mitose Tumoral

600
400
200

Stimulation
0

RATIO [short/long]

800

1000

Influxo de clcio

36

72

108

Time (Seconds)

144

180

Anlise de Reticulcitos

Marcador RNA

112

112

150

150

Anlise de Reticulcitos

R1

75

R4 R3 R2

R1

37

37

R4 R3 R2

Count

75

RMI = 0

Count

RMI = 34

.1

10

100

log Thiazole Orange

1000

.1

10

100

1000

log Thiazole Orange

Imunofenotipagem:
marcao celular
CD4

CD # = cluster designation number

CD2

0 7
03

Count

11 0
0
15

Imunofenotipagem

.1

10

Log FITC

100

1000

Imunofenotipagem de Linfcitos
TeB

Principais Marcadores Imunofenotpicos MO

Obrigado