Laboratorio de Ciencia Bsica III

Cromatografa: Separacin y
Extraccin de pigmentos
Vegetales.

Cromatografa

Mtodo de separacin de una mezcla de dos o ms compuestos

entre dos fases inmiscibles: una fase mvil, que transporta las
sustancias que se separan y que progresa en accin con la otra,
denominada fase estacionaria que sirve como adsorbente del
eluyente. De forma general, consiste en pasar una fase mvil a
travs de una fase estacionaria fija slida, donde dicho movimiento,
estar determinado por las afinidades polares de los pigmentos con
el eleyente(fase mvil) y el adsorbente (fase estacionaria).

Cromatografas dependiendo la naturaleza

de las fases involucradas
Cromatografa lquida.
La fase mvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria
un slido que interacta con las sustancias que se desea separar
(cromatografa lquido-slido), o bien un lquido inmiscible con la fase
mvil, depositado en la superficie de un slido (cromatografa lquidolquido). Esta forma de cromatografa puede realizarse con diferentes
arreglos experimentales: en columna, en capa delgada o en papel.

Cromatografas dependiendo la naturaleza

de las fases involucradas
Cromatografa de Gases
En este caso la fase mvil es un gas inerte (helio o nitrgeno) y la fase
estacionaria es un slido (cromatografa gas-slido) o un lquido
sostenido por un slido inerte (cromatografa gas-lquido). Este tipo de
cromatografa siempre es en columna, ya que es la nica manera de que la
fase mvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema.

Cromatografa en Capa Fina

La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa,
uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro
soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de
vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensin, otro
para aplicar la capa de adsorbente, y una cmara en la que se desarrollen las
placas cubiertas. Es preciso tambin poder guardar con facilidad las placas
preparadas y una estufa para activarlas

Cromatografa en Capa Fina

Ventajas:

La cromatografa en capa fina presenta una

serie de ventajas frente a otros mtodos
cromatogrficos (en columna, en papel, en
fase gaseosa) ya que el material que precisa
es ms simple. El tiempo que se necesita
para conseguir las separaciones es mucho
menor y la separacin es generalmente
mejor.

Pueden

usarse

reveladores

corrosivos, que sobre papel destruiran el

cromatograma. El mtodo es simple y los
resultados son fcilmente reproducibles, lo
que hace que sea un mtodo adecuado para
fines analticos.

Cromatografa en Capa Fina

Usos de la CCF
La CCF es usada frecuentemente a nivel industrial para pruebas preliminares
a la cromatografa en columna, ya que en sta tcnica podemos identificar
los compuestos una vez separados. La C.C.F. se realiza con material muy
bsico, a comparacin de la C.C., aparte de ser rpida, econmica y se
muestra mejor la separacin.

Cromatografa en Capa Fina

Concepto de Rf
La relacin de las distancias
recorridas por el compuesto
y por el disolvente, desde el
punto

de

origen

del

cromatograma, se conoce
como Rf, el cual posee un
valor constante para cada
compuesto en condiciones
determinadas.

Cromatografa en Capa Fina

Reveladores
La mayor parte de las placas de cromatografa llevan un indicador fluorescente que
permite la visualizacin de los compuestos activos a la luz ultravioleta El indicador
absorbe la luz UV y emite luz visible. La presencia de un compuesto activo en el UV
evita que el indicador absorba la luz en la zona en la que se encuentra el producto,
y el resultado es la visualizacin de una mancha en la placa que indica la presencia
de un compuesto. En el caso de compuestos que no absorben luz UV, la
visualizacin (o revelado) del cromatograma requiere utilizar un agente revelador.
Este tiene que

reaccionar con los productos adsorbidos proporcionando

compuestos coloreados.

Cromatografa en Columna
Concepto
La CC es una variedad de la cromatografa en la que la fase mvil es lquida y
pasa a travs de la fase estacionaria, slida, lquida, que esta retenida en un
recinto cilndrico. Esta modalidad consiste en hacer pasar mediante
gravedad la fase lquida sobre el slido retenido en la columna. Esta
variante de la cromatografa se realiza, normalmente, despus de las
pruebas con CCF

para comprobar que disolventes se utilizan en la

separacin del pigmento.

Cromatografa en Columna

Los compuestos que se encuentran disueltos en la fase mvil, poco a poco saldrn de la columna
cromatogrfica, y se recogen en fracciones. Las fracciones menos polares, que son por lo general
las que se retienen poco o nada en el absorbente, sern las primeras en salir de la columna. En
cambio, las sustancias ms polares, quedan retenidas por ms tiempo en el absorbente, y a
menudo es necesario el uso de diferentes disolventes con la finalidad de incrementar su polaridad
para que sean arrastradas por estos.

El eluato es la sustancia que se separa o sale de la columna despues de cada extraccion. este
metodo es de separacion y ademas es cualitativo y cuantitativo.

Cromatografa en Columna

Cromatografa en Columna
Aplicaciones
1. Separaciones de componentes de plantas medicinales.
2. Separacin de componentes de una sntesis orgnica.
3. separacin de colorantes.
4. separacin e identificacin de hioscina y de morfina.
5. separacin de acido acetico, alcohol cetilico y metil-etil cetona.
6. separacin e identificacin de los compuestos intermedios de una sntesis
orgnica, por ejemplo en la sntesis del naftaleno, identificacin de acido
ftalico, anhidrido ftalico, benceno.
7. En la produccin sinttica de acetaminofen, identificacin de la imina de la
N-acetilbenzoquinona.

Cromatografa en capa fina

Para la cromatografa en capa fina se utiliz los siguientes materiales y
reactivos:
Materiales

Reactivos

Porta objetos

Gel Slice

Frascos

Hexano

Papel filtro

Acetona

Capilares

Pasto

Estufa
Gradilla

Cromatografa en capa fina

El past se macer en un mortero donde posteriormente se le aadi una
mezcla de disolventes, dicha mezcla se realiz a base de metanol y
cloroformo. La mezcla se coloc en un frasco ambar y se dej reposar por 1
da.

Cromatografa en capa fina

Antes de realizar la C.C.F. se prepar las cromatoplacas con el gel slice y
posteriormente se colocaron en el horno a 100C por 30 min para activarlas, es
decir para eliminar la humedad que tenga.
Con ayuda de un encendedor, se quema y se rompe el capilar en dos partes de
forma que la punta quede fina y es con sta parte del capilar con la que se coloc
la muestra en la cromatoplaca a 1 cm. Aprox. De la base de la cromatoplaca.
En un frasco se coloc papel filtro en las paredes internas, posteriormente se
aadi unos mililitros de eluyente en el frasco, ste procedimiento se realiza
para facilitar la separacin al colocar la cromatoplaca en el frasco (cmara de
elusin).

Cromatografa en capa fina

Resultados

Cromatografa en columna: Pasto

Para la cromatografa en columna, se utilizaron los siguientes reactivos y

materiales (tabla 1):

Materiales

Reactivos

Soporte Universal

Hexano C6H14

Pinzas de doble presin

Acetona CH3(CO)CH3

Bureta de 25ml

Gel slice (preparado)

Tubos de ensayo

Pigmento (pasto)

Embudo
Algodn
Arena

Cromatografa en columna: Pasto

El equipo se mont y se coloc un
poco de algodn a manera de
taponar salida de la columna. La
arena se coloc en una pequea
capa de 1 cm. Aprox. para
despus colocar el gel slice hasta
abarcar partes de la columna y
se coloc, nuevamente, 1 cm
aprox. de arena. En la ultima
parte del llenado se coloc la
muestra (de 3 a 5 ml).

Cromatografa en columna: Pasto

La separacin comenz al aadir el
disolvente menos polar, Hexano en
ste caso. El disolvente se aadi
hasta completar la separacin del
primer pigmento.

Cromatografa en columna: Pasto

Una

vez

separacin
menos

terminada
del

polar

amarillo),

se

la

compuesto
(pigmento
aadi

el

disolvente ms polar, es decir,

el acetona y de esa forma se
inici

la

separacin

pigmento verde.

del

Cromatografa en columna: Pasto

Resultados:
Pigmento Amarillo
Tubo 3

16mL

Tubo 4

6mL

Tubo 5

11mL

Tubo 6

8mL

Pigmento Verde
Tubo8

3.5ml

Clorofila

Tubo 9

2.5mL

Clorofila

Tubo 10

4.7mL

Clorofila