INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera Campus

Guanajuato
Semestre Enero-Junio 2015

Laboratorio de Biorreactores
Prctica No. 8:
Esterilizacin de medios de cultivo
5BM1
Profesores
Juan Antonio Paniagua
Manuel Salgado Romn
Ma. Lourdes Meja Farfn

EQUIPO 3

Introduccin
Qu es esterilizacin?
Es un proceso cuyo objetivo consiste en destruir o eliminar
microorganismos presentes en un objeto o en una preparacin (Gennaro,
2003).
En las fermentaciones comerciales se necesitan generalmente miles de
litros de medio de cultivo lquido y millones de litros de aire, por lo que
se requiere que estn libres de organismos contaminantes, para ello se
emplean distintos mtodos de esterilizacin (Doran, 1998).

Esterilizacin en bioprocesos
Para llevar a cabo un bioproceso es de suma importancia la esterilizacin del
medio de cultivo que se va a utilizar, esto para evitar la competencia por los
nutrientes en un medio de fermentacin y as permitir el desarrollo especfico
del microorganismo de inters industrial, ya sea por ellos mismos o por el
producto generado por ellos (UNQ, s/a).
Objetivo: maximizar el rendimiento del producto y evitar prdidas a causa
de una contaminacin.

Mtodos de esterilizacin
Existen diversos mtodos para llevar a cabo este proceso, entre ellos: calor
(seco o hmedo), filtracin (para sustancias termolbiles y aire), radiaciones y
aplicacin de gas de xido de etileno (para jeringas y cajas de plstico).
Mtodos Fsicos

Mtodos Qumicos
Agentes qumicos

Calor seco o
hmedo

Filtracin

Radiacin
xido de
etileno*

Perxido de
hidrgeno
*No apto para medios de cultivo

Esterilizacin discontinua
El medio lquido se esteriliza normalmente en el reactor donde se va a
realizar la operacin en discontinuo (o por lote). El lquido es calentado
hasta la temperatura de esterilizacin introduciendo vapor en los
serpentines o la camisa del reactor (Doran, 1998).
Otro mtodo consiste en introducir vapor directamente en el reactor o
calentar el recipiente utilizando energa elctrica (Doran, 1998).

Etapas de esterilizacin por lote

-Calentamiento: depende de la velocidad de
transmisin de calor desde el vapor o elemento
elctrico.
-Mantenimiento: una vez que se alcanza la
temperatura de esterilizacin deseada, sta se
mantiene cte durante un tiempo thd
-Enfriamiento: el agua de refrigeracin
existente en los serpentines o en la camisa del
fermentador se utiliza para enfriar el medio a un
valor deseado (Doran, 1998).
Figura 1. Variacin de la temperatura respecto al
tiempo para la esterilizacin discontinua del medio
lquido.

Sistemas de esterilizacin discontinuos

Consideraciones que se deben tomar en cuenta:
Se debe poder calcular el tiempo que es necesario mantener el reactor a
temperatura cte para alcanzar el nivel de destruccin celular deseado.
Los tiempos durante los que se mantiene el medio a la temperatura de
esterilizacin deben ser los ms cortos posibles, debido a que el calor
tambin destruye los nutrientes del medio de cultivo.
La muerte celular tiene lugar en todo el proceso de esterilizacin
discontinua (incluyendo periodos de calentamiento y enfriamiento)
(Doran, 1998).

Contaminantes en el medio
Si N0= nmero de contaminantes en el medio.
Durante el calentamiento, este nmero se reduce a N1.
Al final de la isoterma, el nmero de clulas es N2 y al
final del enfriamiento es Nf.
Idealmente Nf =0, ya que al final de la esterilizacin no
deben existir contaminantes.
No es posible alcanzar tericamente la esterilizacin
absoluta ya que se necesitara de un tiempo muy largo.
El nivel de contaminacin deseado se expresa como la
fraccin de clula, que est relacionado con la
probabilidad de contaminacin.

Figura 2. Reduccin de clulas viables durante

esterilizacin discontinua.

Si se conocen N0 y Nf, el tiempo a temperatura

constante thd necesario para reducir N1 a N2, puede
calcularse teniendo en cuenta la cintica de muerte
celular (Doran, 1998).

Cintica de muerte trmica

Para una cintica de muerte celular de primer orden en un reactor operando en
discontinuo donde la muerte celular es el nico proceso que afecta al nmero
de clulas viables, se tiene que:
(1)
donde:
N = nmero de clulas viables
t = tiempo
kd = constante especfica de muerte celular

La ecuacin anterior puede aplicarse a cada uno de los periodos del ciclo de
esterilizacin discontinua.
kd depende de la temperatura as que la integracin directa de la ecuacin es vlida slo
a T cte:
ln (N1/N2) =

(2)

Donde
thd= tiempo a T cte
N1= clulas viables al comienzo de la isoterma
N2 = clulas viables al final de dicho periodo
kd se calcula en funcin de la temperatura mediante Arrhenius (3)

Esta cintica hace que se produzca un descenso exponencial del nmero de

microorganismos, mostrado en la siguiente figura, y lneas rectas cuando se
representa una grfica logartmica:

Figura 3. Grficas de la proporcin de los microorganismos sobrevivientes al ser sometidos a

temperaturas letales (izq.) y su logaritmo natural (der.), con respecto al tiempo. (con pendiente -kd)

Criterios de diseo
Para utilizar la ecuacin 2 deben conocerse N 1 y N2. Estos pueden ser calculados
teniendo en cuenta la muerte celular en todos los periodos de esterilizacin
(calentamiento, enfriamiento y mantenimiento), combinando ambas ecuaciones (2 y 3):
Integrando la ecuacin:
a. periodo de calentamiento
b. periodo de mantenimiento
c. periodo de enfriamiento
Criterio total de diseo

(Doran, 1998)

Temperatura no uniforme
Figura 4. Ecuaciones generales para la temperatura en funcin del tiempo durante los periodos
de calentamiento y enfriamiento de una esterilizacin discontinua (Doran, 1998).

Mtodo de Richards
Mtodo de clculo rpido, evitando consumo de tiempo en la integracin
grfica
Se asume que la destruccin total de las esporas ocurre a una temperatura
de 100C
Las curvas de calentamiento y enfriamiento alrededor de esta temperatura
son lineales (Murrieta, 2009)

Bacillus subtilis
Es una bacteria Gram positiva, una de sus caractersticas es su capacidad para
formar esporas en diversas condiciones de estrs, crece en un intervalo amplio
de temperaturas (15-55C) (Espinosa, 2005)
Este tipo de bacterias son tiles y eficaces para establecer la capacidad del
ciclo de esterilizacin pues se sabe que son ms resistentes al proceso que se
esta probando.

Objetivo general
Realizar esterilizacin en biorreactor utilizando B. subtillis como indicador biolgico,
al aumentar la temperatura durante periodos de tiempo determinados.
Objetivos particulares
Graficar los perfiles para etapas de calentamiento, mantenimiento y enfriamiento.
Determinar el nmero de colonias de cada muestra a diferentes temperaturas.
Determinar el valor de la energa de activacin conociendo el valor de la constante
de Arrhenius.
Determinar grados de destruccin en que cada una de las etapas (calentamiento,
mantenimiento enfriamiento).

Descripcin del sistema

El sistema consta de una autoclave conectada
a una tubera que sirve de alimentacin de
vapor al reactor tipo tanque agitado
(capacidad de 7 L) para las etapas de
calentamiento y mantenimiento; cumplidas
dichas etapas, el reactor se conect a un
intercambiador de calor el cual se utiliza para
alimentar agua al reactor en la fase de
enfriamiento. En la Figura 4, se muestra el
biorreactor utilizado. El reactor se llen con
1.5L de agua destilada estril y 1 L de medio
inoculado con B. subtilis.

Figura 4. Reactor tipo tanque agitado,

conectado a autoclave e
intercambiador de calor

Metodologa

Resultados
Durante la prctica se realiz la medicin
de los cambios de temperatura con ayuda
de un termmetro y mediante un
cronmetro se obtuvieron los tiempos en
los cuales se dieron estos cambios, los
resultados se muestran en la Tabla 1.
Las muestras se tomaron a las
temperaturas 25, 23, 62, 70, 87, 95, 98 y
50 C.

Resultados
En la siguiente grfica (Fig 5), se muestran los perfiles de las etapas del ciclo
de esterilizacin (calentamiento, mantenimiento y enfriamiento):
Tman=98C
thd= 10 min

Fig 5. Perfiles del ciclo de esterilizacin de B. subtilis.

Resultados

RESULTADOS: Muerte celular

RESULTADOS: Muerte celular

RESULTADOS: Muerte celular

Tabla 3. Concentracin celular (UFC/mL) para
cada temperatura analizada.
Muestra

T(C)

UFC/mL

N0

25

1E+11

N1

23

14285714286

N2

62

14285714286

N3

70

14285714286

N4

80

0.005407407

N5

87

0.002592593

N6

95

0.000592593

N7
N8

98
50

0.005185185
0.003185185

FIGURA 6. Diagrama de muerte celular

(UFC/mL) al aumentar la temperatura T(C).

Criterios de diseo

Criterios de diseo

Criterios de diseo

Grado total de destruccin.

Segn la ecuacin:

Se calcular el grado total de destruccin, teniendo anteriormente que:

= 32.75 - 2.16 + 0.4872 = 31.077

El
ser la fraccin de organismos viables que sobreviven despus del tratamiento por calor
(Richards, 1968)

Energa de activacin
Para calcular la energa de activacin, se utilizaron las siguientes ecuaciones:
(2)

(1)

La constante especfica de muerte celular (k) se calcula para el perodo de

mantenimiento, teniendo un tiempo de mantenimiento de 10 min:

Una vez obtenida la k, se despeja la energa de activacin de la ecuacin 2, quedando:

(3)

Para un valor de 9.5x1037 min-1 de la constante de Arrhenius (A). (Goldberg,1997).

Tomando la constante de los gases (R) como 1.9872 cal/(mol K) y la temperatura de
calentamiento (T) igual a 371.15K, sustituimos en la ecuacin 3:

Comparndolo con la energa de activacin para B. subtilis de acuerdo a (Jmenez,

2001) con un valor de 75.66 Kcal/mol, se obtiene un error del 13.26%

Clculo de los tiempos del ciclo de esterilizacin

Se

utiliza una temperatura de mantenimiento de 121C con N 0=106 UFC/mL y N=10-3UFC/mL. Con los datos

anteriores se puede calcular .

Y sabemos que:

Determinacin de criterio de calentamineto

Para poder determinarlo, es necesario conocer la velocidad con la que aumenta la temperatura en el biorreactor
en la etapa del calentamiento, se tomaron las temperaturas registradas en la Tabla I desde 0 min hasta 35 min,
realizando la Grfica 2.

Debido a que necesita conocer la velocidad con la que disminuye

la temperatura en el biorreactor en la etapa de enfriamiento se
realiza una regresin lineal de los datos registrados en la Tabla I
para la etapa de enfriamiento (A partir de 52 minutos hasta 70
minutos). Generando la Grfica .

Utilizando la pendiente de la Grfica 3 se calcula el tiempo necesario

para llegar a 121C (394.15K), iniciando a una temperatura de 23 C
(296.15K).

Empleando la ecuacin para el mtodo Richards (Stanbury et. al. ,

2003)

Grfica 3. Regresin lineal en el calentamiento. Regresin lineal donde

representa el tiempo y representa el valor de la temperatura y la pendiente
(2.0817 K/min) representa la velocidad con la que aumenta la temperatura.

Utilizando la pendiente de la Grfica 4 se calcula el tiempo necesario

para disminuir la temperatura necesaria para llegar a 23 C
(296.15K) a partir de 121C (394.15K), considerando que el tiempo
inicial es 0 en lugar de 52 min.

Grfica 4. Regresin lineal para la obtencin de la velocidad de disminucin

de la temperatura en la etapa de enfriamiento. Regresin lineal donde
representa el tiempo y representa el valor de la temperatura y la pendiente (2.2619 K/min) representa la velocidad con la que disminuye la temperatura.

Geobacillus stearothermophilus ha demostrado ser muy resistente a ciclos de

vapor a 121C y a ciertos vapores qumicos. Por lo tanto, este bacilo es la
mejor opcin como especie para ser usada en indicadores para procesos por
vapor. Por otra parte, el Bacillus subtilis ha demostrado ser el ms resistente a
ciclos por calor seco y xido de etileno, por lo que se propone aumentar la T
de mantenimiento a 100C o ms (Raben Biological Laboratorios, s/a).

Discusin
Mtodo de extensin en placa.
Fundamento.
La tcnica de extensin en placa se basa en contar las unidades formadoras de colonias o UFC presentes en un
gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de eleccin
despus de un cierto tiempo de incubacin a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un
agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; este microorganismo o microorganismos son capaces de formar la
colonia, es decir una UFC. Las colonias pueden contarse de manera confiable, se hacen las diluciones decimales
necesarias de la muestra, antes de colocarlo en el medio de cultivo. (Camacho, 2009).

El medio de cultivo no debe fundirse ms de una vez, y debe mantenerse en bao de agua regulado a 45C,
durante el tiempo suficiente para que alcance esa temperatura y hasta su utilizacin.
El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente, hasta que finalmente se
adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

ddDiscusin
Debido a la alta concentracin de microorganismos
en las muestras iniciales, no fue posible hacer un
conteo celular ni por el mtodo de la cmara de
Neubauer, as como tampoco por conteo de UFC en
cajas Petri.

DISCUSIN: Grados de
destruccin
Calentamiento: Al tratarse de un
proceso de calentamiento por
inyeccin (Mtodo hiperblico).

To: temperatura absoluta inicial del

medio [K]
c: calor especfico del medio [J/Kg K]
H: Entalpa del vapor relativa a la
temperatura del medio
ms : Flujo msico de vapor [kg/s]
M: Masa inicial de medio a esterilizar
[kg]
(Universidad del Norte de Barranquilla,
2009).

Conclusiones
Se realiz una esterilizacin de un biorreactor tipo
tanque agitado (planta piloto) determinando que el valor
de total de 31.077 con un tiempo de esterilizacin de
10 min y una temperatura de mantenimiento de 98C.
Obteniendo una esterilizacin ineficiente para Bacillus
subtilis.

Referencias
[1] Gennaro, A. (2003) Remington Farmacia: Volumen 1. Ed. Mdica Panamericana.
[2] Doran, P. (1998) Principios de ingeniera de los bioprocesos. Editorial Acribia S. A.
[3] Universidad Nacional de Quilmes (s/a) Bioprocesos II: esterilizacin.
Departamento de ciencia y tecnologa.
[4] Murrieta M. (2009) Esterilizacin de medios de cultivo para procesos de
fermentacin (Tesis doctoral). Captulo 13-34. Universidad de Sonora.
[5] Espinosa J. (2005) Caracterizacin del proceso de crecimiento de Bacillus subtilis
bajo condiciones anaerobias. (Tesis doctoral) Universidad Nacional Autnoma de
Mxico.
[6]Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009.
Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica,
UNAM. Mxico.
[7]Goldberg, E.Handbook Of Downstream Processing. 1997. Blackie Academic &
Professional

Referencias
[8]Universidad del Norte de Barranquilla. (2009). Esterilizacin de Medios
Lquidos. Curso de Ingeniera. Colombia.
[9]Pirt, S., Blackwell, I. (1975). Principles of Microbe and Cell Cultivation.
Scientific Publications. Vol. 12. 54-62.
[10]Richards, J. (1968). Introduction to Industrial Sterilization. Academic
Press. Vol. 3. 25-29.
[11] Jimnez B. (2001) Estudio de mecanismos para la viabilidad de esporas
de Trichoderma harzianum para el proceso de secado. Departamento de
Ingeniera Celular y Biocatlisis, Instituto de Biotecnologa, UNAM
[12] Meja,M. (2008). Efecto de la relacin carbono-nitrgeno sobre la
produccin de lipopptidos por Bacillus subtillis. CIBA-Tlaxcala. Mxico.
[13]

Raben Biological Laboratorios (s/a) INFORMACIN GENERAL SOBRE