Disciplina Protemica

07/05/2015

Viso Geral
Protemica
Mtodo novo de identificao e quantificao
absoluta global de protenas
Validao do mtodo
Comparao com AQUA

Variao da composio proteica em relao s

condies ambientais
Avaliao do custo proteico e de processos
biolgicos
Viso global do metabolismo
Heterogeneidade em Operons (mecanismos
ps-traducionais?)

Introduo
A disponibilidade de dados de
quantificao absoluta de protenas so
de grande importncia na compreenso
da biologia de sistemas por dois
grandes motivos:
1. Participao nos sistemas biolgicos
2. As concentraes proteicas determinam a
taxa de adaptao de processos celulares

Introduo
Padro Ouro para quantificao
absoluta:
Western Blot

No entanto, para se obter o maior

nmero possvel de protenas de uma
maneira absoluta...
Espectrometria de massas

Introduo
Metodologia de quantificao absoluta
(AQUA)
Nessa metodologia so utilizados peptdeos
sintticos marcados.
Determinada pela adio (concentrao
conhecida) de peptdeos sintticos marcados
na amostra que permitem calcular a
quantidade de peptdeos no marcados
(endgenos) com base no espectro dos
respectivos peptdeos marcados

Metodologia AQUA

Metodologia AQUA
Limitaes
A disponibilidade e os custos ($$$) para
encomendar os peptdeos sintticos
um fator limitante.
Invivel para abordagens de
quantificao e identificao
globais/larga escala

Contexto
Necessidade de desenvolvimento de
novas abordagens de quantificao
absoluta que permitam expandir a
quantificao (escala global) e que
sejam label free (menor custo)

Objetivo Protemico
Quantificar de modo absoluto o
maior nmero possvel de protenas
expressas no citoplamas de Bacillus
subtilis com o mtodo LC/MS

Objetivo Cientfico
Validar um novo mtodo
independente de dados LC/MS, na
quantificao de protenas de B.
subtilis em diferentes condies de
cultivo.

Mtodos de identificao de
peptdeos
AQUA
Dependente de Aquisio de Dados (DDA)

Seleo dos ons que sero fragmentados a

partir dos peptdeos mais intensos

Independente de Aquisio de Dados (DIA)

No h seleo dos peptdeos. O critrio de
fragmentao no com base na intensidade
dos peptdeos, mas sim numa faixa de massa
onde tudo que estiver dentro da faixa
estipulada ser fragmentado e identificado

Mtodo DDA (AQUA)

Mtodo DIA (LC/MS)

Mtodos de identificao de
peptdeos
Alternativo ao AQUA:
MS-Hi3 DIA
Estratgia Hi3: Aps a identificao dos
peptdeos utilizando o mtodo DIA, feita a
comparao das intensidades mdias de
sinal dos trs peptdeos mais intensos de
uma protena com uma protena padro
digerido internamente

MSHi3

AQUA

Fonte da amostra
Bacillus subtilis cepa BSB 168T +
Condio S

2 g/L de (NH4) 2SO4

1,4 g/L de K2HPO4
0,6 g/L de KH2PO4,
0,1 g/L Na3citrate
0,2 g/L de MgSO4
0,001 g/L de MnSO4
5 g/L de glucose
0,001 g/L de FeCl 3

Condio CH
10 g/L
Caseinhydrolysate
3,9 g/L Acido Lglutmico
1,3 g /L de L-alanina
1,5 g/L de L-asparagina
1,4 g/L de KH2PO4
1,4 g/L de NH4Cl
0,1 g/L Na2SO4,
0,1 g/L de NH4NO3
0,1 g/ L de MgSO4
0,02 g/L CaCl2
0.075 g/L de MnSO4,
FeCl3 0,001 g/L

Metodologia
Cultura de B.
subtilis

Meio S

Meio CH

Cultura de B.
subtilis

Meio CH

Meio S

Peptideos
marcados

Coluna de
C18

Coluna de
C18

Tripsina

Tripsina

Metodologia
DDA

LC/SRM

6 protenas

4000 QTRAP

4 protenas

TSQ VANTAGE

AQUA

DIA

LC/MS

Hi3

Synapt G2

Metodologia
Tempo total da corrida
4000 QTRAP: 1620 min -> 27 hrs
TSQ VANTAGE: 1440 min -> 24 hrs
Synapt G2: 4770 min -> 79,5 hrs

Tempo parcial de uso da mquina

Synapt G2: 5058 min -> 84,3 hrs

Mtodo de nalise
4000 QTRAP:MultiQuant 1.2
TSQ VANTAGE: Pinpoint 1.0
Synapt G2: MassLynx V4.1

Resultados
3 replicatas tcnicas para cada 3
replicatas biolgicas
Protenas identificadas em pelo menos 3
replicatas
FDR: 0,8 para condio S
0,4 para condio CH
Identificao
Condio S
de 1079
protenas
Condio
CH
23%

67%
10%

88% Citoplasma
8% Membrana
4% Extracelular

 A quantificao do nmero de molculas

por clula chegou a 4 ordens de
magnitude;
Protenas com 18 m/c at 150.000 m/c

 Abordagem Hi3 para quantificao

Comparao das intensidades de
sinal de trs pptidos trpticos mais
intensos com uma protena padro
interno (ADH1)
Comparao com Western Blot

 Comparao com AQUA

Quantificao absoluta mais confivel

CV abaixo de 10%
Adio de peptdeos marcados dificulta quantificao
em larga escala
Etapa de pr-fracionamento
Teste Wilcoxon-Rank-Sum

Limitao do mtodo
259 genes essenciais -> nmero de
cpias elevado
192 quantificados absolutamente
Protenas essenciais no quantificadas
podem ser divididos em dois subgrupos.
Protenas de baixo peso molecular
Protenas de membrana
Menor probabilidade de gerar peptdeos por
digesto trptica, que se encaixam na janela
analtica do espectrmetro de massa

Impactos fisiolgicos
Condio S
Glicose como fonte de carbono
Condio glicoltica
Sntese de aminocidos

Condio CH
Aminocidos como fonte de carbono
Condio Gliconeognica
Degradao de aminocidos
Volume celular 1,94X maior do que em S

 Condio S

Condio CH

35 protenas com
51 protenas com
abundancia maior
abundancia maior
do que 10.000 m/c
do que 10.000 m/c
Metabolismo do
Degradao de
carbono
aminocidos
Sntese de
Gliconeognese
aminocidos
Maquinaria de
traduo
Chaperonas
127 protenas expressas
diferencialmente

 Fator de transcrio
AHRC
Cobertura das
vias metablicas

Sntese diminui
50x
Degradao
aumenta 20x

Reprime a expresso
de genes
que
Regulao
codificam
pspara a
sntese
de arginina
traduciona
Induz a degradao
l
de arginina.

Promotor ativado
por ROCR
expresso de
proteinas da via da
degrao da
arginina

 A quantificao absoluta permitiu

analisar os nveis proteicos
heterogneos de protenas cujos genes
so codificados Operon
por um mesmo operon.
Heterogeneity

Anlise da quantidade de protenas

relacionadas a operons conhecidos e
que sabidamente esto envolvidos no
metabolismo e em vias de snteses de
cofatores.

Condio S

N
m/c

Condio CH

Mas...
Como explicar que protenas cujos
genes esto num mesmo operon
pode apresentar nveis de expresso
(nmero de molculas por clula) to
diferentes?
Regulao
PsTranscricion
al

Clculo de Custo de Protena

As clulas tm de investir um conjunto
disponvel de recursos limitados em
processos biolgicos
O custo de protena em um processo
biolgico definido como a massa total
de protenas investida no processo
O custo individual de uma protena
corresponde quantidade de protena
multiplicado pela respectiva massa
individual, em Daltons.

 Viso global sobre a distribuio de

massa nas principais funes biolgicas.

Concluses
Identificao de 1079 protenas
~40% de cobertura de sequncia (utilizando os 3
peptdeos)
~40% de cobertura do proteoma citoslico predito

Comparando MS-Hi3 X AQUA

Reprodutibilidade: MS-Hi3 < AQUA
Coeficiente de variao: MS-Hi3 > AQUA
Capacidade de identificao e quantificao:
MS-Hi3 >
AQUA

Concluses
O mtodo aplicado MS-Hi3 para a
quantificao absoluta de protenas contribuiu
para a anlise de biologia de sistemas por:
Aprimorar o conhecimento de modelos dinmicos
com base na concentrao de protenas
Permite a deteco de novos mecanismos de
regulao (Ps-Transcricionais)
Capaz de inferir o custo real de protenas em
diferentes processos (inclusive de vias metablicas)
Tornar possvel avaliar a distribuio dos recursos
celulares

Concluso
O artigo traz um novo mtodo (MSHi3)
DIA
Validado
MS-Hi3 > AQUA

Pode ser aplicado para abordagens de

investigaes globais e de biologia de
sistemas.

Figuras

http://
www.sigmaaldrich.com/life-science/proteomics/mass-spectrometry/
protein-aqua/protein-aqua-strategy.html

http
://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/40051/title/Movin
g-Target
/

http://
www.nature.com/nmeth/journal/v10/n1/abs/nmeth.2309.html