Xenotrasplante de islotes

porcinos y clulas de Sertoli en

pacientes diabticos tipo 1.
Dr. Rafael Valds Gonzlez-Salas
Laboratorio de Xenotrasplantes,
Hospital Infantil de Mxico Federico Gmez,
Mxico, D.F. MEXICO.

Antecedentes

Antecedentes
Diabetes en Mxico.
Evolucin del tratamiento
convencional.
Evolucin del esquema intensivo
Trasplante de islotes (alognico).
Trasplante de islotes (xenognico).

Justificacin
An con el esquema intensivo las
complicaciones aparecern.
En transplantes alognicos:

Escasez de donadores cadavricos.

Mayor riesgo de transmisin de enfermedades.
Complicaciones quirrgicas
Dao heptico
Alto costo del tratamiento inmunosupresor
Alto riesgo de complicaciones secundarias
Tiempo de sobrevida corto

Xenotrasplante
Riesgo de infeccin por Retrovirus
Endgeno Porcino (PERV)
Otras zoonosis

Retos del Xenotrasplante

Supervivencia de las clulas
implantadas:
Rechazo inmunolgico
Factores no inmunolgicos

Compatibilidad funcional de las

clulas implantadas
De la insulina porcina y otras hormonas
De los sistemas reguladores humanos

Diseo Experimental
a) Creacin de un sitio
inmunolgicamente privilegiado:
Dispositivo
Formacin de colgena autloga
Inmunomodulacin por clulas de
Sertoli

b) Trasplante Islotes + Sertoli

Dispositivo
Usamos un dispositivo diseado en
nuestro laboratorio, que consiste en un
cilindro de malla metlica de 6 cm de largo,
con dos tapones de polipropileno, uno de
ellos con un mbolo que llena el cilindro.

Implante del dispositivo

Dos meses antes del xenotrasplante,
dos a cuatro dispositivos fueron
implantados subcutneamente en la
pared abdominal anterior.

Procesamiento de Islotes y
Sertolis
Se utilizan
cerdos de 7
das de vida

El pncreas y los testculos son

macerados y digeridos con una
solucin de Liberasa HI.

El pncreas es
removido
inmediatament
e despus de
eutanasia por
exanguinacin.

Los islotes y las Sertolis

son cultivados
separadamente a 37C

Control de calidad
La pureza de los islotes
es de 88%
Con tincin de Ditizona.

La viabilidad es determinada por

tincin de ioduro de propidio
(Islotes:94%, Sertoli 95%)
Funcionalidad:

Pureza de Sertoli 93.6%:

por MIS y sox9.

Apoptosis (Islotes: 4.8%,

Sertoli 10.5%)
Cytometra de flujo contra
Annexina

ndices de
estimulacin de
Islotes =11.5
Sertoli:
deteccin de
Closterinas

Diseo Experimental
12 adolescentes con Diabetes Tipo 1
Consentimiento Informado:
Reclutamiento
totalmente voluntario
Pronstico con
tratamientos actuales
Procedimiento
Experimental
Objetivos

Metas
Riesgos
Costo econmico
Obligaciones del
voluntario
Obligaciones del Hospital

Biotica
Instituciones revisoras:
Comisin Nacional de Biotica
Facultad de Medicina, UNAM
Hospital Infantil de Mxico Federico
Gmez

Biotica
Cumplimiento de la declaracin de Helsinki

Art. 32. Cuando los mtodos preventivos,

diagnsticos o teraputicos disponibles han
resultado ineficaces en la atencin de un enfermo,
el mdico, con el consentimiento informado del
paciente, puede permitirse usar procedimientos
preventivos, diagnsticos y teraputicos nuevos o
no probados, si, a su juicio, ello da alguna
esperanza de salvar la vida, restituir la salud o
aliviar el sufrimiento. Siempre que sea posible,
tales medidas deben ser investigadas a fin de
evaluar su seguridad y eficacia. En todos los
casos, esa informacin nueva debe ser registrada
y, cuando sea oportuno, publicada. Se deben
seguir todas las otras normas pertinentes de esta
Declaracin..

Diseo Experimental
Monitoreo:

Requerimientos de insulina exgena

Hemoglobina glicosilada
Insulina porcina circulante
Antgenos Anti -Gal y hemolticos de cerdo
PERV (incluyendo familiares cohabitantes)

1 dispositivo removido 3-5 aos despus, para

permitir el retrasplante y tratar de obtener
independencia de la insulina.
Deteccin inmunohistoqumica de:
Clulas positivas a Glucagon
Clulas positivas a Insulina
Clulas positivas a CD3, CD4 y CD8
Clulas positivas a MIS y sox9 (Sertoli)

Seguridad
Medidas de seguridad de los animales en
la granja:

Granja cerrada y aislada (5km).

Red contra aves.
Barreras contra roedores.
Programa extensivo de vacunacin
Cuarentena estricta (Bao de entrada Bao
de salida).
Monitoreo de salud aleatorio.
Registro e identificacin detallada de cada
animal.

Seguridad
Medidad de seguridad de los animales
donadores.
Tamiz microbiolgico para:

Aujeszky (elisa)
Erisipela (elisa)
Salmonella sp.(elisa)
Salmonella sp.(cultivo de hgado y vlvula ileocecal)
Brucella a. (aglutinacin).
Influenza Porcina (inhibicin de aglutinacin)
Leptospira (microaglutinacin 16 especies).
Mycoplasma hyopneumoniae (elisa)
Coronavirus (elisa)
Toxoplasmosis (elisa)

Contingencias
Observ. Clnica o
de Lab
sospechosa
Contactar
familias y
Personas
cercanas

Reunin
de
Persona
l

Granja
Productora

Manual de
bioseguridad de
la granja
Secretara
de Salud

Instituciones
Externa

Diagnstico

Hospital

Cuarentena
Tratamiento
especfico
Seguimiento

Tratamiento

OMS

Retrovirus Endgeno Porcino

Carriles:
1.

Marcadores de tamao

2.

Control Negativo

3.

DNA porcino

4.

DNA de Pacientes

1
2036
1636
1018

PERV 814 bp
506
396

Resultados
Anticuerpos Anti -Gal

ttulos

4500
4000
3500
3000

12

2500
2000

8
12

1500
1000
500
0

nd Tx
2
2
Tx

12
PreTx

12

11
8

Da 7 Da 14

1mes

3mes

6mes

Da 7

Tiempo Post trasplante

1mes

1ao

Anticuerpos en el ensayo
Mexicano (2000-2001) vs. El Sueco
(1990-1993)
Ttulos de hemaglutininas IgM contra eritrocitos porcinos replicando
exactamente el mtodo de Lindeborg E. Xenotransplantation 2001:
8; 273-283.

p<0.0001, Mann-Whitney U test

Titer (mean sem)

256
128

64
32
16
8
4
2
Valdes et al. Groth et al.

Requerimientos de Insulina

Resultados

Paciente (% Reduccin)

7.1

7.4

Hemoglobina
Glicosilada

8.9

6.7

12

7.9

6.6

9.9

13

10.8

El primer grupo de 12 pacientes trasplantados al primer ao del

trasplante,
6 no tuvieron reducciones, 6 mostraron reducciones
variadas.

Resultados
Deteccin de insulina porcina en
suero por HPLC

Resultados
Un dispositivo fue removido de cada uno
de los pacientes, para poder ser
retrasplantados y posiblemente llegar a la
independencia de insulina.
Los dispositivos removidos fueron
analizados por inmunohistoqumica para
insulina, glucagon, MIS (un marcador de
clulas de Sertoli), y CD3, CD4 y CD8.

Insulina
HE
4
1

3
2

3
2

Glucagon

Sustancia Inhibidora
Mulleriana (MIS)

Resultados
4

CD3 Humano

1
2

Q-03-164-5
4
5
1
6

Insulina

3
2

Resultados

Conclusiones
No ha habido seales de zoonosis
No hay complicaciones metablicas
No hay intolerancia al dispositivo o al
procedimiento.
El sistema inmune de los pacientes
se mantiene intacto, medido por
reacciones intradrmicas.

Conclusiones
Respuesta Inmune
Persistencia de insulina (100% de los
dispositivos removidos) y clulas positivas
a glucagon (90%) en cantidades variables
despus de 5 aos, y de manera
sorprendente, coexistiendo con linfocitos T
No hay correlacin entre los niveles de
anticuerpo y supervivencia de las clulas.
No hay una respuesta tpica despus del
retrasplante

Conclusiones
Modificaciones en los requerimientos de
insulina exgena
En 50% de los casos hubo reducciones, en
algunos casos cerca de 100% por varios meses.
El otro 50% pudiera no haber tenido suficientes
clulas supervivientes, o una menor
sensibilidad a la insulina.

La presencia de insulina porcina se ha

podido detectar en la circulacin por medio
de HPLC

Pasos Inmediatos
Identificar los sistemas antignicos
en el cerdo que sean importantes
para el xenotrasplante a humano
Respuesta humoral

Anticuerpos Anti -Gal

Grupos sanguneos tipo ABO
Fenmeno de Acomodamiento en los dispositivos
Pruebas de reactividad cruzada para antgenos
proteicos en islotes y Sertolis contra anticuerpos
humanos preformados.

Respuesta celular

Caracterizacin de los linfocitos T en los dispositivos.

Pasos Inmediatos
Cuantificacin de la composicin
celular dentro de los dispositivos.

Hospital Infantil de Mxico

Federico Gmez

Colaboracin con otras

Instituciones.
Dr David White,
Robarts Research Institute,
University of Western Ontario
Dr Camillo Ricordi, Dr Luca Inverardi
Diabetes Research Institute,
University of Miami
Dr Gordon Weir,
Joslin Diabetes Center.
Boston, MA
Dr Robert Elliott,
Diatranz Ltd, New Zealand