UNIVERSIT CATHOLIQUE DAFRIQUE CENTRALE

COLE DES SCIENCES DE LA SANT

EXPOSE TECHNIQUES VIROLOGIQUES

AGGLUTINATION ET
IMMUNOCHROMATOGRAHIE
Prsent par les membres du groupe 5:
ABAKAR
DZEUWA SYLVIE
KAMDOUM VANESSA
KILLA CLARIS
MBA HABIB
MORROW STEPHAN
TCHOMTCHOUA TRUDELLE

Etudiants Master I Microbiologie Immunologie

Sous lenseignement de:
07/02/16

Dr TEDOM

SOMMAIRE

INTRODUCTION GNRALE

AGGLUTINATION

IMMUNOCHROMATOGRAPHIE

CONCLUSION GNRALE

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

Introduction gnrale

Les techniques de biologies molculaires

tant souvent trs fastidieuses et
onreuses, il est donc trs commun
dutiliser des tests rapides pour un
diagnostique biologique en gnral et
virologique en particulier.

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

AGGLUTINATION

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

PLAN
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Dfinition
Principe
Prlvement
Matriel
Mthode
Avantages
Inconvnients
07/02/16

Expoxe techniques virologiques

Dfinition

Agglutination: Raction entre un

antigne particulaire et un anticorps
constituant un rseau se visualisant sous
forme dun agglutinat
Antigne: toute substance capable de
se lier spcifiquement un anticorps ou
TCR.
Un anticorps: protine scrte par les
plasmocytes en rponse lentre dun
Ag dans lorganisme

07/02/16

Deux formes dantignes (Ag)

Agglutination
Ag solubles

Ag particulaires

Particule
07/02/16

Ag

Expoxe techniques virologiques

Principe
Les ractions dagglutination mettent en jeu un
Ag situ la surface dune particule.
Cest un phnomne complexe au cours duquel
les Ac sunissent aux Ag ports par la particule
formant ainsi des ponts spcifiques entre ces
particules permettant leur runion en amas.

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

Formation de complexes immuns

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

Proprits de lanticorps (Ac) agglutinant

reconnaissance spcifique lAg
liaison lantigne particulaire crant dans les
conditions optimales un rseau agglutinant
Conditions physicochimiques de temprature, de
concentration ionique ;
Concentrations
dantigne
et
danticorps

lquivalence

Classes danticorps
*IgM surtout,
*IgG parfois ;

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

10

Diffrents types dagglutination

Active

LAg appartient
naturellement
la particule
07/02/16

Passive

LAg est fix

artificiellement sur une
particule : hmatie, bille
de latex
Expoxe techniques virologiques

11

Autres critres dagglutination

Directe

Indirecte

Agglutination
directement
visible
en milieu salin
temprature du
laboratoire
07/02/16

Agglutination
ncessitant un
artifice pour tre
visible

fixation de lAg sur

une particule,
couplage dAc
modification des
conditions opratoires
Expoxe techniques virologiques
12

strile

Le prlvement
Prlvements ne ncessitant pas
de milieu de transport : selles, urines,
LCR, prlvements liquides divers (dans un
tube sec strile);sang total (dans un tube sec
ou contenant de l'EDTA)

Prlvements
ncessitant
un
milieu de transport: prlvement de
gorge,
vsicules,
conjonctives
effectus avec un couvillon strile
Conservation: 4c
07/02/16

Expoxe techniques virologiques

13

Matriel

chantillon
Ractifs (particules de latex, hmaties sensibiliss)
Les plaques de microtitration
Tubes hmolyse
Centrifugeuse
Micropipettes
Cnes
Gants usage unique
Portoirs

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

14

METHODES
Types: Agglutinations sur plaque ou lame:

Billes de latex

Globules rouges

microorganismes

Amas ou agglutinats : tmoins de la formation dun rseau de

complexes immuns se dtachant sur un fond clairci
linverse de la suspension non agglutine restant opaque
07/02/16

Expoxe techniques virologiques

15

Agglutinations en microplaques
Les complexes immuns spcifiques
lquivalence forment un rseau qui se
dpose comme un voile sur le fond
conique de la cupule.
Certaines particules non agglutines
sdimentent sous forme dun bouton
de sdimentation dans la pointe du V
environn du voile dagglutinats.
Les
particules
non
agglutines
sdimentent sous forme dun bouton
de sdimentation net dans la pointe
du V.
07/02/16

Expoxe techniques virologiques

16

Agglutinations en tube
Aprs homognisation du mlange (suspension antignique srum) et
centrifugation, remise en suspension du culot de centrifugation
montrant
Tubes de gauche :
antignes
Tubes de droite :
antignes = globules
rouges
Amas de particules ou agglutinats,
indiquant la formation de rseau :
agglutination

07/02/16

Dispersion des particules par absence

de rseaux visibles dimmuns
complexes : pas dagglutination

Expoxe techniques virologiques

17

Avantages

Grande spcificit
Rgles de conservation et de
transmission des prlvements moins
strictes
Facilit de mise en uvre
Nombreux kits commercialiss
Tests souvent la nomenclature
Requiert un faible volume d'chantillon
Ne ncessite aucun quipement

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

18

Inconvnients

Faible sensibilit
Cot lev
Nombre limit de virus recherch
Problmes dinterprtation( Rsultat
faussement ngatif en cas
dimmunodpression ou chez lenfant
jeune, faussement positif du fait de
ractions croises entre les membres
dune mme famille virale.)

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

19

IMMUNOCHROMATOGRAPHIE

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

20

PLAN
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Dfinition
Principe
Prlvement
Matriel
Mthode
Applications
Avantages
Inconvnients
07/02/16

Expoxe techniques virologiques

21

Dfinitions

Chromatographie:
mthode
de
sparation
des
constituants
dun
mlange gazeux, liquide ou solide base
sur les diffrences daffinits que
peuvent prsenter 2 ou plusieurs
composs pour deux phases: une fixe et
lautre mobile

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

22

Le principe

Un
test
immunochromatographique
est
bas sur la migration de nano ou
microparticules le long dune
membrane. La rponse obtenue
est qualitative
07/02/16

Expoxe techniques virologiques

23

PRINCIPE
1- Recherche de lAgHBS:
Ags du serum

Acs de Capture

Ac libre

Exces

Dpot

chromogne

1-Sensibilisation

07/02/16

2- Migration
par capillarit
24

3- Rvlation

PRINCIPE
2- Recherche de lAcHBC:
AcHBC du serum

Acs de Capture

Dpot

Exces

Ac anti- AcHBC
chromogne

1-Sensibilisation

07/02/16

2- Migration
par capillarit

Expoxe techniques
25 virologiques

3- Rvlation

25

MATERIALS
A). Strip

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

26

MATERIALS : Components of a strip

Sample Pad: Of cellulose, glass fiber or

other material where the fluid sample
(urine, serum, plasma, whole blood) is
applied to the lateral flow device.

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

27

Components of a strip contd.

Conjugated Pad: Is made of a nonabsorbent material such as fiberglass

pad, polyester or a similar material.

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

28

Absorbent Pad (Wick Pad)

It pulls fluid off the membrane to allow

the capillary flow of the membrane to
keep flowing in the proper direction and
at the proper rate.

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

29

Membrane

options are: nitrocellulose (high protein

binding), cellulose acetate (low protein
binding) and glass fiber membranes
(non-protein binding).

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

30

Membrane Backing:

Gives strength to the membrane, which

is often very fragile.

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

31

Detection Conjugate:

In immersion the conjugate pad is submerged in the

conjugate-protein suspension. In spraying the pad is
coated using quantitative, directional aerosol dispenser.

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

32

Preparation of Reagent Strip

1. A rectangular sheet of 3-10m pore size

nitrocellulose membrane is cut with dimensions

of 15cm x 8cm

2. A reaction zone can be formed by applying a

line of capture antibody across the long
dimension of the strip, approximately 3cm
from the top (arbitrary) of the strip.
07/02/16

Expoxe techniques virologiques

33

Preparation of Reagent Strip

3. The width of this antibody stripe should be

approximately 2mm, and this can be controlled
by using an airbrush or microprocessor
controlled microsyringe.

4. Dry for 1 hour at room temperature.

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

34

Preparation of Reagent
Strip

5. Soak membrane with an aqueous solution of inert

compound or polymer of your choice to block
excess binding sites on the membrane

6. Rinse membranes in distilled water, and dry for

30 minutes at 30C. A second membrane pretreatment, allowing for better flow, can now be
performed
07/02/16

Expoxe techniques virologiques

35

Preparation of Reagent Strip contd

7. Prepare a solution of 30% sucrose in distilled

water, and apply this to the membrane where
the conjugate reagent is to be located (normally
1cm from the bottom, with a width of 3-5mm).

8. Bake membrane for 1 hour at 40C.

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

36

Preparation of Reagent Strip

9.

Apply antibody-coated microspheres to membrane

over sucrose glaze, keeping dimensions consistent

with sucrose glaze.

10. Place bottom of membrane between absorbent

pads, saturate these with Synthetic Urine and
observe flow characteristics and color formation at
capture zone.

Modifications can then be made as necessary to

optimize the reaction kinetics discussed previously

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

37

PROCEDURE FOR
IMMUNOCHROMATOGRAPHY

The procedure is usually given by the

manufacturer and must be respected strictly.
The prescribed volume of the specimen is
usually applied to the sample pad and allowed
to flow. In some cases a buffer is added to
serve as a carrier.

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

38

PROCEDURE FOR
IMMUNOCHROMATOGRAPHY

When the sample is applied to the sample pad, the

liquid from the sample, by capillary action moves into
the conjugate pad, rehydrates the dry gold conjugate
and allows the mixing of the sample with the conjugate.
The complex of gold conjugate and analyte then moves
into and up the membrane.

Results are read visually or where applicable with a

reader after the stipulated time

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

39

Others materials
DESICCANT: Desiccant can be added into the pouch
separately or incorporated into the absorbent pad. It is
used to keep ingredients dry during storage before use.
PLASTIC HOUSING: This is the case for the test, and
the foil pouch in which the final product is presented.
ASSEMBLY

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

40

Applications

Permettre la conduite d'oprations

prophylactiques collectives ou individuelles.

Surveiller une pidmie.

Industriel (agro-alimentaire et
environnement) la dtection des pesticides
dans les aliments et autres.

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

41

Avantages
Spcificit
Assure
par
lutilisation
dun
anticorps
monoclonal dirig contre des antignes
spcifiques.
simple
La manipulation est facile et ne ncessite pas
dautre quipement quun moyen de
rfrigration pour maintenir les ractifs a
+4c
07/02/16

Expoxe techniques virologiques

42

Avantages
rapiditd'excution
Rsultats obtenus en 15 minutes donc
permet une prise en charge plus prcoce
se qui limite son cout.
fiable
La prsentation du test sous forme de carte
individuelle assure une grande scurit de
manipulation en limitant le danger et le
contact
07/02/16

Expoxe techniques virologiques

43

Avantages

technicit rduite :
faible cot
Lvaluation de la positivit et de
lintensit de la raction est aise et
peut tre apprcie par du personnel
non spcialis

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

44

Inconvnient
Applicable qua un seul type de
prlvement bien dfini
Pour certain pathologies ne permet pas
daffirmer si linfection est en cours ou
passe.
Leurs cout nest pas toujours
ngligeable

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

45

Inconvnients

Les tests avec des bonnes spcificit

ont une sensibilit beaucoup plus
difficile a apprcier
Une confirmation doit tre effectue par
western blot par exemple lorsque le test
est positif du fait de la possibilit de
faux positifs

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

46

Applications

L
immunochromatographie
et
lagglutination sont appliques aux tests
de Diagnostic in vitro dans divers
secteurs dactivit
clinique humaine: test ralis sur le
terrain
Clinique vtrinaire

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

47

Applications

Permettre la conduite d'oprations

prophylactiques collectives ou individuelles.

Surveiller une pidmie.

Industriel (agro-alimentaire et
environnement) la dtection des pesticides
dans les aliments et autres.

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

48

CONCLUSION

Lagglutination et limmunochromatographie
sont des techniques utilises dans le
diagnostique clinique rapide

mais prsentent des limites sur le plan

quantitatif qui dterminant pour une prise en
charge thrapeutique efficace.

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

49

MERCI DE VOTRE AIMABLE

ET CHALEUREUSE
ATTENTION

07/02/16

Expoxe techniques virologiques

50