ESPECTROFOTOMET

RA
Lic. Jos Manuel Arriaga Romero

PRINCIPIOS
ESPECTROFOTOMTRICOS
Caractersticas de la luz
Longitud de onda

Es igual a la distancia entre dos puntos idnticos

sobre ondas de luz consecutivas
Mientras ms cerca estn una onda de otra
La longitud de onda es ms pequea
La luz contiene mayor cantidad de energa
Hay mayor nmero de fotones en una distancia
dada

 Mientras menor es la longitud de onda, hay mayor

nmero de fotones en una distancia dada
Mayor cantidad de fotones representa mayor
energa
Las longitudes de onda ms pequeas representan
mayor cantidad de energa que las longitudes de onda
ms grandes

 Espectro electromagntico

La unidad de la longitud de onda es el nanmetro

1 nm = 10-9 m
Se expresa por la letra griega lambda ()

En base a las longitudes de onda el espectro

electromagntico se divide en tres rangos
Luz ultravioleta
Luz visible
Luz infrarroja

(UV)
(VIS)
(IR)

190 nm a 390 nm
390 nm a 750 nm
mayor de 750 nm

 La luz en el rango ultravioleta es invisible

La luz en el rango visible excita las clulas
retinianas
Percepcin de colores

La luz en el rango infrarrojo se percibe como

y sus longitudes de onda se expresan en m
1 m = 10-6 m

calor

 Las longitudes de onda menores a las del rango

ultravioleta incluyen los rayos X y la radiacin
gamma
Tienen tanta energa que penetran los tejidos

Las longitudes de onda mayores a las del rango

infrarrojo (medidas en cm) incluyen a las ondas
de radio

 Curvas de espectro de absorcin

Cada color visible corresponde a un rango de
longitudes de onda
Cada soluto coloreado absorbe un patrn nico de
longitudes de onda cuyas energas
corresponden a los niveles de energa de los
electrones en los enlaces qumicos

 El color percibido de una solucin ser dominado por

las longitudes de onda que son transmitidas (y
no por las absorbidas) por el soluto
Las longitudes de onda absorbidas
son complementarias una de otra

y transmitidas

El color visible de una solucin ser el

complemento de las longitudes de onda que son
absorbidas

 Una solucin de hemoglobina absorbe luz verde a

540 nm y se ve de color rojo
Una solucin de bilirrubina absorbe luz azul a 450
nm y se ve de color amarillo

 El patrn de absorbancias a diferentes longitudes de

onda es tan distintivo que un soluto puede un
soluto puede ser identificado por su espectro de
absorcin

Una curva de espectro de absorcin es una

grfica que muestra los patrones de
absorbancias de un soluto a diferentes
longitudes de onda

 Otro uso del espectro de absorcin es para decidir

la longitud de onda a la que se har un
anlisis cuantitativo
Debe elegirse la longitud de onda a la que la
absorbancia es mayor, debido a que an una
pequea cantidad de soluto puede producir na
cantidad medible de absorbancia

 En los ejemplos anteriores la hemoglobina es

medida a una longitud de onda de 540 nm y la
bilirrubina a 450 nm
Debe elegirse el pico de absorcin que presente el
mayor ancho, an si hay otro con mayor pico
de absorcin pero ms estrecho

 Transmisin y absorcin de
Un espectrofotmetro utiliza una lmpara de
luz
alta intensidad y mide la cantidad de luz que
penetra la solucin coloreada
La proporcin de luz que penetra la solucin se
llama transmitancia (T)

 Se expresa como porcentaje (%T) de la

luz que
atraviesa la solucin (I) en relacin a la
cantidad de luz que entra a la solucin (lo)

lo es la luz incidente y l es la luz transmitida

 La absorbancia se define como el logaritmo

negativo de la transmitancia
A = - log T = - log l/lo
La frmula simplificada para su clculo,
habiendo aplicado una transmitancia de
100 %
para lo y transformando l en %T, es:

A = 2- log %T

 Tiene la ventaja que hay proporcionalidad

directa con la concentracin de soluto
A mayor concentracin de soluto mayor
absorbancia, y viceversa

Esto permite obtener una grfica lineal cuando

se grafican las absorbancias de luz obtenidas
con diferentes concentraciones de soluto
Llamada curva de calibracin

Ley de Beer

Es la expresin formal de la relacin entre la

absorbancia y la concentracin de soluto
Se basa en tres supuestos
La luz que incide sobre el soluto es
monocromtica (una sola longitud de onda)
El soluto que est siendo analizado es el nico
coloreado presente en la solucin
La nica luz que est siendo medida proviene de
la fuente de luz analtica

 La adherencia a estas tres condiciones es difcil

Hay limitaciones inherentes a la precisin en la
medicin de la cantidad de luz transmitida
El %T es una funcin logartmica, por lo que
deben evitarse las lecturas entre 95 y 100 %T y
entre 0 y 10 %T

 Calibracin
Si todas las condiciones son ptimas
La absorbancia de una solucin debiera ser
proporcional a la concentracin de su soluto coloreado
Una solucin calibradora debiera ser suficiente

Si se han cumplido con las condiciones slo se necesita

Poner el espectrofotmetro en 0 %T (oscuridad completa
= absorbancia infinita)
Poner el espectrofotmetro en 100 %T (falta completa de
color = absorbancia 0)

 La calibracin se simplifica con la frmula siguiente:

se

de
Beer-Lambert:

Reordenando
obtiene
la
frmula

Concentracin del desconocido =

Que se resume como:

CM

X CSt

Concentracin del

calibrador

CM = concentracin del soluto en la muestra

AM = absorbancia del soluto coloreado en la solucin

= concentracin del
soluto en el calibrador
C
deSt la muestra
del calibrador
ASt = Absorbancia del soluto coloreado en la solucin

La espectrofotometra es un mtodo
analtico que usa las propiedades de la luz
para mediciones cualitativa y
cuantitativas.
La medicin depende tanto de la longitud
de onda como de las propiedades de la
partcula de luz.