Recombinacin artificial ingeniera gentica :

- Tcnicas bsicas de
ingeniera gentica.

- ADN recombinante enzimas de restriccin

- Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR)

- Marcadores Genticos de tipo Moleculares

Enzima de Restriccin : mecanismo de

accin
corta

corta
Sitio de restriccin

Secuencia palindrmo

Visualizacin de productos
de la restriccin:
ADN de virus / endonucleasa de
restriccin PsiI

M: marcador de peso
molecular (fragmentos del
DNA de virus lambda /enzima
BmeI8I).
1-2-3: ADN de diferentes virus

Importancia :
Enzima de restriccin : EcoRI
ADN del organismo 2

ADN del organismo 1

Mutaciones en sitios de restriccin

ADN de virus, con la endonucleasa de
restriccin PsiI

M: marcador de peso
molecular (fragmentos del
DNA de virus lambda /enzima
BmeI8I).
1-2-3: ADN de diferentes virus

Mutacin en el sitio de
restriccin : Marcador gentico

Normal

Enfermo

Mutacin en el sitio de restriccin : Marcador gentico

Gen normal

Gen mutado

Huellas.
Huellitas .
Marcas
Marcadores..

* Marcadores
genticos

Gen de inters agronmico

Locus marcador

MARCADORES GENTICOS
Loci heredables asociados
(ligados) a un carcter de
inters agronmico y se
heredan juntos.

1- Secuencias nucleotdicas codificantes

* Morfolgicos

* Isoenzimticos

Utilidad :
Agronmicamente :
asisten al mejorador en el
proceso de seleccin
artificial temprana de un
fenotipo superior.

2- Secuencias nucleotdicas no codificantes

* Moleculares (cidos nucleicos)

Marcadores Morfolgicos

Maz
Endosperm
a blanco
Y
Y

5 cM

5 cM

Androesterilidad

ms1

En cebada

ms1

Endosperm
a blanco

Androesterilida
d

sex1

1cM

ms 9

sex1

1cM

ms 9

MARCADORES GENTICOS
*Marcadores isoenzimticos
- Polimorfismo a nivel del producto gnico
(polipptido o protena)

MARCADORES GENTICOS MOLECULARES

BASADOS EN LA PCR (Replicacin in vitro del DNA )

REPLICACIN NATURAL DEL DNA

Replicacin
Replicacin del
del DNA
DNA

Replicacin in vivo del DNA

* Helicasa
* Protenas de unin a cadena sencilla (SSBP)
* Topoisomerasa ADN girasa
* Iniciacin de la sntesis
* ADN polimerasa III
* Primasa, ARN polimerasa
* ADN polimerasa III
* ADN ligasa.
* Correccin : polimerasas I y III

Reaccin en Cadena
de la Polimerasa
(PCR)

Los pasos 2 a 4 se
repiten 30-35 veces
e incrementan ms
de 106 veces el
fragmento de DNA
de inters

Etapas para la reaccin de PCR

Hibridacin de oligonucletidos (cebadores)

Reaccin
de
PCR
4

MARCADORES GENTICOS MOLECULARES

BASADOS EN LA PCR (Replicacin in vitro del DNA )

-Microsatlites SSR (Single Sequence

Repeat)
-5- AT AT AT AT AT AT AT 3
- 5- GTC GTC GTC GTC GTC 3
- 5- CGAT CGAT CGAT CGAT 3

Marcadores tipo SSR (Microsatlites)

oli 11

oli 12

oli 17

MPM
(pb)

oli 22

500
400
300

200

100

Fingerprinting de la Variedad
Arbequina de Olivo

MPM (pb)

Figura 3: Electroforesis
en gel de agarosa 3%

200

(A) IAS oli 12

(B) IAS oli 17
1- Empeltre de refer.
(CSIC, Espaa);

2- Empeltre LP;
3- Manzanilla de refer.
(CSIC, Espaa);
4-Manzanilla EC;
5- Manzanilla 4S;
6- Manzanilla gigante
4S;
7- Picual de refer.
8- Nevadillo EC;

Microsatlites en Olivo (Diversidad )

9- Nevadillo 4S;
M: 100 pb. DNA ladder
(Sigma).

Utilidad de los
Marcadores genticos
1- FINGERPRINTING (huella gentica)
2- BANCOS DE GERMOPLASMA
3- MAPAS GENTICOS
4- LOCI LIGADOS
5- DIVERSIDAD Y ESTRUCTURA
GENTICA
6- FORMA DE REPRODUCCIN
7- EVOLUCIN Y FILOGENIA

Seleccin Asistida
por Marcadores
(MAS)

Marcadores Genticos
*MARCADORES MOLECULARES: - Polimorfismo gentico directamente a nivel del DNA

1- Basados en la PCR
(Reaccin en Cadena
de la Polimerasa)

Enzimas de restriccin
Enzimas de tipo II :
- Corte simtrico exacto en
secuencias especficas
palindrmicas
- Origen : diferentes organismos
-Denominacin : sistema alfa
numrico, (EcoRI proviene de
Escherichia coli
- Generan extremos cohesivos
romos

2- Basados en la digestin con

endonucleasas (enzimas de
restriccin)
a) RFLP: (Polimorfismo en la Longitud
de los Fragmentos de Restriccin)

Tcnica
de RFLP

NlaIII

TaqI

RsaI

Tsp509I

MseI

Desnaturalizacin del DNA

Reaccin en
cadena de la
polimerasa
(PCR)

Ciclo 3

Marcadores moleculares basados en el: Polimorfismo de Longitud de

Fragmentos de Restriccin (RFLP)

Marcadores morfolgicos:
controlados por un solo loci y
presentan expresin temprana

a) En Brassica:
primera hoja
vellosa
b) En maz: raz
primaria prpura
coleoptilo prpura

Asociados a la
Haploida

Seleccin asistida por

marcadores (MAS)

Marcadores tipo SSRs (Microsatlites STRs- VNTRs)

e.g. 5' overhang

EcoRI G'AATTC
BamHIG'GATCC
3' overhang
CTGCA'G
(2)
When the ends of the restriction
fragments are complementary,
e.g. for EcoRI 5'G
AATTC3'
3'CTTAA

G5'

PstI

ADN del
organismo 1

ADN del
organismo 2

Figure3.3.

b.

Bluntends

Marcador Isoenzimtico

Enzima
monomrica

Enzima
dimrica