Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - Completo

Cromatografia Lquida
de Alta Eficincia
Prof. Allan Moreira Xavier
Qumica Analtica
Trata do desenvolvimento de metodologias

analticas, qualitativas e quantitativas.
Anlise qumica a aplicao de

metodologia analtica em identificao
qualitativa e determinao quantitativa de
elementos, molculas e espcies.
Amostra
Processamento
Reaes Qumicas
Mudanas Fsicas
Separao
Medida
Processamento de Dados
Avaliao Estatstica
Procedimento Analtico
Mudanas Fsicas:
Dissoluo,
Triturao,
Evaporao, Liofilizao.
Concentrao,
Reaes Qumicas:
Derivatizao,
Diluio,
mudana de pH, precipitao.
Separaes:
Filtrao,
centrifugao, destilao, sublimao,

extrao, cromatografia, eletroforese, dilise, osmose
reversa, fuso zonal.
Separaes Termodinmicas
Extrao Lquido-Lquido:
equilbrio entre duas fases
lquidas.
Extrao Lquido-Slido:
equilbrio entre fase lquida e
fase slida.
Extrao com Fludo Supercrtico:
equilbrio entre
duas fases.
Destilao: equilbrio entre fase lquida e vapor.
Precipitao:
formado.
equilbrio entre ons em soluo e slido
Separaes Cinticas
Dilise: gradiente de concentrao.
Eletroforese: gradiente de potencial eltrico.
Difuso trmica: gradiente de temperatura.
Centrifugao: gradiente de densidade.
Classificao por Fases

Gs
Lquido
Slido
EGL
CGL
EGS
CGS
CFSCL
CFSCS
ELFSC
ELL
CLL
Dilise
ELS
CLS
Filtrao
Slido Sublimao ESFSC
ESL
Fuso
zonal
Gs
FSC
Difuso
trmica
FSC
Lquido Destilao
Etapas de Separao
Dependem da:
Finalidade
da determinao;
Complexidade da amostra e
Mtodo de separao a ser aplicado.
A separao pode ser parcial ou completa,

mas sempre envolve duas fases!
Cromatografias
Termodinmica: Equilbrios entre duas fases
E
Cintica: gradiente de fluxo.
Avaliao de um Mtodo de Separao.

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Disponibilidade.
Adaptabilidade.
Seletividade do mtodo.
Capacidade total do mtodo.
Capacidade fracionria do mtodo.
Rapidez.
Convenincia.
Necessidade para determinaes quantitativas
ou qualitativas.
Facilidade de recuperao para fins
preparativos.
Custo.
Cromatografia
Cromatografia um mtodo fsico-qumico de
separao no qual os componentes a serem
separados so distribudos entre duas fases,
uma que permanece estacionria e outra que
se movimenta em uma direo definida.
L. Ettre, Pure Appl. Chem. 65 (1993) 819.
Migrao Diferencial
a base da separao cromatogrfica.
Resultado das diferentes interaes do

soluto com a Fase Estacionria (FE) e a
Fase Mvel (FM).
Migrao Diferencial
Fase
Estacionria
Fase
Mvel
Amostra
Coluna
Cromatogrfica
Migrao Diferencial
Resposta
do
Detector
Tempo
Migrao Diferencial
Resposta
do
Detector
Tempo
Migrao Diferencial
Resposta
do
Detector
Tempo
Migrao Diferencial
Resposta
do
Detector
Tempo
Migrao Diferencial
Resposta
do
Detector
Tempo
Migrao Diferencial
Resposta
do
Detector
Tempo
Migrao Diferencial
Resposta
do
Detector
Tempo
Migrao Diferencial
Resposta
do
Detector
Tempo
Migrao Diferencial
Resposta
do
Detector
Tempo
Migrao Diferencial
Resposta
do
Detector
Tempo
Migrao Diferencial
Resposta
do
Detector
Tempo
Migrao Diferencial
Resposta
do
Detector
Tempo
Migrao Diferencial
FM
FE
Cromatografia
Tcnica
Planar
Coluna
FM
Lquido
FE
Tipos
CP
Tipos
Derivados
Recheada
S FL
CCD
Capilar
Gs
FSC
FL
S FL
CLC
Lquido
CLAE
FL
CGL CGS CGQ CGFL CSS CSFL
CLL CLS CE CLQ CTI CLFL CB
FR
SCOT
SPOT
FR
FR
PG
FN
WCOT
WBOT
FN
FN
FG
CCD
TI
PLOT
PM
TA
TC
TL
PMI
FR
FN
PI
Desenvolvimento: Anlise Frontal

Amostra continuamente
aplicada coluna;
S
i
n
a
l
FE torna-se saturada em
relao
a
um
dado
componente, que ento
eludo, inicialmente na forma
pura, depois como mistura.
Tempo
Amostra tambm a FM.
Desenvolvimento: Deslocamento
S
i
n
a
l
C
B
E
D
Tempo
Componentes da amostra
so eliminados da FE usando
uma FM que mais atrada
pela FE.
Cada componente da
amostra
funciona
como
deslocador do seguinte.
CTI,
preparativa.
CB,
CLFQL
Desenvolvimento: Eluio
S
i
n
a
l
Amostra aplicada uma

nica vez.
D
C
Tempo
FM pura arrasta os
componentes da amostra ao
longo da coluna.
Tipo mais encontrado de
cromatografia analtica.
Mecanismos de Reteno
Mecanismos Fsicos:
Foras
Orientao de Keenson: dipolo-dipolo interaes entre

molculas de dipolos permanentes;
Induo de Debye: dipolo-dipolo induzido dipolo induzido
por molculas vizinhas;
Disperso de London: dipolo induzido dipolo induzido
polaridade momentnea.
Foras
de van der Waals:
Eletrostticas:
Ligaes de Hidrognio;
Ligaes .
Mecanismos Fsicos:
Interfaciais:
Adsoro em
stios ativos.
Intrafaciais:
Partio entre
duas fases (solubilidade).
Mecanismos de Reteno:
Mecanismos Qumicos:
Troca-Inica:
Bioafinidade:
Complexao,
Quiral.
Mecanismos Mecnicos:
Excluso:
Permeao.
Parmetros Cromatogrficos
tR = tR - tM
S
i
n
a
l
tR
tR = Tempo de Reteno
tM = Tempo de Reteno
do Composto NoRetido
tM
tR = Tempo de Reteno
Ajustado
Tempo
dR
tR
f
tM
dM
n
t '
k S R
nM
tM
dM = distncia de
retardamento da
FM
dR = distncia de
reteno do soluto
f = velocidade do papel
registrador
k = fator de reteno
Tempo de reteno de um
composto no retido pela
FE
FR
Uracil
FN
Heptano
CTI
D2O
CB
CE
HOH
M > 106 g mol-1
Em CLAE:
0,8 Vc
tM
F
dc L
Vc
4
Vc = volume da coluna vazia

F = vazo
dc = dimetro da coluna
L = comprimento da coluna
k 2 tR2 '
k1
tR1 '
2(tR2 - tR1 ) 1,18(t R2 - tR1 )
RS
(w b1 w b2 )
(w h1 w h2 )
Eficincia
Capacidade de eluio
com o mnimo de
disperso do analito.
FM
FE
Cada estgio de equilbrio

chamado de Nmero de Prato
Etapas de Equilbrio
FM
FE
Fase Mvel
Fase Estacionria
KC
A S
A M
KC = Constante de Distribuio (Partio)

[A]S = concentrao do analito na FE
[A]M = concentrao do analito no gs
O nmero de pratos de
uma coluna (N) pode
ser calculado por:
tR
N 16
wb
tR
wb
Coluna mais
eficiente
Isotermas de Distribuio
[A]S
S
i
n
a
l
[A]M
Tempo
Curva Gaussiana
[A]S
Convexa:
Langmuir
[A]M
S
i
n
a
l
Pico com
cauda
Tempo
Isotermas Langmuir: FE saturada pela amostra
[A]S
S
i
n
a
l
Cncava:
AntiLangmuir
[A]M
Pico com
cauda
frontal
Tempo
Molculas da amostra associam-se e o

conjunto interage com a FE.
As10 = Fator de assimetria
do pico a 10 % da sua
altura
TF = Fator de cauda do pico a

5 % da sua altura
Fator de
assimetria
do pico
Ideal: 1,0 a 1,2

Aceitvel: at 1,6
Distoro de Picos
Pico cortado
em cima
Cauda
Cauda
frontal
Pico
cortado
em baixo
(tipo
pirmide)
Com
pice
duplo
Com
ombro
Alargamento de Picos
A migrao um analito
pela coluna provoca
inevitavelmente o
alargamento da sua
banda:
Efeitos do alargamento excessivo
de picos:
Separao deficiente de
analitos com retenes
prximas.
TEMPO
Picos mais largos e

menos intensos = menor
detectabilidade
Alargamento de Picos
Largura Inicial
da Banda
Largura
Final da
Banda
Equao de van Deemter
A = 2 dP
B = 2 DM
C = 2 DM
Altura do prato, H
B
H A C.
Curva
Hipottica de
van Deemter
C.
Hmnimo
A
B/
Velocidade Linear da FM,

TERMO A Efeito de caminhos mltiplos ou
Difuso Turbilhonar
Refere-se ao alargamento dos picos, devido aos diferentes caminhos
seguidos pelas molculas da amostra. No depende da velocidade linear.
Para minimizar o termo A necessrio usar colunas com dimetros internos

pequenos, bem recheadas e partculas com tamanho pequeno e uniforme.

TERMO B Difuso molecular longitudinal
Est relacionado com a difuso molecular do soluto na fase mvel.
inversamente proporcional velocidade linear
O efeito do termo B est relacionado com o fluxo. Conforme aumentado o fluxo, o tempo
para difuso reduzido

TERMO C Transferncia de Massa
Transferncia de Massa da FM
Diferenas de fluxo em um mesmo caminho seguido pela FM.
Entre as partculas, o fluxo maior do que os adjacentes a elas, levando a diferenas de
transferncia de massa e, conseqentemente, ao alargamento de banda.
Transferncia de Massa da FM Estagnada

Com partculas porosas, tem-se a FM dentro dos poros das partculas estagnadas ou no se
movimentando.
As molculas do soluto que difundem para essa FM transferem-se mais lentamente do que
aquelas que no se difundem, tambm resultando no alargamento de banda.
Transferncia de Massa da FE
Depois da difuso das molculas para dentro de um poro, elas penetram na FE ou ligamse a ela de alguma maneira.
Se uma molcula penetra muito na FE, ela perde um tempo maior na partcula e demora
mais tempo para atravessar a coluna.
Principais Mtodos de Integrao de Picos Cromatogrficos
Manual
Mecnica
Eletrnica
Altura do Pico
rea do Pico:
Altura x Largura na meia
altura
Tringulo
Planimetria
Cortar e pesar o papel
Integrador tipo
Bola e Disco
Integrador Digital,
Computador
Relao Entre Resoluo e Eficincia
M resoluo e
m eficincia
Boa resoluo e
m eficincia
Boa resoluo e
boa eficincia
Injeo
Amostra: fenilanilina
FE: FR
0%
Acetonitrila
30%
Acetonitrila
50%
Acetonitrila
70%
Acetonitrila
Injeo
Coluna: 50 x 3,9 mm
FE: C18 dimetil uria
Condies de anlise:
FM MeOH/tampo fosfato
(65:35 v/v) mmol mL-1
Vazo 0,6 mL min-1
Deteco: UV em 254 nm
Temperatura: ambiente
Volume de Injeo: 5 L
FTALATO DE DIBUTILA
AMITRIPTILINA
Mtodos de Integrao de Picos
Clculo da normalizao da rea corrigida.

Massa
rea A
Pico
Injetada m (cm2)
A
B
C
D
10
10
10
10
100
150
300
600
Fator
rea
Resposta Corrigida A/
A/m
(A/m)
10
15
30
60
10
10
10
10
% Massa
25
25
25
25

A)
B)
C)
Mtodos de integrao dos sinais fornecidos pelo registrador:

A) Altura do Pico
B) rea do Pico
C) rea na meia altura
Determinao da altura de picos com linha de base irregular.
Erros de Integrao
Cromatograma e seus Propsitos
Pico fornece informaes Qualitativas e Quantitativas

sobre a mistura em questo:
Qualitativa: O tempo de reteno de um componente sempre

constante em condies cromatogrficas idnticas.
Condies Cromatogrficas:
Dimenses da coluna cromatogrfica;

Tipo de fase estacionria;
Composio da fase mvel;
Vazo da fase mvel;
Volume de injeo;
Temperatura.
Um pico pode ser identificado injetando a substncia relevante e

ento comparando os tempos de reteno.
Cromatograma e seus Propsitos
Pico fornece informaes Qualitativas e Quantitativas

sobre a mistura em questo:
Quantitativas: tanto a rea quanto a altura do pico so

proporcionais quantidade de um composto injetado.
Uma curva de calibrao pode ser construda a partir de reas ou

alturas de picos cromatogrficos obtidos para vrias solues de
concentrao precisamente conhecida e uma comparao entre
tamanhos de picos pode ser feita para se determinar a
concentrao do analito na amostra.
Anlise Qualitativa
Identificao de amostra por

comparao.
Efeito do tamanho da
amostra no tempo de
reteno.
Anlise Quantitativa
Anlise
Quantitativa
de Picos
Pequenos
Propagao
de Erros
Aleatrios em
CLAE
Anlise Quantitativa
Erros na construo de Curvas Analticas
Anlise Quantitativa
Reprodutibilidade em
Anlise de Traos
Anlise Quantitativa
Fontes de Erros em CLAE
Habilidade do operador;
Contaminao:
Reagentes,
Padres,
Recipientes, ...
Ambiente:
Temperatura,
Presso,
Umidade,
Vapores orgnicos e Inorgnicos no
ar, ...
Identificao do componente/agente
que produz o sinal;
Interferentes;
Equipamentos;
Clculos.
Fontes de Erros em CLAE
Cromatografia Lquida Clssica

Caractersticas:
Dimetro interno da coluna: 2 a 10 cm.
Partculas de FE: 150 a 200 m.
FM flui pela coluna por ao da gravidade.
Vantagens:
Desvantagens:
til
como
cromatografia
preparativa;
Tempo de anlise (horas a dias);
Baixo Custo;
Simplicidade.
Recheio utilizado uma nica vez;

Dificuldade de fazer separaes
qualitativas e quantitativas;
Baixa resoluo.
Cromatografia
Eficincia
Lquida
de
Alta
uma tcnica cromatogrfica que utiliza como FM um

lquido e equipamentos sofisticados para separar os
componentes de uma amostra pela interao com a FE e
a FM.
Utilizam-se colunas metlicas ou capilares e FM

pressurizada, obtida com auxlio de bombas de alta
presso, para permitir uma vazo mais rpida da FM.
tambm conhecida como CLAE, ou de Alta Velocidade,

ou de Alta Presso ou de Alto Desempenho ou, ainda, de
Alta Performance.
Cromatografia
Lquida de
Alta Eficincia
Cromatografia
Eficincia
Lquida
de
Alta
Vantagens:
FE utilizada vrias vezes.

Tempo reduzido de anlise (minutos a horas).
Alta resoluo.
Boa para anlise qualitativa:
Bons resultados quantitativos: desvios inferiores a 5%.

Boa detectabilidade:
Parmetros para identificao: tR, espectro de absoro no UV (detector

de arranjo de diodos), espectro de massas.
Absoro UV-Vis de varivel: 10-10 g;

Fluorescncia: 10-12 g.
Versatilidade: nico requisito a solubilidade da amostra na FM.

Mecanizao.
Cromatografia
Eficincia
Lquida
de
Alta
Desvantagens:
Alto custo do aparelho.

Alto custo de manuteno do aparelho.
No existe um detector universal:
ndice de refrao: baixa detectabilidade (10-6 g), pouco estvel.
Espectrmetro de massas: ~ US$ 120.000
Experincia do operador.
Sistema de CLAE
Reservatrio para Fase Mvel
Local onde se coloca o solvente, ou mistura de

solventes, usado(s) como Fase Mvel.
Volume do Reservatrio.
CLAE Analtica
d.i.(mm)
F (mL min-1)
VR (L)
2 5 (convencional)
1 (Microbore I)
0,2
0,1
2 (Microbore II)
0,05
0,1
Capilares
0,004
0,002 0,02
CLAE Preparativa
d.i.(mm)
F (mL min-1)
VR (L)
20 100
100
48
Reservatrio para Fase Mvel
Bomba
Material do Reservatrio:
Vidro: mais comum; anlise de orgnicos.

Ao inoxidvel: mais seguro.
Plstico: plastificantes migram para FM;
apenas utilizado para anlise de ons.
Filtro
Solvente
Filtro do Reservatrio:
Captar a FM e evitar que partculas suspensas na Fm obstruam

os capilares ou contaminem a bomba.
Deve reter partculas sem produzir queda excessiva de presso.
Filtros de 10 a 40 m.
Filtrao do
solvente essencial
em CLAE!!
Degasseificao da Fase Mvel
Indispensvel para o bom funcionamento do sistema.
Garante:
reprodutibilidade do fluxo: retira ar dissolvido na FM e evita

bolhas na bomba;
Estabilidade na linha de base: bolhas no detector causam
instabilidade da linha de base;
Transparncia na faixa baixa de UV: O2 absorve em < 250 nm.
Deve ser realizada antes da mistura dos solventes que

compe a FM: degasseificao pode levar a mudanas
na composio da FM.
Mtodos de Degasseificao
Ultra-Som:
Vcuo:
Rpido, eficiente, refazer de 12 em 12 horas.
Purga com Hlio:
Lento (~20 minutos), pode alterar a composio da FM, requer

agitao.
Vcuo + Ultra-Som + Agitao:
Muito lento, pouco eficiente, requer agitao, em geral o pior mtodo

quando usado sozinho.
Contnuo, hlio razoavelmente caro, leva a aumento de vazamentos,

maior custo operacional, pouco conveniente.
Degasificador:
Contnuo, remove o ar logo antes de entrar na bomba, investimento alto

inicial (mlehor opo a longo prazo).
Bombas de Alta Presso
Tm por finalidade enviar um fluxo constante e

reprodutvel de FM para o sistema cromatogrfico.
Requisitos:
1.
2.
3.
4.
5.
Ser de material inerte;

Devem gerar altas presses: 0,01 a 35 MPa (para anlises);
Fluxo livre de pulso: se for pulsante, deve-se utilizar
amortecedores de pulso.
Devem gerar vazes apropriadas.
Repetitividade: permite eluio por gradiente e reciclagem de
solvente.
Bombas de Alta Presso

Tipos de Bombas de Alta Presso:
Bombas Mecnicas ou de Volume Constante:
Recprocas:
Pisto Simples e
Pisto Duplo.
Seringa.
Bombas Pneumticas ou de Presso Constante:

Com
intermedirio.
Bombas Recprocas
Representam 85% das bombas utilizadas em CLAE.

PISTO SIMPLES
Bombas Recprocas
PISTO DUPLO
Bombas Recprocas
Esquema de uma bomba recproca. A) Pisto simples. B) Pisto duplo.
Bombas Recprocas
Vantagens:
Vazo constante;
Altas presses;
Compatvel com eluio
por gradiente;
Reservatrio sem limite
de solvente
Alimentao
contnua
do sistema.
Desvantagens:
Pisto simples com

pulso decorrente do
movimento de ida e
volta
do
pisto
(problemas de bolhas);
Manuteno maior para
pisto duplo.
Amortecedores de Presso
Medidores de Presso
Tubos de
Bourdon
Transdutores de
Presso
Bombas Tipo Seringa
Funcionamento
de
maneira anloga a uma
seringa,
sendo
o
mbolo movido por um
motor.
Fluxo sem pulso.
Poucos
instrumentos
utilizam este tipo de
bomba
devido
s
vantagens das bombas
recprocas.
Micro-cromatografia.
Bomba Tipo Seringa

Vantagens:
Fluxo no tem pulso.

Muito utilizada em
micro-CLAE.
Gera altas presses.
Pouca Manuteno.
Desvantagens:
Reservatrio
com
volume limitado.
Possibilidades limitadas
de formar gradientes.
Necessidade
de
recarregar
constantemente
a
cmara de solvente.
Bombas Pneumticas
Lquido
deslocado
mediante
a
presso
exercida por um gs
inerte a alta presso.
Presso mxima est
limitada
pela
prpria
presso do gs e pelo
material de fabricao do
sistema.
PFM Pgs
A Pisto Menor
A Pisto Maior
Bombas Pneumticas
Vantagens:
Fluxo no tem pulso.

Gera presses muito
altas.
Desvantagens:
Reservatrio
volume limitado.
Custo elevado.
com
Utilizadas no enchimento das colunas cromatogrficas.
Programadores de Gradiente
Programadores a Baixa Presso
Programadores a Baixa Presso.
Vantagens:
Menor custo: utilizado

quando temos apenas uma
bomba de alta presso.
Maior nmero de solventes
(maior
variedade
de
gradiente).
Maior repetitividade das
vazes programadas.
Desvantagens:
Maior possibilidade
formao de bolhas.
Maior
volume
residncia.
de
de
Programadores a Alta Presso.
Programadores a Alta Presso.
Vantagens:
Ajustes
fino
gradiente devido
controle individual
solventes.
Desvantagens:
de
ao
de
Limitado
a
dois
solventes.
Maior
custo
(duas
bombas
de
alta
presso).
Menor repetitividade.
Medidores de Presso
Permeabilidade
da coluna
da FM
Tamanho de partcula
Dimenses da coluna
Viscosidade
Vazo e Presso
Funes:
Otimizar
as separaes;
Verificar avarias no sistema cromatogrfico.
Injetores
Vlvulas Manuais Rheodyne
Vantagens:
Grande
exatido
no
volume injetado.
Facilidade de injeo
(presso
atmosfrica,
temperatura ambiente).
Desvantagens:
Dificuldade de variao do
volume.
Alto custo.
Alargamento
do
pico
(volume morto dilui a
amostra na FM).
Injetores Manuais Rheodyne

Posio LOAD
Posio INJECT
Injetores Automticos
Eltricos ou por ar comprimido.
Vantagens:
Grande nmero de amostras

sem interveno do analista.
Programao
de
injeo
(durante a noite).
Permite
operaes
como
diluio,
derivatizao
ou
adio de reagentes.
Desvantagens:
Alto
custo
manuteno.
de
Injeo
Dissoluo da amostra em um solvente mais fraco

que a fase mvel.
Sempre se possvel dissolver a amostra na FASE MVEL ou

em algum solvente MAIS FRACO que a fase mvel. O efeito de
alargamento aumenta quanto mais forte o solvente da amostra
e quanto maior o volume de injeo.
Neste caso a fase forte

que acompanha a amostra
ao entrar na coluna arrasta
uma parte da amostra mais
rapidamente pela coluna
Sobrecarga de Volume da Amostra

Para aproveitar de todos o pratos que uma coluna possui, no se
deve injetar um volume maior que 1 % do volume da coluna vazia.
Vmximo (L) = (raio)2(comprimento)(0,01)

Dimenso da coluna
Vmximo de injeo
7,8 mm x 30 cm
140 L
3,9 mm x 30 cm
35 L
3,9 mm x 15 cm
18 L
4,6 mm x 10 cm
16 L
Filtrao da Amostra
Para no entupir o filtro de entrada da coluna e leitos

com partculas 4 m usar filtros descartveis de 0,45
m.
Para colunas com partculas menores de 4 m usar

filtros de 0,22 m.
Material de alta massa molar (>10000 15000) mostra

tendncia de adsoro irreversvel em recheios de
coluna de fase reversa, sujando o leito, causando
presso alta, mudana de k e RS.
Colunas Cromatogrficas
Limite de Fluxo:
Fluxos altos resultam em destruio do suporte do recheio

(velocidade = moagem), presso de trabalho alta e choques de
presso causando a degradao do leito e desgaste dos selos
da bomba e do injetor.
Limite de Presso:
Para uso contnuo:
base de slica : 3500-4000 psi.

base de Resina PS-DVB: 1500 psi (5-7 m = 1 mL min-1,
1020 m = 1,5-2 mL min-1).
Resina metacrilato: 800 psi, fluxo 0,5-0,8 mL min-1.
Colunas de resina de troca inica: ver o manual de cada coluna
Recheios esfricos mostram presses menores devido ao leito
mais uniforme e fornecem maiores eficincia.
Colunas Cromatogrficas
Colunas de Saturao
Tambm conhecidas como pr-colunas.
Localizada entre a bomba e o injetor.
FM
fica
saturada
pelo
lquido
estacionrio.
Possibilita a utilizao de FM agressivas.
Possibilita a utilizao de colunas de
slica em alta temperatura.
Localizada entre o injetor e a

coluna de separao.
Colunas de 2 a 5 cm e d.i. igual
ao da coluna de separao.
Mesma FE da coluna de
separao.
Protege
a
coluna
de
separao, aumentando seu
tempo de vida.
5 cm
Coluna de Guarda
Coluna de Separao
Materiais
colunas:
para
as
Ao
15 cm
inoxidvel 316
(crmio, molibidnio e
nquel).
Ao
revestido com
vidro.
Vidro reforado (CE,
preparativa).
Coluna de Separao
Dimenso da Coluna:
Preparativa
d.i. > 10 mm
Semi-preparativa
150 x 10 mm
Rpida
30-100 x 3-5 mm
Recheadas com partculas de 3 m
Vazo altas
Anlises de rotina
Convencional
150-60 x 2-5 mm
Normalmente partculas de 5 m
Microbore
d.i. 1 ou 2 mm
Capilar
d.i. 3 mm
Coluna de Separao
Como obter colunas de eficincia cada vez

maior?
Melhorar enchimento:
Acoplamento de colunas em sries:
maior eficincia, mas leva a um aumento de presso;
Diminuir o tamanho da partcula:
homogeneidade do leito;
Facilita transferncia de massa entre FM e FE;

Benefcio muito grande.
Uso de colunas de dimetro interno menor:
Enchimento mais uniforme e homogneo.
Coluna de Separao
Aparelho para coluna Microbore:
Diminuir a vazo;
Diminuir a cela do injetor;
Diminuir o volume morto do sistema;
Reduzir a cmara de mistura em eluio por gradiente.
Vantagens:
Alta eficincia.
Tempo de Anlise reduzido.
Economia de solvente;
Menor gasto de FE.
Pequena
quantidade
de
amostra.
Volume do pico eludo
pequeno.
Desvantagens:
Falta detector reprodutvel.

Baixa
repetitividade
na
injeo
de
volumes
reduzidos.
Baixa
repetitividade
de
vazes reduzidas.
Alto custo dos aparelhos.
Coluna de Separao
Geometria da coluna:
Qualquer estrangulamento leva a perda de eficincia:

colunas cromatogrficas devem ser retas.
Filtros:
Retm a FE e evitam mudanas na compactao da
coluna;
Discos de teflon ou ao inoxidvel;
Porosidade escolhida de acordo com o tamanho de
partcula;
Coluna de Separao
Enchimento de Colunas Cromatogrficas:

Seco
Tamanho de partcula 20 m.
Evitar vibrao mecnica (que leva a uma distribuio no
homognea da FE na coluna).
Suspenso
a Alta Presso
Utilizada para rechear colunas comerciais.

Tamanho de partcula < 20 m.
Evita distribuio irregular das partculas.
Evita a aglomerao das partculas.
Coluna de Separao
Enchimento utilizando Mtodo da Suspenso a Alta

Presso:
Reservatrio
do Solvente
Medidor
da Presso
do N2
Reservatrio
da
Suspenso
Coluna
Cromatogrfica
Medidor de
Presso do
Solvente
Vlvula de
Escape do
Solvente
Vlvula de entrada
de N2
Vlvula
de N2
Vlvula do
Solvente
Vlvula de Controle
da Presso do N2
Coluna de Separao
Tipos de Solvente de Suspenso:

Densidade
Balanceada:
tP 10 m.
Grande distribuio do tamanho das partculas.

Solvente
tem
densidade
prxima
da
hidrocarbonetos halogenados de alta densidade.
Tetrabromoetano, tetracloroetileno, diiodometano:

caros e geram haletos prejudiciais coluna.
Densidade
partcula:
No-balanceada:
Metanol, clorofrmio, acetona, tetrahidrofurano.
txicos,
Coluna de Separao
Tipos de Solvente de Suspenso:

Alta
Viscosidade:
Gigol, glicerina.
Baixa repetitividade.
Demorado.
Presses altas no enchimento das colunas.
Baixa
Viscosidade:
ter, pentano.
Enchimento rpido.
Coluna de Separao
Condicionamento da Coluna:
Necessrio
FM e da FE.
para que haja um perfeito equilbrio da
Coluna nova: 4 8 horas.

Coluna parada h alguns dias: 2 horas.
Coluna de uso dirio: 15 minutos.
Coluna deve ser guardada em solvente orgnico ou

Fase Mvel
Evitar gua ou tampo: formao de fungos e/ou
cristalizao do sal no leito cromatogrfico.
Coluna de Separao
Temperatura:
Vantagem: menor viscosidade da FM: maior velocidade de

transferncia de massa.
Aplicao: cromatografia de troca inica, cromatografia de

excluso. Deve ser testada em outras modalidades.
Desvantagens:
Pode degradar a amostra, a FE e a FM.

Diminui a repetitividade:
Mudana na composio da FM.

Pode levar a uma dminuio das molculas de gua sobre a slica
(cromatografia de adsoro).
Solubilidade da slica aumenta com a temperatura.

Formao e bolhas no sistema cromatogrfico.
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o

material eludo, gerando sinal quando da
passagem de substncias.
Idealmente:
cada substncia
separada aparece
como um PICO no
cromatograma.
Grfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA
Detectores - Classificao
Universais:
qualquer
Seletivos:
Geram sinais para

substncia eluda.
Detectam apenas substncias com

determinada propriedade fsicoqumica.
Especficos:
Detectam
substncias
que
possuam determinado elemento
ou grupo funcional em suas
estruturas.
Detectores Caractersticas
Rudo: a variao mais curta da linha de base de uma

linha reta causada pelas flutuaes dos sinais eltricos,
instabilidade da lmpada, flutuaes da temperatura.
Desvio: normalmente associado ao aquecimento do

detector na 1 hora
Quantidade Mnima Detectvel:

de um analito que gera um pico com
altura igual a trs vezes o sinal de rudo.
SINAL (S)
Massa
S
=3
N
RUDO (N)
Detector (sinal gerado,

rudo)
QMD = f
Largura do pico cromatogrfico
Limite de Deteco:
Quantidade
de analito que gera um pico com

razo S/N = 3 e wb = 1 unidade de tempo.
QMD
LD
wb
wb
Velocidade de Resposta:
Tempo decorrido entre a entrada do analito

na cela do detector e a gerao do sinal
eltrico.
SINAL
63,2% FSD
TEMPO
Constante de Tempo, :
tempo necessrio para o
sinal chegar a 63,2 % FSD
(full scale deflection =
fundo de escala) aps a
entrada de amostra
Sensibilidade
Relao entre o incremento de rea do pico

e o incremento de massa do analito.
Fator de
Resposta, S:
inclinao da
reta rea do pico
x Massa do
analito
REA
MASSA
Faixa Dinmica: a faixa de concentrao em que h
um sinal mensurvel para o analito, mesmo que no
seja linear.
Faixa Linear: a faixa de concentrao em que o sinal

proporcional concentrao.
O fim da zona de linearidade

pode ser detectado quando a
razo (Sinal / concentrao)
diverge em mais de 5 % da
inclinao da reta na regio
linear:
Sinal / Conc.
Faixa Linear
1,05 S
0,95 S
Concentrao
Detectores - Caractersticas
Detectores pticos
Absoro:
fixo.
Espectrofotomtrico: varivel.
Espectrofotomtrico por conjunto de fotodiodo.
Fotomtrico:
ndice de Refrao.
Fluorescncia.
Espalhamento de Luz.
Detectores: Absoro
Princpio:
Absoro
de luz ultravioleta ou visvel, por parte da

amostra,
quando
nela
passa
radiao
eletromagntica
Seletividade:
Amostra
deve ter absoro na faixa UV/Vis do

espectro eletromagntico.
excitao de eltrons de baixa energia como eltrons ou

eltrons no pareados de alguns grupos funcionais.
70 % de anlises publicadas utilizando HPLC foram

realizadas com detectores UV/Vis
Detectores: Absoro
Io
A log b c
I
Lei de Lambert-Beer
o fotodetector mede a
luz transmitida, I e o
sinal convertido uma
relao logartmica, A
que proporcional a
concentrao.
Absortividade
molar
()
Dependente
das
condies
cromatogrficas (solvente, pH e
temperatura) e comprimento de
onda.
Detector Fotomtrico
Lmpada
de Hg de
Baixa
Presso
= 254 nm
Detector Espectrofotomtrico
UV (deutrio):
190 350 nm
Visvel (tungstnio):
350 800 nm
Monocromador:
seleciona o
desejado do feixe
Detector Espectrofotomtrico por

Arranjo de Diodos
A luz emergente dispersada
por
uma grade hologrfica:
resultante focalizados sobre
fotodiodos
256 a 512 fotodiodos
Espectro UV dos compostos

Arranjo de Diodos

Arranjo de Diodos

Arranjo de Diodos

Arranjo de Diodos
Cela do Detector
Cubeta tipo Z
Cubeta tipo Cnica
Detectores ndice de Refrao
Princpio:
Seletividade:
Mede a diferena no ndice de refrao da FM e do eluente

vindo da coluna.
Detector universal.
Limitaes:
Controle rigoroso da temperatura;

Sensibilidade a variao na vazo;
Sensibilidade s mudanas na FM, impedindo o uso de eluio
por gradiente.
Detectores por Reflexo
Detectores por Reflexo

Alta
sensibilidade.
Necessidade de dois primas para cobrir a
faixa de ndices de refrao.
Lei de Fresnel
A quantidade de luz
refletida
e transmitida na
interface prisma de
vidro- lquido
proporcional ao ngulo
de
incidncia da luz e ao
Detectores por Deflexo:

A
deflexo sofrida pela luz proporcional a

diferena do ndice de refrao do lquido.
A cela tem os compartimentos da amostra e
referncia separados por um pedao de vidro.
Este detector menos sensvel variao
de temperatura, mas sensvel vibrao do
instrumento.
Detectores por Deteco
Detectores - Fluorescncia
Princpio:
Seletividade:
Excitao com luz produz uma emisso fluorescente.

Absoro luz em menores e emisso em maiores.
Seletivo para molculas que fluorescem, ou seja, sistemas

aromticos policclicos ou que contenham duplas ligaes
conjugadas mltiplas.
Sensibilidade:
A sensibilidade da fluorescncia 10-1000 vezes maior que do

detector UV para compostos que absorvam fortemente no UV.
Detectores - Fluorescncia
PRIMEIRO MONOCROMADOR:
deixa passar somente o
excitante.
SEGUNDO MONOCROMADOR:
elimina o excitante e deixa
passar o emitido pela amostra
Detectores - Eletroqumicos
Princpio:
Oxidao
ou reduo em potencial fixo

(polargrafo, amperomtrico, coulomtrico).
Eletrodo de trabalho:
Amperomtrico:
carbono
vitrificado, pasta de carbono ou
amalgama de ouro.
Coulomtrico: grafite poroso.
Detectores - Eletroqumicos
Resquisitos para FM:

Alta
pureza;
Deve ser condutora;
Cuidados de pH e fora inica.
Vantagens:
Alta Detectabilidade
(10-12 g):
Desvantagens:
Nvel de traos.
Baixo custo.
Alta seletividade.
Sensvel
mudana
de
temperatura, de vazo e de sinais
eltricos da rede.
Eletrodo de trabalho requer
limpeza frequente.
Detectores Espalhamento de Luz
Amostras no volteis e termicamente instveis.
Resposta do detector dada em funo da massa molar

do analito, e no de composio qumica ou presena de
grupos funcionais.
Curva analtica no linear: necessrio uma equao

quadrtica.
Vantagens:
Boa Detectabilidade
(5 ng).
Quase universal.
Desvantagens:
FM e qualquer modificador
devem ser volteis.
Vazo no deve exceder 1
mL min-1.
Detectores Espalhamento de Luz
Detector
Massas
Espectrmetro
de
Princpio:
A amostra fragmentada e ionizada em um padro

caracterstico da espcie qumica.
Espectrmetro de massas:
Introduo
da amostra;
Fonte de ionizao;
Analisador de massas;
Deteco de ons e
Aquisio / Processamento de dados.
Detector
Massas
Espectrmetro
de
Fontes de ionizao:
Local onde so produzidos os ons.
Impacto de eltrons.
Ionizao qumica.
Analisador e massas:
Local onde so analisados os ons produzidos de acordo com a

sua razo massa/carga.
Magnticos.
Eletrostticos.
Quadrupolos lineares.
Quadrupolos Ion Trap.
Tempo de vo.
Detector
Massas
Espectrmetro
de
Deteco dos ons:
realizada por meio de um tubo fotomultiplicador de

eltrons, que determina a intensidade do feixe de
eltrons.
Aquisio e processamento dos dados:

Usa
programas
computacionais
altamente
sofisticados para processar a grande quantidade de
dados gerados pelo EM.
Detector
Massas
Espectrmetro
de
Primeiros experimentos em LC-MS: 1972.

MS um detector universal para HPLC;
Alta sensibilidade (baixos limites de deteco);
Confirmao da presena do analito (massa
molar e informao estrutural);
Alta seletividade (possibilidade de anlise de
compostos com picos sobrepostos);
Pureza de picos.
Detector
Massas
Espectrmetro
de
Incompatibilidades fundamentais entre CLAE e EM:
Vazes altas usadas em HPLC, ~ 1 mL/min
O EM necessita de alto vcuo.
HPLC
usa fases mveis com aditivos no volteis, tais

como, tampes, reagentes par-inico, etc;
Ionizao
de compostos altamente polares, instveis

termicamente, inicos e de massa molar alta.
Detector
Massas
Espectrmetro
de
Interface CLAE EM:

Dispositivo
colocado entre o LC e o MS e serve para

remover o solvente e transferir a amostra para a fonte
de ons.
Tipos de interface:
Ionizao
Qumica Presso Atmosfrica;

Eletrospray;
Termospray;
Ionspray;
Feixe de Partculas.
Detector
Massas
Espectrmetro
de
Detector
Massas
Espectrmetro
Como o LC-API-ES-MS trabalha:
de
Detector Espectrmetro de
Massas
Processo de ionizao do Eletrospray:

Formao
do on e nebulizao.
Formao de gotas carregadas e dessolvatao.
Evaporao do on: a densidade da carga nas gotas
aumenta at atingir o limite de Raileigh, ento iniciam
as exploses Coulombicas e quebra em gostas
menores.
ons so emitidos das gotas.
Transporte
de ons para o analisador de massas.
Detector
Massas
Espectrmetro
de
Processo de ionizao do Eletrospray

Vantagens:
Ionizao mais suave que
existe hoje.
til para molculas grandes
com
mltiplas
cargas
(protenas e peptdeos).
Interface para CLAE_EM
mais sensvel que existe.
til para uma larga faixa de
polaridades.
Fcil
operao
e
manuteno.
Desvantagens:
A
composio da FM
influencia na ionizao.
Possvel
formao
de
adutos.
Menos til para analitos
apolares.
Vazes menores sou iguais
a 1 mL min-1.
Alguns mecanismos no
bem esclarecidos.
Detector Espectrmetro de
Massas
Fatores que afetam a ionizao do Eletrospray:

Extenso
da agulha de nebulizao e posio.

Parmetros de operao do EM.
Fluxo do gs de nebulizao e de secagem, presso e

temperatura (nitrognio).
Voltagem do capilar, corrente da cmara.
Solues
qumicas para obter uma boa ionizao:
pH do tampo e condutividade.
Composio do tampo (volatilidade).
Seleo de solvente.
Detector
Massas
Espectrmetro
Como o LC-APCI-MS trabalha:
de
Detector
Massas
Espectrmetro
de
Processo de ionizao do Ionizador Qumico a

Presso Atmosfrica:
Os
analitos so vaporizados e os solventes

nebulizados em uma regio (corona) entre uma
agulha e um capilar.
Nitrognio e molculas de solvente so ionizados por
eltrons de uma agulha (corona de descarga),
tornando-se ons reagentes (gs).
Os analitos so ionizados pelos ons reagentes (gs):
e- + N2 N2+ + 2 eN2+ + Solvente (Solvente H)+
(Solvente H)+ + Analito (Analito H)+
Detector Espectrmetro
Massas: Aplicaes
de
Indstrias farmacuticas: anlise quantitativa para o controle de

qualidade e inspeo de impurezas durante o desenvolvimento de
novas drogas.
Aplicaes ambientais: determinao de pesticidas.
Estudo fitoqumico (produtos naturais).
Anlise de polmeros.
Investigao de amostras biolgicas.
Flexibilidade para acoplar a outros mtodos de separao (CE,

CFSC ou CEC).
Detector Espectrmetro
Massas: Concluses
de
CLAE-EM est sendo largamente empregada no somente em laboratrios

acadmicos mas tambm na indstria, tanto em P&D quanto em anlises
de rotina.
CLAE-EM um equipamento robusto que est se tornando cada vez mais

acessvel.
CLAE-UV-EM oferece,
confirmao estrutural.
O equipamento , relativamente, de fcil operao e manuteno.
Permite a troca de interfaces sem a necessidade de desligar o sistema de

vcuo.
Para muitos tipos de amostras no possvel prever qual a melhor

interface.
alm
da
quantificao,
possibilidade
de
Fases Mveis
Funes:
Arrastar
os
componentes
da amostra
pela coluna e
Participar
processo
separao.
do
de
N ( 1) k
RS
4
1 k
k e : so determinados por condies
que afetam reteno e equilbrio de
distribuio da amostra entre fase mvel e
estacionria:
composio da fase mvel;
composio da fase estacionria;
temperatura
N: depende da qualidade da coluna; varia
com as condies instrumentais:
vazo da fase mvel; comprimento
da coluna; tamanho da partcula
Boa
Seletividade
Boa Fora
Cromatogrfica
Propriedades
Fsico-Qumicas
Adequadas
Solventes
Disponveis
Fases Mveis
Critrios para seleo de um solvente
para ser usado como FM.
Preparo de Fases Mveis
O correto preparar DIARIAMENTE a fase mvel.
No usando degasificador ou He, desgaseificar fase de 12 em 12 h.
Re-filtrar fase com tampo todos os dias (tendncia a haver precipitao).
Medir os componentes separadamente e depois misturar, antes da

filtrao. No juntar um componente com outro, avolumando para o volume
final.
Exemplo: Metanol:gua 20:80 quer dizer 200 mL de metanol misturados

com 800 mL de gua independente do volume final que resultar.
Fases Mveis
Propriedades das FM:

Pureza: grau cromatogrfico.
Dissolver a amostra sem decompla.
Requisitos
No dissolver ou decompor a FE.
Primrios
Ser compatvel com o detector
utilizado.
Ter baixa viscosidade e ponto de
ebulio
Ser disponvel comercialmente a
Requisitos
preos acessveis.
Secundrios
No ser txico ou inflamvel.
Fases Mveis
Impurezas na FM:
Diminuio da detectabilidade.
Pequenas flutuaes na linha de base (eluio isocrtica) ou
grandes flutuaes com presena de picos artefatos (eluio
por gradiente).
Pode obstruir as conexes.
gua para FM:
gua mono-destilada inadequada: principalmente para

gradiente.
gua deve ser grau HPLC tipo MilliQ.
Livre de bactrias: esterilizadas por membranas de 0,22 m.
Resistividade ~18 Mohm.
Teor de Orgnicos < 20 ppb para anlises normais.
Fases Mveis
Interaes intermoleculares do solvente com a

amostra:
Foras
de London:
Atrao das molculas da amostra pelas molculas da FM.

Quanto mais fcil a polarizabilidade maior a fora dispersiva.
Interao
Molcula da amostra e solvente j tem dipolo permanente.
Interao
dieltrica:
Amostra inica dissolvida em solventes de alta constante

dieltrica.
Ligaes
dipolo:
de Hidrognio:
Capacidade doadora de prtons do soluto e receptora do

solvente ou vice-versa.
Degasseificao das Fases Mveis
Finalidade:
Eliminar
gases dissolvidos na FM que podem ser

responsveis pela formao de bolhas na bomba e
no detector causando mal funcionamento de ambos.
Tambm necessria para impedir a reao do
oxignio com a FM, FM ou amostras oxidveis.
No deve alterar a composio da FM para que

se mantenha a reprodutibilidade das anlises.
Fora cromatogrfica
Mede a capacidade do solvente interagir com a amostra.
semelhante polaridade da FM.
Fora cromatogrfica adequada selecionada pela

anlise de k.
k pequeno muita interao da amostra com a FM.

k grande pouca interao da amostra com a FM.
Ideal: 1 k 10
2 componentes: 2 k 5
Mltiplos componentes: 0,5 k 20
Solventes fortes diminuem a reteno e solventes fracos

aumentam a reteno.
Fora cromatogrfica
Mtodo emprico para determinao da fora cromatogrfica. Compostos: 1 =

uracil, 2 = acetofenona, 3 = benzeno, 4 = tolueno, 5 = naftaleno. Coluna:
Spherisorb C8, tamanho de partcula 10 m. Condies cromatogrficas:
vazo: 0,8 mL min-1, volume de injeo: 10 L, deteco: UV, 254 nm.
Seletividade da Fase Mvel
Mede a separao entre dois picos.
Seleo da seletividade:
Tringulo
de Seletividade do Solvente.
Modelo dos Quatro Solventes.

Tringulo de seletividade do solvente:
Grupo
Solventes
ter aliftico, ter metil-butlico, tetrametilguamidina
II
lcoois alifticos, metanol
III
Derivados de piridina, tetrahidrofurano, amidas (exceto fomrmamida), ter

glicis, sulfxidos
IV
Glicis, lcool benzlico, cido actico, formamida
Diclorometano, cloreto de etileno
VI
a) Fosfato de tricesil, cetonas e steres alifticos, dioxanos, poliester

b) nitrilas, acetonitrilas, carbonato de propileno, sulfonatos
VII
Hidrocarbonetos aromticos, tolueno, nitrocompostos, teres aromticos,

hidrocarbonetos aromticos halossubistitudos.
VIII
Metacresol, gua, clorofrmio

Tringulo de seletividade do solvente:
CLFR:
Metanol (grupo II);

Acetonitrila (grupo VI);
Tetrahidrofurano (grupo III);
gua (controlador da fora cromatogrfica).
CLFN:
ter metil-t-butlico (grupo I);

Clorofrmio (grupo VIII);
Diclorometano (grupo V);
Hexano (controlador da fora cromatogrfica).

Modelo dos Quatro Solventes

Modelo dos Quatro Solventes
C = frao em volume do novo
solvente
B = frao em volume do
solvente inicial
SB
=
fator fora peso do
solvente da mistura inicial
SC = fator fora peso do novo
solvente
BSB
C
SC

Caractersticas dos Solventes em uma Mistura.
Solvente
Grupo de
Seletividade
Metanol
Acetonitrila
Tetrahidrofurano
gua
Clorofrmio
Diclorometano
ter metil t-butlico
ter etlico
Hexano
II
VI
II
VIII
V
I
I
-
Fator Peso de Fora

Fase Reversa*
Fase Normal
2,6
3,2
4,5
0
5,1
5,8
4,0
10,2
4,1
3,1
2,5
2,8
0
* Valores aproximados para alguns outros solventes so: acetona (3,4), dioxano (3,5),
etanol (3,6) e isopropanol (4,2).
Preparao da Fase Mvel
Eluio
o desenvolvimento
cromatogrfico.
Isocrtica:
da
amostra
no
sistema
Mesma fora cromatogrfica durante a eluio.
Gradiente:
Fora cromatogrfica varia durante a eluio.

Utilizado na separao de misturas complexas com diferentes
funes qumicas.
Vantagem: menor tempo de anlise menor alargamento do
pico.
Eluio
Tipos de eluio em CLAE: a) eluio isocrtica; b) e c) vrias formas de eluio

por gradiente. % B = % do solvente de fora cromatogrfica mais forte.
Eluio por Gradiente

Vantagens:
Menor tempo de anlise.
Maior detectabilidade dos
solutos.
Maior simetria dos picos.
Maior resoluo dos picos.
Desvantagens:
Menor reprodutibilidade.
Menor estabilidade da linha
de base.
Equipamentos adicionais.
Regenerao da coluna
cromatogrfica.
No compatvel com
todos os detectores (ndice
de
refrao,
condutividade).
Eluio por Gradiente
Os solventes usados para formar o gradiente devem ser:
Miscveis em todas as propores a serem corridas.

Preferivelmente de baixa viscosidade, mesmo quando
misturados.
De foras de eluio no muito semelhantes ou ser impossvel
efetuar uma mudana de k no picos da amostra.
Compatveis com o detector e comprimento de onda a serem
usados.
Apropriados para a dissoluo total da amostra pelo menos at
o fim do programa.
Total e rigorosamente degasseificados, especialmente para
sistema de misturas sob baixa presso.
De mais lata pureza possvel (grau HPLC).
Eluio por Gradiente
Eluio por gradiente torna-se necessria

na:
Separao
de componentes com valores de

fator de reteno bastante diferenciados.
Separao de macromolculas tipo protenas,
polmeros, principalmente quando FR
utilizada.
Amostra contm interferentes que eluem
tardiamente da coluna.
Eluio por Gradiente
Separao de uma mistura de cidos carboxlicos aromticos por cromatografia de

troca inica.
a)Separao isocrtica com nitrato de sdio 0,055 mol L-1 em fase mvel aquosa;
b)Eluio gradiente com nitrato de sdio variando de 0,01 a 0,10 mol L-1.
Eluio por Gradiente
Separao de uma srie homloga

de dialquilftalatos por CLAE fase
reversa.
Amostras C2 (dimetil, n 1) a C10 (din-pentil, n 9).
Coluna 25 x 0,46 cm, FE C8, 5 m.
FM acetonitrila(B) gua. Vazo 2
mL min-1, 60 C.
Eluio por Gradiente
Amostras com amostras que demoram a eluir so bons candidatos para eluio
gradiente.
a) Anlise da droga EP em extrato de plasma por CLAE fase reversa e eluio
isocrtica.
b) Anlise de antraquinona em extrato de madeira por CLAE fase reversa e
eluio gradiente.
Partculas
Rigidez
Rgidas:
resistem a alta presso sem sofrer deformao.

Slica, alumina.
Vantagens:
Aplicaes:
Colunas estveis;
Colunas de alta eficincia.
CLS
Suporte (CLL, CLFL. CTI, CFQ, CE)
Semi-rgidas
Presso limite de 35 MPa (algumas <15 MPa).

Estiremo entrecruzado com divinilbenzeno.
Aplicaes:
CE.
CTI.
Partculas
Estrutura:
Porosa
Microporosas (4 a 10 m)
Vantagens:
Colunas de alta eficincia, devido rapidez de
transferncia de massa.
Alta velocidade de anlise, devido aos poros pequenos.
Alta capacidade de aceitao da amostra (Asuperficial grande).
Desvantagens:
Dificuldade no enchimento.
Custo elevado.
Aplicaes:
CL analtica (alta eficincia).
CL preparativa (grande capacidade de aceitao de
amostra).
Partculas
Estrutura:
Porosas
Macroporosas (> 10 m)
Vantagens:
Facilidade de enchimento.
Alta capacidade de aceitao da amostra.
Baixo custo.
Desvantagens:
Baixa eficincia (poros so mais fundos, menor velocidade
de transferncia de massa).
Maior tempo de anlise.
Aplicao:
CL preparativa.
Partculas
Estrutura:
No Porosas
Termo C (transferncia de massa) pequeno.

Vantagens:
Desvantagens:
Alta eficincia.
Vazes altas sem perda de eficincia.
Anlises mais rpidas.
Baixa capacidade de aceitao da amostra (~50 x < que em
recheios porosos).
Requer equipamentos com baixo volume morto.
Aplicao:
Separao rpida de biopolmeros.
Partculas
Estrutura:
Peculiares
Partculas de 30 45 m, com ncleo slido e uma camada

superficial de 1 3 m porosa.
Vantagem:
Desvantagens:
Boa eficincia.
Facilidade de recheio.
Anlises rpidas.
Baixa capacidade de aceitao da amostra.
Alto custo.
Aplicao:
CL analtica.
Partculas
Estrutura:
Micropeculiares
1,5 a 2,5 m.
Separao rpida de macromolculas.
Perfuso
Dois tipos de poros:
Perfuso (interconectados): 400 800 nm.

Difuso: 30 100 nm.
~20 m.
Poliestirenodivinilbenzeno altamente entrecruzado.
Aplicao:
Isolamento preparativo de macromolculas;

Separao rpida de biopolmeros;
FR;
CTI;
CB.
Partculas
Estrutura:
d)
difuso
perfuso
Tipos de partculas para a

CLAE: a) partculas porosas;
b) partculas peliculares; c)
micropartculas peliculares;
d) partculas de perfuso.
Partculas
Tamanho:
Influencia no processo de difuso das molculas de soluto e FM

nos poros. Quanto maior a partcula, menor a velocidade de
transferncia de massa, menor a eficincia e mais lenta a anlise.
Forma:
Regulares ou Esfricas
Irregulares
Enchimento mais uniforme.

Maior eficincia.
Cantos podem quebrar levando distribuio de tamanhos.
Monoltica
Estrutura nica tridimensional em forma de haste:
Macroporos: 2 m
Mesoporos: 13 nm.
Processo sol-gel usando tetraetxisilano e surfactante apropriado.

Anlises muito rpidas.
Cromatografia Lquido Slido
FE slida:
Slica
(94%);
Alumina (3%);
Florisil (2%) e
Carvo ativado (1%).
FM:
solventes
apolares.
mais
Aplicao:
Solutos com diferentes grupos funcionais:
Ordem de eluio:
1.
2.
3.
Apolares
Polares cidos
Polares bsicos
Ismeros estruturais:
Ordem de eluio (impedimento estreo):

1.
2.
3.
Orto
Meta
Para
Alumina:
bsica ( pH 12)].
rea superficial 70 -90 m 2 g-1.
Grupo ativo: Al3+ ou O2-.
Intervalo de pH: 2 < pH < 12.
Superfcie
Slica:
cida ( pH 5)].
rea superficial 100 -500 m 2 g-1.
Grupo ativo: silanol (Si-OH)
Intervalo de pH: 2 < pH < 8.
Superfcie
Slica
Ligao de
Hidrognio
Silanis
Vicinais
H
O
Si
Si
H
O
Si
Si
Si
Si
Silanis
Geminais
HO
O
Ligao
Siloxano
OH
Si
Si
Silanol
Isolado
OH
O
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Slica
Vantagens:
Desvantagens:
Estabilidade mecnica altas

presses;
Estabilidade
solventes;
qumica
pH > 8: dissoluo da slica.
Disponibilidade comercial de
suas partculas em vrios
tamanhos, formas e graus de
porosidade;
pH < 2: hidrlise das

ligaes
siloxano
(Si-O-Si).
Possibilidade de modificao
da sua superfcie (grupos
silanis Si-OH).
Estabilidade hidroltica limitada:
Interao dos
compostos bsicos.
silanis
com
Superfcie com tipos de silanis.
Presena de impurezas metlicas.
Solubilidade
(ppm)
Slica
pH
Solubilidade de Slica-Gel em gua
Slica
Acidez dos diferentes grupos silanis:

Acidez
Silanis isolados
Silanis geminais
Silanis vicinais
OH
M+
Metal na superfcie
da slica
Si
M+
Metal na estrutura
da slica
Ativam a
acidez
dos
silanis
prximos.
Slica:
Identificao dos silanis:
RMN 29Si com polarizao cruzada e rotao segundo ngulo mgico.

Espectroscopia no IV por reflectncia difusa com transformada de
Fourier.
Mtodos para minimizar a influncia negativa dos grupos silanis no

desempenho cromatogrfico e na resistncia da slica em meios
cidos ou bsicos:
Tratamentos especficos para a slica:
Purificao;
Ativao;
Sntese;
Tratamento para a sntese das FQL:
Imobilizao;
Capeamento;
encapsulamento;
Etc.
Slica
Hidroxilao da slica:
Si
Si
O
Si
OH
Mximo = 8 mol m-2
O
Si
OH
(quantidade mxima de
silanis na superfcie da
slica)
Slica
Tipo A:
Mais velha;
Mais cida;
Menos pura;
Utilizada na separao de compostos neutros e no ionizveis.
Tipo B:
Mais nova;
Menos cida;
Mais pura;
Utilizada na separao de compostos inicos e ionizveis,
principalmente compostos bsicos.
Slica
Comparao entre colunas com suporte de slica tipo A e tipo B na separao de

antidepressivos tricclicos.
Colunas 15 x 0,46 cm, FM: 30% acetonitrila 70% tampo fosfato 0,025 mol L-1,
pH 2,5 + 0,2% de trietilamina e cido trifluoroactico. Vazo 1,0 ml min01, 40 C.
Deteco: 254 nm. Volume de injeo 5 L.
Slica
Envelhecimento
e compresso
para obter o
tamanho
desejado
Preparao de
slica irregular:
processo solgel.
Silicato de Sdio
Precipitado (hidrogel)
Lavagem
Aquecimento a 120 C
Xerogel Poroso
Triturao e peneirao
Slica Irregular
Dissolver em
soluo cida e
condies
controladas
Slica
H
3 camada: gua fisicamente adsorvida.

Perda ocorre a temperatura ambiente.
O
H
H
2 camada: gua fracamente adsorvida.

Perda ocorre a 100 C.
O
H
1 camada: gua fortemente ligada.

O
Si
Processo
reversvel
Perda total a 120 C.
Perda total a 70 C.
gua fisicamente
adsorvida.
Perda total a 650 C.

Grupos silanis perdem gua para gerar
ligaes siloxano.
Perda total a 1100 a 1200 C.
gua ligada por

ligaes de H.
Processo
reversvel
Processo
irreversvel
Cromatografia Lquido Lquido
FE:
Suporte
+
Lquido estacionrio
Mecanicamente sorvido pelo suporte por foras de Van der

Waals.
FM:
Solvente
o mais imiscvel possvel no lquido

estacionrio.
Suporte Cromatogrfico
O material utilizado deve:
Ter o mximo de grupos ativos em sua superfcie:
Ter grande rea superficial:
Para evitar mecanismos duplos de reteno;
Alta fora mecnica:
Aumenta a capacidade de aceitao da amostra;
Inrcia qumica:
Para facilitar a adsoro do lquido estacionrio;
Para s altas presses utilizadas;
Ser poroso.
Os materiais mais utilizados so:
Slica, alumina, titnia, zircnia, slica recoberta com metais,

carbono grafitizado, vidro de porosidade controlada, poliestireno
divinilbenzeno, etc.
Lquido Estacionrio
Antigamente:
FE de baixa massa molar
Era arrastada pela FM.

FN: gua, etilenodiamina.
FR: cianoetilsilicone.
Hoje: Polissiloxanos, polibutadienos, poliacrilatos.
Vantagens:
Facilidade de preparao.
Maior recobrimento do suporte
Maior
capacidade
de
aceitao da amostra
Mecanismo nico de reteno.
Maior
repetitividade
dos
parmetros cromatogrficos
Grande seletividade.
Desvantagens:
Baixa estabilidade:
Lquido
estacionrio
arrastado pela FM.
Limitao na escolha da FM,

vazo e temperatura.
No compatvel com eluio
por gradiente.
Cromatografia Lquida de Fase

Quimicamente Ligada
FE:
Suporte
+
Lquido estacionrio
Vantagens:
Alta estabilidade qumica.

Liberdade de escolha da FM,
vazo e temperatura.
Reao
Qumica
Desvantagens:
Eluio por gradiente.
Processo
de
preparao
muito trabalhoso.
Menor
recobrimento
da
superfcie (apenas 50% dos
silanis)
Impedimento estreo.
Mecanismo
duplo
reteno.
Restrio ao pH: 2< pH < 8.
de
Cromatografia Lquida de Fase

Quimicamente Ligada
Preparao das FE:

Hidroxilao
Aumentar o nmero de grupos silanis.
Ativao
da slica:
Eliminar gua fisicamente adsorvida.
Reao
da slica:
qumica do suporte com a FE lquida:
Ligao tipo ster: instabilidade hidroltica.

Ligao tipo Si-N: instabilidade hidroltica.
Ligao tipo Si-C: reagentes caros.
Ligao siloxano.
Reao Siloxano FE Monomrica
Superfcie da Slica
CH3
OH
OH
OH
Agente sililante
mono-funcional
CH3
X
Si
OH CH3
CH3
OH
Si
CH3
CH3
OH
Si
OH CH3
R = C8, C18
X = Cl, OR
Si
CH3
Reao Siloxano FE Monomrica
Superfcie
da Slica
Agente sililante
bi- ou trifuncional
X
OH
OH
Si
O
O
Si
Cl
R
X
R = C8, C18
X = Cl, OR
Ausncia de gua!
HCl
Superfcie
da Slica
Reao Siloxano FE Polimrica

OH
OH
X
X
Si
Si
R
X
H2O
O
O
Si
Agente
sililante bi- ou
trifuncional
O
O
Si
Excesso de
Reagente
R
O
O
Si
R
OH
CLAE Fase Reversa

Vantagens:
Fases Mveis menos txicas e de

menor custo: modificador orgnico
+ gua.
Boa estabilidade frente aos vrios
solventes.
Rpido equilbrio aps a troca do
solvente.
Compatvel com gradiente.
Anlises rpidas.
Vasto campo de aplicao.
Desvantagens:
Silanis Residuais:
Mecanismo
duplo
de
reteno.
Problema na separao de
compostos bsicos.
Intervalo de pH: 2<pH<8
Devido ao uso da slica.
CLAE Fase Reversa

Reteno em CLAE-FR
Tamanho
da cadeia:
Quanto maior o tamanho da cadeia, maior o fator de

reteno.
rea
superficial.
Quantidade da FE lquida sobre o suporte (densidade
de camada).
Tipo de suporte.
CLAE Fase Reversa
C2
C8
C18
Estabilidade da Coluna
Fatores que influenciam na estabilidade:
Tipo de fase ligada:
Suporte de slica:
Quanto maior a cadeia alquila, maior a estabilidade da coluna;

FE monomricas estericamente protegidas so mais estveis
que as com CH3.
FE polimricas so mais estveis que as monomricas.
Slica tipo B mais estvel que a tipo A.
Fase Mvel:
pH;
Composio;
Tampo.
Estabilidade da Coluna
Diagramas das possveis conformaes das cadeias orgnicas hidrofbicas do

tipo C18 quimicamente ligadas superfcie da slica:
a) Estendida quando solvatada por uma fase mvel adequada e
b) O colapso das cadeias orgnicas na presena de uma fase mvel composta
quase 100% de gua.
Reduo de Silanis Residuais
Capeamento
Reao da FE com reagentes menos volumosos como o

TMCS (clorotrimetilsilano) ou HMDS (hexametildisilazano).
FE Estericamente Protegidas
Hidrlise da ligao
SiOSi de fases
estacionrias
quimicamente
ligadas:
a) FQL no protegida
b) FQL estericamente
protegida.
a)
b)
Reduo de Silanis Residuais
Encapsulao
Recobrir o suporte com TMCS antes de preparar a FE.
Polimerizao
Novas Fases Estacionrias
Escopo da CLAE
Modos de CLAE
Fase Normal
Sistema no qual a FE mais polar do que a
FM.
Fases estacionrias
Adsorventes porosos, como slica ou alumina
Fases quimicamente ligadas:
grupos polares como ciano [-(CH2)3CN], diol [(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OH] so quimicamente
ligados slica
Modos de CLAE
Fase Reversa
Sistema no qual a FE mais apolar do que a
FM.
Modo cromatogrfico mais usado.
Fases estacionrias
Fases quimicamente ligadas: grupos alquil como CH3,
-C4H9, -C8H17 e C18H37, grupo fenil (-C6H5) so
quimicamente ligados slica.
Fases estacionrias imobilizadas: polmeros recobertos
em suportes slidos.
Polmeros porosos entrecruzados
Modos de CLAE
Troca Inica
Espcies so separadas baseadas na diferena em
carga eltrica.
Trocadores catinicos
Trocadores aninicos
-SO3- (forte), -CO2- (fraco)
-NR3+ (forte), -NH2R+ (fraco)
Fases estacionrias
Resinas polimricas: poliestireno entrecruzado com
divinilbenzeno, a qual so ligados grupos inicos.
Fases estacionrias quimicamente ligadas: slicas
funcionalizadas
Modos de CLAE
Excluso de Tamanho
Separao de misturas complexas
atravs da diferena na massa
molar, ou seja, tamanho efetivo
das molculas.
Fases estacionrias
Hidroflicas: polidextranas,
silica gel, poliacrilamida,
poliagaroses
Hidrofbicas: copolmero
estireno-divinilbenzeno
Modos de CLAE
Bioafinidade
Isolamento seletivo de
macromolculas biolgicas, atravs
da utilizao das propriedades
dessas substncias de unirem-se a
ligantes especficos.
Fases estacionrias
Ligantes especficos covalentemente
ligados um suporte.
Suportes: Agarose, matriz de celulose,
matriz de dextrano, de poliacrilamida,
partculas porosas de alumina.
Ligantes: Anticorpos, inibidores
enzimticos, protenas
Modos de CLAE
Quiral
Separao de
enantimeros.
Mtodos de separao
Indireto:
amostra + reagente quiral
Direto:
FE aquiral + aditivos quirais na fase mvel
FE quirais ( ex: ciclodextrinas, polmeros quirais, albumina de
soro bovino)
Amostras Inicas
Mistura contendo compostos orgnicos ionizveis ou ionizados.
Soluto inico:
Molcula orgnica contendo grupos que podem se comportar como cido

ou base no intervalo de pH usado.
HAc
H+ + Ac-
pH = 7 cido forte (totalmente ionizado)

3 < pH < 7 cido fraco (parcialmente ionizado)
pH < 3 soluto neutro (no dissociado)
Mtodos CLAE:
Supresso Inica
Par Inico
Troca Inica
CLAE - FR
Supresso Inica
Separa compostos inicos pela reduo da sua ionizao
em soluo atravs do controle de pH.
Reteno:
HA
H+ + A-
+ hidrofbico
+ hidroflico
>k
<k
B + H+
+ hidrofbico
>k
BH+
+ hidroflico
<k
Supresso Inica
Para cidos:
Usar cido actico, cido fosfrico, tampo acetato ou

fosfato: ajustar o pH para 2 5.
Para bases:
Usar hidrxido de amnio, trietilamina (0,1%),

dibutilamina ou fosfatos alcalinos: ajustar o pH para 7
8.
Par Inico
FE:
Fase
reversa.
FM:
Modificador
orgnico + gua (ajuste de pH)

Reagente Par Inico (RPI)
Par Inico
Soluto
FM
Soluto+ + RPI-
[Soluto-RPI]Par Inico
Soluto
FM
Soluto- + RPI+
[Soluto-RPI]Par Inico
Aplicao em Cincias Farmacuticas

Joshi, S., J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 28(2002)795.
Antibiticos:
So os mais importantes compostos bioativos e quimioterpicos

produzidos por sntese microbiolgica.
Grande variedade de estruturas:
Penicilinas;
Cefaloporinas;
Macroldeos;
Tetraciclinas;
Aminoglicosdeos;
Quinolonas;
Refampicinas;
Etc...
Anlise de antibiticos em
amostras formuladas e no
formuladas requer mtodos
rpidos
e
altamente
especficos, uma vez que a
maioria dos antibiticos tem
problemas
srios
de
estabilidade.
Mtodos de Anlise de Antibiticos

Comumente Usados
Determinaes Microbiolgicas:
Podem
determinar a droga pai juntamente com o seu

metablito ativo.
Empregam microorganismos que so bastante
sensveis a determinadas drogas e, frequentemente,
falta especificidade quando comparado aos mtodos
cromatogrficos.
Determinaes Radioimuno:
Apresentam
a desvantagem, em aplicaes clnicas e

biomdicas, da no versatilidade em anlises de rotina.

Comumente Usados
Mtodos Cromatogrficos:
Cromatografia Gasosa (CG)
Rpidos e especficos;
Requerem temperaturas de operao elevadas
que podem ocasionar degradao trmica de
antibiticos no derivatizados.
Necessitam frequentemente de derivatizao para
aumentar a volatilidade e o desempenho
cromatogrfico.
So
inaplicveis na anlise de substncias
altamente polares ou de alta massa molar.

Comumente Usados
Cromatografia
Lquida de Alta Eficincia
(CLAE)
Tem
alto
poder
de
resoluo
sendo
importantssima na separao e purificao de
antibiticos.
Analisa compostos volteis e no volteis, podem
determinar pequenas quantidades (ultra-traos) at
separaes em escala preparativa.
Primeiras separaes: troca-inica.
Atualmente: CLAE-FR.

Comumente Usados
Separao de penicilina e antibiticos correlatos por CLAE.
Nome do
composto
Benzil penicilina
Amoxicilina
Ampicilina e
probenecida
Fase
Estacionria
Fase Mvel
0,5 M Tampo fosfato a pH 3,5

C18
/MeOH/H2O (1:3:6, solvente A; 1:5:4,
solvente B; A:B, 7:3)
50 mM KH2PO4 contendo 45% de tampo
Lichrosorb RPC18
KOH a pH 5/MeCN (24:1)
1% cido ortoforsfrico (760 mL) e MeOH
C18 Lichrosorb
(240 mL)

Comumente Usados
Separao de cefaloporinas por CLAE.
Nome do
composto
Fase
Estacionria
Fase Mvel
Spherisorb C18
10 mM tampo KH2PO4/MeCN/MeOH
(45:40:1) com pH ajustado a 4,5 com
H3PO4
Anlise de produtos
de degradao de
carbanepema
Prodigy ODS2
5 mM brometo de hexadeciltrimetil
amnio em THF/MeCN/25 M tampo
fosfato de amnia pH 5 (1:4:5)
Cefaclor, cefalexina,
isoniazida,
minociclina e
pirazinamida
ODS Silica
25 mM hidrogenossulfato de
tetrabutilamnio/MeCN/MeOH (48:1:1)
Cefalexina

Comumente Usados
Separao de tetraciclinas por CLAE.
Nome do
composto
Antibiticos de
tetraciclina e seus
principais
contaminantes
Tetraciclina e seus
principais produtos
de degradao
Fase
Estacionria
Fase Mvel
Bondapak C18
0,05 M tampo KH2PO4 a pH 2,5/MeCN

(21:2)
Chromspher C8
MeCN/0,01 M cido oxlico a pH 2
Minociclina,
tetraciclina e
clorotetraciclina Kromasil ODS C18
como complexos de
alumnio
10 % MeCN aquoso contendo 25 mM

sulfato de ltio. pH ajustado a 2,9 com
H2SO4

Comumente Usados
Separao de quinolonas por CLAE.
Nome do
composto
Fase
Estacionria
Fase Mvel
Ciprofloxacina,
norfloxacina,
ofloxacina e cido
pipemdico
Lichrospher 100
RP-18
Vrias misturas de 100 mM hidrxido de

tetrabutilamnio em MeCN/H2O (93:7) e
25 mM H3PO4 em MeCN/H2O (93:7)
Sarafloxacina
Bondapak C18
50% MeCn aquoso/MeOH/2 mMH3PO4

ajustado a pH 3,5 com trietilamina

Comumente Usados
Separao de aminoglicosdeos por CLAE.
Nome do
composto
Sulfato de
gentamicina
Fase
Estacionria
Fase Mvel
Bondapak C18
5,5 g sulfonato de sdio heptano

monohidratado dissolvido em
MeOH/H2O/cido actico anidro (14:5:1)
Separao de sulfonamidas por CLAE.

Nome do
composto
Sulfadiazina,
sulfametoxazole e
trimetoprima
Fase
Estacionria
Fase Mvel
YWG-C18H37
Tampo fosfato (100 mL, 50 mM Kh2PO4

e 2 mL 50 mM trietilamina com pH
ajustado a 5,9 com H3PO4)/MeOH (4:1)

Comumente Usados
Separao de maacroldeos por CLAE.
Nome do
composto
Fase
Estacionria
Fase Mvel
MeCN/acetato de amnio 0,1 M a pH 7,2 (3:2)

Aaetilespiramicina Hypersil ODS
2metil-1-propanol/MeCN/0,2 M tampo fosfato
Eritromicina
PLRP-S
pH 11/H2O (33:6:10:151)
Roxitromicina
Estolato de
eritromicina
Eritromicina
Kromasil C18 MeCN/MeOH/0,5% acetato de amnio (5:3:3)

20mM acetato de amnio a pH 6,7/ MeCN
Nova-Pak C18
(2:3)
Xterra RP C18
2-metil-2-propanol/2-propanol/0,2 M tampo
carbonato de amnio/H2O (1,5:1,5:1:16) e 2metil-2-propanol/MeCN/ 0,2 M tampo
carbonato de amnio/H2O (15:3:5:77)
Anlise Enantiomrica de Disopiramida e MonoN-Desalquildisopiramida em Fluidos Biolgicos

Renato Bortocan e Pierina S. Bonato
Mtodo CLAE
Cromatogramas referentes s amostras

de plasma do voluntrio com dose nica
de 100 mg de disopiramida.
a)Branco de plasma.
b) amostra coletada 5 horas aps a
administrao do frmaco.
1. (+)-(S)-DP;
2. (-)-(R)-DP;
3. e 4. enantimeros de
metopropolol;
5. (+)-(S)-MND;
6. (-)-(R)-MND.
Condies cromatogrficas:
Coluna: Chiralpak AD;
Fase Mvel: Hexano-etanol (91:9, v/v)
adicionada de 0,1% de DEA;
Vazo: 1,2 mL min-1
= 270 nm.
Mtodo CLAE

de urina do voluntrio com dose nica de
100 mg de disopiramida.
a)Branco de urina.
1. (+)-(S)-DP;
2. (-)-(R)-DP;
3. e 4. enantimeros de
metopropolol;
5. (+)-(S)-MND;
6. (-)-(R)-MND.
Coluna: Chiralpak AD;
Vazo: 1,2 mL min-1
= 270 nm.
Anlise Enantiosseletiva de Atenolol em

Fluidos Biolgicos e Formulaes
Maria Helena Iha e Pierina S. Bonato
Estrutura Qumica do AT
Mtodo CLAE

de plama do voluntrio com dose nica
de 50 mg de AT, aps ELL.
a)Branco de plasma.
1. 2. enantimeros do PI;
3. (+)-(R)-AT;
4. (-)-(S)-AT.
Coluna: Chiralcel OD-H;
Vazo: 1 mL min-1
ex = 235 nm e em = 300 nm.
Mtodo CLAE

de plama do voluntrio com dose nica
de 50 mg de AT, aps ELL.
a)Branco de plasma.
1. 2. enantimeros do PI;
3. (+)-(R)-AT;
4. (-)-(S)-AT.
Coluna: Chiralcel OD-H;
Vazo: 1 mL min-1
ex = 235 nm e em = 300 nm.
Mtodo CLAE
Separao da Mistura de Neue

C.R. Silva, C. Airoldi, I.C.S.F. Jardim, J. Chromatogr. A, 987 (2003) 127
H
N
OH
O
CH3
OCH2CHCH2NH2CH
CH3
NH
O
HO
3-Butil parabeno
2-Propranolol
1-Uracil
C-O-(CH2)3CH3
O
O-CH2CH2CH2CH3
O-CH2CH2CH2CH3
O
6-Acenafteno
5-Naftaleno
4-Ftalato de dibutila
CH3
HCCH2CH2
7-Amitriptilina
NH
CH3
Separao em uma Fase Comercial

com Considervel Teor de Impurezas
Separao da mistura teste de Neue na coluna de 150 x 3,9 mm, recheada

com a fase comercial Rainin C18. Condies: fase mvel metanol-tampo
KH2PO4/K2HPO4 pH 7,0 (65:35 v/v) 20 mmol L-1, vazo: 0,8 ml min-1, deteco:
UV em 254 nm e volume de injeo: 5 l.
Novas Fases do Tipo C18 com Grupos

Polares Embutidos
CH3
H
Si
OH
CH3
CH3
Si
CH3
OH
O
NH
Si
OH
H
CH3
CH3
OH
NH
NH
O
O
CH3
CH3
Fases com grupos do tipo carbamato
Fases do tipo amida

O
R
O
Si
OH
R
R
H O
Si
O
OH
NH
R
CH3
R = -CH3
NH
Fases com grupos do tipo uria
ou
C H
CH3
Fases C18 com Grupos do Tipo Uria

Embutidos
Grau de recobrimento :
C18 diisopropil uria: 1,9 mol m-2
C18 dimetil uria: 3,3 mol m-2
Separao da mistura teste de

Neue nas colunas de 50 x 3,9 mm,
recheadas com as fases C18
dimetil
e
diisopropil
uria.
Condies: fase mvel metanoltampo KH2PO4/K2HPO4 (65:35
v/v) a 20 mmol L-1, vazo tima:
0,8 mL min-1, deteco: UV em
254 nm e volume de injeo: 5 L
Por que realizar separaes de alguns

frmacos bsicos em meio levemente
cido?
O-
OH
O
Si
OH
H3C
Si
O-
NH CH
3
O Si
O Si
OH
OH
O Si
O Si
H 3C
NH CH
3
Fase mvel em 6<pH<8
Fase mvel em pH <3

Tempo / min
Tempo / min
Alargamento de pico em meio neutro durante uma separao

cromatogrfica envolvendo a superfcie de uma fase do tipo C 8 ou
C18 e um frmaco bsico, neste caso a amitriptilina.
Outra alternativa: Separaes de alguns

frmacos bsicos em meio bsico
-
O
O
Si
-
H3C
N CH
3
Desvantagem:
O Si
A baixa estabilidade
qumica da coluna em
pH maior que 10.
OO Si
Fase mvel em 9 >pH < 10

Tempo / min
Comportamento cromatogrfico da amitriptilina durante a separao

cromatogrfica em meio bsico nas fases do tipo C8 ou C18
Troubleshooting
No desprezar as causas mais simples como rede eltrica,

estabilizador de voltagem, chaves gerais e tomadas de todos os
mdulos.
Verificar as conexes eltricas entre os mdulos, especialmente

detectores e dispositivos de registro e integrao.
BOMBA:
Verificar a chegada livre da fase mvel at a entrada da bomba

(torneira);
Aprender a observar e interpretar a leitura de presso de trabalho do
sistema, a qual um bom indicador de uma srie de problemas;
Conhecer os rudos normais de funcionamento do seu sistema;
Verificar movimento dos indicadores de pisto;
Certificar visualmente se h fluxo constante na vlvula de referncia
ou na sada da bomba.
Troubleshooting
Inspecionar o sistema todo para vazamentos encostando um

pedao de papel escuro absorvente (papel pH) em todas as
conexes hidrulicas.
Conferir se as tubulaes entre os mdulos so do dimetro interno

correto, isto especialmente se o sistema tem sido usado por outra
pessoa ou passado um tempo sem uso.
DETECTOR:
Verificar visualmente o fluxo de fase mvel na sada correta;
Aprender a usar alguns dos comandos diagnsticos mais simples do
detector como: absorvncia, voltagens e horas de uso da lmpada,
offset da fase mvel, energia das clulas (amostra e referncia).
Troubleshooting
FASE MVEL:
Existindo dvida, re-filtrar, re-desgaseificar, ou preparar novamente a fase mvel
usando outro lote, outra marca ou outra garrafa;
Certificar se o pH da fase permanece no valor correto;
gua sempre o componente mais suspeito.
Quando h suspeita de contaminao no hesitar em trocar vidraria,

ampolas,vials, agulhas, e especialmente seringas a fim de eliminar as
possveis fontes.
Se tiver mais do que um sistema de HPLC a simples substituio de um

mdulo para outro pode s vezes revelar na hora a fonte do problema!
Para trabalhar com HPLC o operador necessita de muita pacincia!! Tomar

um rumo errado baseado numa concluso precipitada a receita certa para
um desastre!
Bibliografia
LLOYD R. SNYDER, JOSEPH J. KIRKLAND, JOSEPH L. GLAJCH, Practical HPLC

Method Development, 2 ed., John Wiley & Sons.
CAROL H. COLLINS, GILBERTO L. BRAGA, PIERINA S. BONATO (coordenadores),

Introduo Metodos Cromatogrficos, Editora da Unicamp.
ANDREA WESTON, PHYLLIS R. BROWN, HPLC and CE Principles and Practice,

Academic Press.
JAMES M. MILLER, Chromatography: Concepts and Contrasts, John Wiley & Sons.
UWE D. NEUE, HPLC Columns Theory, Technology, and Practice, John Wiley &
Sons.
C. F. POOLE, S. K. POOLE, Chromatography Today, Elsevier Science.
D. A. SKOOG, F. J. HOLLER, T. A. NIEMAN, Principles of Instrumental Analysis, 5

ed. Saunders College Publishing.
Peridicos
Journal of Chromatography A
Journal of Chromatography B
Journal of Liquid Chromatography & Related Techniques
Analytical Chemistry
Chromatographia
Trends in Analytical Chemistry
Journal of Separation Science

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - Completo

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Cromatografia Lquida

Trata do desenvolvimento de metodologias

Anlise qumica a aplicao de

mudana de pH, precipitao.

centrifugao, destilao, sublimao,

equilbrio entre duas fases

equilbrio entre fase lquida e

Extrao com Fludo Supercrtico:

Destilao: equilbrio entre fase lquida e vapor.

equilbrio entre ons em soluo e slido

Dilise: gradiente de concentrao.

Eletroforese: gradiente de potencial eltrico.

Difuso trmica: gradiente de temperatura.

Centrifugao: gradiente de densidade.

Classificao por Fases

Slido Sublimao ESFSC

A separao pode ser parcial ou completa,

Avaliao de um Mtodo de Separao.

a base da separao cromatogrfica.

Resultado das diferentes interaes do

CGL CGS CGQ CGFL CSS CSFL

CLL CLS CE CLQ CTI CLFL CB

Desenvolvimento: Anlise Frontal

Amostra tambm a FM.

Amostra aplicada uma

Orientao de Keenson: dipolo-dipolo interaes entre

de van der Waals:

M > 106 g mol-1

Vc = volume da coluna vazia

Cada estgio de equilbrio

KC = Constante de Distribuio (Partio)

Isotermas Langmuir: FE saturada pela amostra

Molculas da amostra associam-se e o

TF = Fator de cauda do pico a

Ideal: 1,0 a 1,2

Picos mais largos e

Equao de van Deemter

Velocidade Linear da FM,

Equao de van Deemter

Para minimizar o termo A necessrio usar colunas com dimetros internos

Equao de van Deemter

Equao de van Deemter

Transferncia de Massa da FM Estagnada

Mtodos de Integrao de Picos

Clculo da normalizao da rea corrigida.

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Mtodos de integrao dos sinais fornecidos pelo registrador:

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Determinao da altura de picos com linha de base irregular.

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Pico fornece informaes Qualitativas e Quantitativas

Qualitativa: O tempo de reteno de um componente sempre

Dimenses da coluna cromatogrfica;

Um pico pode ser identificado injetando a substncia relevante e

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Quantitativas: tanto a rea quanto a altura do pico so

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