Tcnicas espectroscpicas de anlisis

Se basan en medir la cantidad de radiacin

absorbida o emitida por las especies atmicas o
moleculares que se analizan.
La espectroscopa es la ciencia que estudia las
interacciones entre la radiacin y la materia.
Los mtodos y tcnicas se clasifican de acuerdo a
la regin del espectro electromagnticos que se
utiliza para la medicin.

Las radiaciones electromagnticas se describen en

trminos de energa, frecuencia y longitud de onda
Energa de un fotn = h
h= Constante de Plank
= Frecuencia (s-1)
C= = velocidad de la luz
Sustituyendo en la ecuacin de la energa

E= hC/
Cul es la relacin energa vs longitud de onda?
Las unidades ms comunmente usadas para la longitud de onda:
m= 10-6 m
nm= 10-9 m
= 10-10 m

Espectro electromagnetico
Tipo

Longitud de onda

Interaccion

< 10 nm

Emision Nuclear

Rayos X

< 10 nm

Ionizacion atomica

Ultravioleta

10-380 nm

Transicion electronica

Visible

380-800 nm

Transicion electronica

Infrarrojo

800 nm 100m

Interaccion de los
enlaces

Radio

metros

Absorcion nuclear

Tcnicas basadas en la transicin electrnica

Absorcin: La energa es absorbida por un tomo, in o
molcula para pasar de un estado fundamental a un estado
excitado.
Emisin: la energa absorbida es liberada por el tomo, in
o molcula volviendo al estado fundamental.

ESPECTRO VISIBLE

ABSORCIN ATMICA
Espectro de lnea de hidrgeno
Aun los tomos mas simples
presentan espectros de lineas
complejos debido a las principales
transiciones electrnicas en los
orbitales s, p,d,f.

Bandas espectrales

Es dificil distinguir cada una de las transiciones con un

equipo de espectrofotometria UV
Las moleculas no solamente presentan interacciones
electronicas, vibracionales y rotacionales en los subniveles.
Interacciones con otras molculas y con el solvente tambien
producen efectos que resultan en una banda espectral.

Ejemplo de un espectro de absorcin molecular

Desde el ultravioleta hasta el infrarrojo por

medio de una corrida a diferente longitudes de
onda se puede producir un espectro molecular

INFORMACIN DEL ESPECTRO

Se mide a la longitud de onda de mxima absorbancia, que se
selecciona una vez que se hace un barrido en un rango de
longitudes de onda.
La informacin mas importante en un espectro es la longitud
de onda en la cual se produce la maxima absorcion.
En el punto de maxima absorcin se produce las mayor
sensibilidad y el mas bajo lmite de deteccin. Es importante
reducir los errores en la medida

Cmo se obtiene un espectro de absorcin?

Es un mismo equipo se puede obtener un espectro para la
regin ultraviooleta/visible, pero se requiere un segundo
equipo para la regin infrarrojo.

UV/visible: Transicin electrnica

IR: interacciones entre los enlaces
Los espectros varan dependiendo de la molcula, de all
su importancia para los anlisis cualitativos. Aunque en
el IR, los anlisis cualitativos dan mejor informacin.

Errores en las medidas de la absorbancia

a diferentes longitudes de onda
Absorbancia
Error
Pequeo

Error
mayor
Variaciones identicas en
las longitudes de ondas
Longitud de onda (nm)

ANALISIS CUALITATIVOS Y
CUANTITATIVO

A travs del espectro es posible identificar una substancia

(Analisis cualitativo).
Para el analisis cuantitativo se toma en cuenta la ley de
Beer-Lambert
Esta ley establece que la cantidad de luz absorbida por
una solucin es una funcin exponencial de la
concentracin y la longitud de la trayectoria de la luz en
la solucin.

ANALISIS CUANTITATIVO
P
Es una medida de la luz que pasa a traves de la solucion - transmitida
P
0
P
La relacion
tambien es llamada transmitancia (T)
P
0
- log T A
A Absorbancia
A abC

La transmitancia es la medida que da el equipo.

La absorbancia es una relacin exponencial negativa de
la transmitancia.

Anlisis cuantitativo

Donde:
P: Intensidad de la radiacin energtica
N: Nmero de especies que absorben
durante el paso de la energa
K: Constante de proporcionalidad

Anlisis cuantitativo

Anlisis cuantitativo
N: Nmero de especies absorbentes
Depende tanto de la concentracin
como de la longitud de trayectoria
KN = kbC

Resumen de la ecuacin

Absorbancia

Desviaciones de la Ley de Beer

lo
a
v
r
e l
t
In nea
li

La mayora de las especies

que absorben dan respuestas
lineales en un cierto intervalo.

Las desviacionesvan a ser

producidas por factores
fsicos
qumicos
instrumentales

Concentracin

Factores que afectan la Ley de Beer

Efectos en el coeficiente de absorcion
Factores quimicos: afectan el coeficiente de
absorcion. Un factor que afecta son los estados
qumicos reversibles
Factores fisicos
Alteracion del indice de refraccin, se aconseja
trabajar con soluciones diluidas
La temperatura

Factores instrumentales: evitar el uso de filtros

como monocromadores

Factores que afectan la Ley de Beer

Efectos en la trayectoria de la radiacin
Falta de limpieza de la celda
Burbujas de gases
Variaciones bruscas de temperatura

Cuales serian las precauciones?

Factores que afectan la Ley de Beer

Efectos en la trayectoria de la radiacion
Falta de limpieza de la celda
Burbujas de gases
Variaciones bruscas de temperatura

Cuales serian las precauciones?

Errores en la medidas de la absorbancia

Menor C mayor%T
Menor %T mayor C

Concentracion

Error relativo

Error relativo vs %Transmitancia

Se ha demostrado que trabajar en un rango de 80-20%T se

minimizan los errores en las medidas

Errores de una calibracin inadecuada

Determinaciones cuantitativas
La absortividad de una solucin depende de la naturaleza
qumica de la especie a analizar, debe ser conocida o
determinada por medio de estndares
Las medidas entre lo conocido y los desconocido deben ser
proporcionales, asumiendo que el rango de medicin es lineal.

Ejemplos
Calcule la absorbancia de una solucin que tiene un 78%
de transmitancia a 400 nm.
Una solucin coloreada con una concentracin de 0,49
mg/l tiene una absorbancia de 0,30 a 530 nm en una cubeta
de 2 cm, calcule el coeficiente de absorcin
Una solucin de Co(H2O)2+ tiene una absorbancia de 0,20 a
530 nm en una cubeta de 1 cm. La absortividad molar
tiene un valor de 10,0 l.mol-1.cm-1. Calcule su concentracin
en g.l-1

Ejemplo usando estndares

La absorbancia de una muestra problema de MnO4- es de 0,500 a
525 nm. En las mismas condiciones fueron medidas las
absorbancias a las siguientes soluciones de MnO4-, dando los
siguientes resultados:
Concentracin Absorbancia
(mol/l)
0,5 x 10-4

0,101

1,0 x 10-4

0,200

2,0 x 10-4

0,398

3,0 x 10-4

0,585

Determine la concentracin de la muestra

Representacin esquematica de
un espectrofotometro ultravioleta
visible

Componentes de un espectrofotometro
UV-VIS
Un espectrofotometro UV-VIS que
tambin es un detector para HPLC
tiene cinco componentes
principales:
La fuente de radiacion
Un selector de longitud de onda
Un recipiente para muestras (celdas o
cubetas)
Un detector
Un registrador de seal

Fuentes de radiacin
La fuente de radiacin puede ser:
Una lampara de hidrgeno o de deuterio
para las medidas en el ultravioleta y
Una lmpara de tungsteno para las
medidas en la regin visible.
La fuente de radiacin debe suministrar
suficiente energa radiante por encima de
la regin de la longitud onda donde la
absorcin es medida
La intensidad debe ser constante durante
el intervalo de tiempo en el cual las
medidas son hechas.

Selector de longitudes de ondas

Es
importante
que
los
espectrofotmetros UV-Vis tenga la
capacidad de distinguir entre las
bandas
discretas
de
radiacin
efectivamente. Esto es hecho a travs
de un selector de longitud de onda.
Los dos principales selectores de
longitudes de onda son los filtros y
los monocromadores

Monocromadores
Los monocromadores consisten de:
Una pequea ventana de entrada de la luz que
estrecha las amplitudes de las bandas de
radiacin
Un colimador que hace la radiacin paralela
Una red o un prisma que dispersa las
radiaciones no necesitadas.
Una ventana de salida que aisla la longitud de
onda deseada a partir del prisma o de la red de
difraccin.

Prisma

Selector de longitud de onda

usando
la difraccion de la luz

Monocromador con una Red de difraccin

Usos de lentes en espectrofotometria

Selectores de longitudes de ondas

El ngulo de dispersin de un prisma algunas veces
no es lineal y es sensitivo a cambios de
temperatura.
Redes de difraccin son vidrios con surcos
estrechos recubiertos con aluminio para crear una
fuente reflectiva. Estas redes eliminan la dispersin
no lineal y no son sensitivos a la temperatura.

Las celdas o cubetas

Las cubetas o celdas que contiene las muestras a
ser analizadas, que debe tener lados paralelos que
son perfectamente perpendiculares a la fuente de la
radiacion.
Las cubetas usadas en un espectrofotometro UV-VIS
generalmente tiene una longitud de trayectoria de 1
cm.
Las cubetas puede ser elaboradas de varios
materiales: silica fundida, cuarzo y plastico.
Las cubetas de cuarzo son transparentes al
ultravioleta y a la radiacion visible y por lo tanto son
las mas usadas en espectrofotometria ultravioletavisible.

El detector UV
El detector cambia la radiacion
transmitida a una corriente o voltaje que
seria leida en un registrador de seal.
Los detectores comumente usados para
elementos simples son:
Los fotodiodos de estado slido, tubos
fotoemisivos y fotomultiplicadores
Los detectores de arreglos de diodos
son usados como detectores de
multielementos.

Detectores en el detector UV
La luz pasa del monocromador, a la muestra de interes y luego alcanza al detector.
Los detectores en los espectrofotometros UV/Vis vienen en una variedad de forma y tamanos:

Los tubos fotomultiplicadores son los ms comunes. Ellos proveen una buena
sensibilidad en el rango espectral y altamente sensitivos a niveles bajos de luz

Los fotodiodos son generalmente hechos de un semiconductor y un capacitor para darle

carga al semiconductor. A medidad que la luz golpea al semiconductor, los electrones
fluyen a traves de esto,por lo tanto baja la carga del capacitor. De esta manera, la intensidad
de la luz de la muestra es proporcional a la cantidad de carga necesitada para recargar la
capacitor a intervalos predeterminado.
Como opuesto a tener simples fotodiodos, algunos espectrofotometros tienen arreglos de
fotodiodos, arreglados en un cristal de silicon. La ventaja de un arreglo de diodos (diode
array) es la abilidad de las lecturas lado por lado que incrementa la velocidad de lectura.

Detector de arreglos de diodos

Razones que hacen el uso del

espectrofotometro UV una tcnica
til para los analisis quimicos:
Tiene un nivel de sensibilidad alto,
concentraciones menos que 10 -7
mol.l-1 pueden ser detectadas. Este
aspecto es util para el analisis de
trazas y microanalisis.
El detector UV es rpido, exacto,
relativamente no costoso y los
resultados son mas facilmente
interpretados.

Fotmetro de doble haz

Celda de
Blanco

Espectrofotmetro de doble haz

Cuales moleculas pueden ser analizadas?

Todas las moleculas con doble y triple enlaces pueden
ser analizadas usando spectrofotometria UV-Vis.
La intensidad de absorcion de energia de una
molecula es proporcional al numero de cromoforos o
de dobles enlaces que contiene.
Los espectros UV-Vis son usados por comparacion con
informacion de estandars para identificar la base de
la estructura quimica.
Aunque la espectroscopia UV-Vis es limitada en la
cantidad de informacion que esta suministra es muy
util para el analisis de biomoleculas tales como AND,
ARN, proteinas que aborben energia radiante en la
region UV-Vis.

Espectrofotmetro UV-VIS-NIR
UV-3600 (Shimazu)

Referencia

003AP54481000

Longitud de Onda

190 - 1100 nm

Ancho de banda

2 nm

Seleccin de longitud de
Exactitud
onda

1 nm

Reproducibilidad

5 nm (con correccin automtica d

2 nm
longitud
de onda)

Sistema fotomtrico

Haz simple

Exactitud fotomtrica

Luz difusa

0.002 Abs (0-0.5 Abs)

0.004 Abs (0.5-1.0 Abs)
0.3%T (0-100%T)
0.001 Abs (0-0.5 Abs)
0.002 Abs (0.5-1.0 Abs)
0.15 %T (0-100%T)
< 0.3%T (220nm)

Lnea base

0.004Abs

Estabilidad

< 0.002A/30 min

Alimentacin

110-220V

Reproducibilidad
fotomtrica

Determinacion simultanea de dos

substancias