LP 9: Diagnostic de laborator in viroze

respiratorii. Izolarea virusurilor gripale

pe oul de gaina embrionat. Reactia de
hemaglutinare. Identificarea virusurilor
gripale. Reactia de
hemaglutinoinhibare.

Diagnostic in infectia cu virusuri gripale

ORTHOMIXOVIRUSURI-V. GRIPALE A, B, C
myxa-mucus
HA - hemaglutinina
NA - neuraminidaza
Nucleocapsida helicoidala
ARNss
anvelopa
transcriptaza

Matrice
tip A, B, C : NP, M
subtipuri: HA si NA 16 tipuri de HA si 9 de NA

Diagnostic clinic de gripa

febra (3-5 zile), mialgie, cefalee, astenie
(>2 saptamani), tuse uscata, faringita,
rinoree.
Gripa nu se diagnosticheaza clinic.
Simptomatologie asemanatoare cu infectii determinate de:

Mycoplasma pneumoniae, adenovirusuri,

virusul respirator sincitial, rhinovirusuri,
virusuri paragripale, si Legionella spp.

ETIOLOGIE
POSIBILA

Produs
Patolo
gic

IZOLARE

V. GRIPALE A, B, C
SNF
ANF
ATB

OGE
Culturi
celulare

Dg. DIRECT
=detectie
directa

Dg. INDIRECT
=serologie

DA
PCR si IF

DA
studii epidemoiologice

Produse patologice :
a) spalatura nazo faringiana se obtine cu
ajutorul unor tampoane cu coada (sterile)
introduse in cornetul nazal inferior.
b) aspiratul nazofaringian se obtine
folosind un speculum nazal prin administrarea a 3
ml ser fiziologic in nari cu o seringa atasata la un
tub de plastic.
c) lavaj traheobronsic se obtine prin
bronhoscopie in conditii speciale de catre
personal calificat
Sputa recoltata n urma tusei, lichidul
veziculelor din mucoasa bucal sau materialul
recoltat postmortem (plamn) nu sunt indicate
n diagnosticul virozelor respiratorii.

Spalatura nazo faringiana(SNF)

Recoltare.
tampoane sterile cu coada introduse in cornetul nazal inferior,
secretii de la nivelul peretelui posterior al nazofarinxului.
tampon prin cavitatea bucala pentru secretii de pe peretele
posterior al faringelui si din orice arie adiacenta cu inflamatie,
exudat sau ulceratie.
se evita atingerea tamponului de limba, obraji sau buze pentru
evitarea cotaminarii.
Stocare si transport.
optim imediat dupa recoltare (cand nu este posibil: -70 C, cu
transport pe zapada carbonica)
Prelucrare.
tamponul sau secretiile aspirate sunt dispuse intr-un tub steril cu
circa 15 ml mediu de transport minim o ora, timp necesar
elutiei virusului. centrifugare la 2500 - 15 minute, la 4 C.
Supernatantul este indepartat si sedimentul este
resuspendat in 3-4 ml TFS sau mediu de cultura. In final
depozitul de celule reluat in TFS serveste pentru izolare
virala sau pentru efectuarea de frotiuri ce vor fi testate in
imunofluorescenta cu intraga baterie de seruri antivirale
disponibile.

Risc de laborator asociat manevrarii de

produse patologice supuse diagnosticului in
vederea izolarii virusurilor gripale

Virusurile gripale sunt prezente in

tractul respirator in concentratii
ridicate si pot usor disemina din
exudate, spalaturi nazofaringiene si
aspirate traheobronsice la personalul
care manipuleaza aceste probe
clinice prin intermediul aerosolilor.
Culturile de celule infectate sunt si
ele sursa de infectie si diseminare a
virusurilor.

Diagnostic de laborator in gripa

Directii de diagnostic

IZOLARE+IDENTIFICARE
OGE, RHA+ RHAI

DETECTIE DIRECTA PCR si IF

DIAGNOSTIC SEROLOGIC

Izolare virala. -

examenul optim pentru diag. gripei

1.-pe culturi primare de rinichi de

maimuta rhesus.
-pe linia continua epiteliala de
rinichi de ciine = MDCK - MadinDarby Canine Kidney.
2. pe ou de gaina embrionat,de 9-11
zile, inoculat intraamniotic sau
intraalantoidian.

Hemadsorbtie
demonstreaza izolarea v.gripale
pe culturi de celule
Virusurile gripale nu sunt
citopatogene.
La 48 ore dupa
inocularea v. gripal se
incearca detectia
virusului prin
hemadsorbtie, obisnuit
cu eritrocite de cobai la
4 C.
Hemadsorbtia rezulta
din incorporarea in
membrana plasmatica
celulara a HA virale.
Hematiile adsorbite
specific rozeteaza la
periferia celulelor
infectate.

Izolarea
pe OGE

Izolarea se dem prin proprietatea v. gripale

de a aglutina hematii

DEMONSTRAREA PREZENTEI
VIRUSULUI
REACTIA DE HEMAGLUTINARE
Etape:
ag. viral dilutii binare
suspensie de hematii
Se incubeaza la temperatura camerei
Se citesc rezultatele in 60 minute
Martorul reactiei contine suspensie hematii
Rol RHA:
Demonstrarea prezentei virusului hemaglutinant
Titrarea antigenului hemaglutinant inaintea reactiei de hemagutinoinhibare

UHA

IDENTIFICAREA V. GRIPALE
R. HEMAGLUTINO-INHIBARE

Tehnica reactiei:
dilutii binare din serul testat
o cantitate constanta de ag. viral hemaglutinant
Se lasa la incubat 30 min la 37C.
Se adauga sistemul indicator = suspensia de hematii.
Se incubeaza 60 min la temperatura camerei.

Reactia de identificare a virusurilor gripale

UHAI

Reactia deHEMAGLUTINARE si
HEMAGLUTINO-INHIBARE

NAT (nucleic acid tests)

RT PCR

Quick Diagnosis of Flu Strains Possible with New Micr

ochip Test
(National Institute of Allergy and Infectious
Diseases)- FluChip,
Inexpensive Test Detects influenza Infections Quickly
and Accurately
(National Institute of Allergy and Infectious
Diseases) MChip

Swine flu real-time PCR kit (PrimerDesign

Ltd - UK) , The real-time PCR kit - rapidly
multiplying a sample taken from a
suspected swine flu patient. This test
quickly differentiates common strains of the
flu virus from other H1N1.

FDA Approves New Laboratory Test To Detect Human I

nfections With Avian Influenza A/H5 Viruses
(Food and Drug Administration)

Detectia directa dg. rapid

imunofluorescenta

Se realizeaza prin imunofluorescenta directa pe celule

epiteliale din tractul respirator.
Etape: recoltare p.p.- dispunere extemporanee pe lama

fixarea p.p. cu acetona 10 minute la -20 C.

incubarea serului de referinta (contine anticorpi
monoclonali marcati cu fluorocromi) 30 , 37 C
spalarea cu TFS
citirea la microscopul dotat cu lampa de u.v.

Au fost introduse si teste comerciale ELISA care

detecteaza prezenta antigenelor virusurilor
gripale de tip A.

Diagnosticul serologic
Necesita recoltarea de probe de ser pereche de
la acelasi pacient.
Nu se practica in mod curent decit in caz de
epidemii, pentru diagnostic retrospectiv.
Diagnosticul necesita demonstrarea unei cresteri
semnificative (de peste 4 ori) a titrului Ac
specifici antivirali intre proba de faza acuta,
recoltata la o saptamana de la debutul bolii si cea
din convalescenta, recoltata 2-3 saptamani mai
tarziu.
Metoda preferata de evidentiere a anticorpilor
anti virali specifici este hemaglutinoinhibarea.

DIAGNOSTIC SEROLOGIC = Tulpini de referinta + ser pacient

HA - hemaglutinina
NA - neuraminidaza
Nucleocapsida
helicoidala
ARNss
anvelopa
transcriptaza
Matrice