Protein As

CONTENIDO DE
PROTENAS
EN LOS ALIMENTOS
Mtodos de anlisis del contenido

protenas en alimentos
La
determinacin de la CANTIDAD DE
PROTENA de un alimento no es sencilla y el
valor obtenido en cada caso depende del
MTODO utilizado.
Muchos
ensayos dependen de la PRESENCIA

DE UNA DETERMINADA CADENA LATERAL
AMINOACDICA (Lowry, Biuret).
lo
se
resultados analticos
ve
condicionados
por la
proporcin
s
r
aminocido en cuestin en las protenas
n
sometidas al ensayo y necesitarn ser
referidos a alguna protena estndar. del
Otro
mtodos se basan en la determinacin

de NITRGENO TOTAL
del
contenido
s
(Kjeldahl).

Existen
numerosas fuentes de NITRGENO

NO PROTEICO que pueden interferir en
algunos mtodos de anlisis:
libres,
pptidos
cidos
s pequeos,
fosfolpidos, aminoazcares, nucleicos,
algunas vitaminas, alcaloides, cido
porfirina,
rico, urea, iones amonio, etc.
aminocido
Otras
fuentes de interferencia pueden ser

los otros macronutrientes presentes en los
alimentos como hidratos de carbono y lpidos.

Los mtodos mas comnmente empleados son:
Kjeldahl
Kjeldahl/Bethelot
Biuret
Lowry
Absorbancia a 280 nm
Fijacin de colorantes
Turbidimtrico

Estos mtodos se fundamentan en:
determinaciones de nitrgeno
enlaces peptdicos
aminocidos aromticos
absortividad UV de las protenas
grupos amino libres
propiedades de dispersin de la luz
capacidad de adhesin de colorantes
Mtodo de Kjeldahl
Es
un mtodo oficial descrito en mltiples

normativas: AOAC, ISO, Farmacopeas
y distintas Directivas Comunitarias.
Se basa en los siguientes supuestos:

la proporcin de nitrgeno no protenico
en un producto alimenticio es demasiado
pequea para ser significativa,
un
determinacin del contenido de

a
nitrgeno
total (refleja con suficiente
precisin el contenido de protena del
alimento,
la
proporcin que representa el nitrgeno

en la mayor parte de las protenas
alimenticias es de 16%.
Mtodo de Kjeldahl
FUNDAMENTO
Involucra
la
conversin del nitrgeno

presente a sulfato de amonio por
DIGESTIN, DESTRUCCIN OXIDATIVA O
MINERALIZACIN con cido sulfrico.
Posteriorment
el sulfato de amonio se
descompone
por
ALCALINIZACIN
con
e
hidrxidode
sodio
y
del
amonaco liberado
DESTILACIN
captndolo en una solucin
cida.
Finalmente
del
amonaco.
se realiza una VALORACIN
Mtodo de Kjeldahl
El cido sulfrico
LA MATERIA
OXIDA
ORGNICA y
se combina con el amonio
formado.
Los elementos carbono e hidrgeno se
convierten en dixido de carbono y agua.
Durante
digestin se libera el nitrgeno

proteico
para formar iones de amonio.
la
Est
determinacin
incluye
todo
el
nitrgeno
reducido presente (-NH2 y =NH),
a
de modo que los compuestos amoniacales,
urea y aminocidos libres son
tambin valorados.
El
uso de perlas de vidrio sirve de ncleo

para la formacin de burbujas.
Mtodo de Kjeldahl
ECUACIONES
Digestin:
n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores
CO2 + (NH4)2SO4 + SO2
Neutralizacin y destilacin
(NH4)2SO4 + 2
NaOH
NH3 + H3BO3
2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O

NH4+ + H2 BO3-
Titulacin
H2BO3- + H+
H3BO3
Mtodo de Kjeldahl
UN POCO DE HISTORIA
En 1883
el
dans Johann
Kjeldahl
investigador
desarroll el
bsicodel
proceso
conocido mtodo actual
de anlisis
protenas por el mtodo Kjeldahl,
de
propiamente,
ms
para
analizar
nitrgeno
orgnico.
El
mtodo original fue

algunas modificaciones.
Wilforth
Gunning
(1889)
Arnold
Winkler
sufriendo
(1885)
luego
Mtodo de Kjeldahl
UN POCO DE HISTORIA
En
el mtodo original la digestin

se efectuaba con una mezcla de cido
anhdrido
la oxidacin
se
sulfrico y fosfrico
y completaba
la
adicin de
mediante
permanganato
de potasio.
La
modificaciones del mtodo

resultado
ms tiles emplean:
s
xido
que han
de mercurio como catalizador

de oxidacin (Wilfoth).
K2SO4 para aumentar el punto de
ebullicin del cido sulfrico (Gunning).
CuSO4 tambin como catalizador de
oxidacin (Arnold).
Mtodo de Kjeldahl
UN POCO DE HISTORIA
Los catalizadores permiten acortar el tiempo
de digestin y
como transportadores de
actan O2.
Cuando
se usa Hg como catalizador, ste debe

ser precipitado mediante el agregado de tiosulfato
de sodio para liberar el NH3.
Otra modificacin ampliamente aceptada es la
introducida en la etapa de destilacin propuesta
por Winkler:
originalmente se utilizaba cido sulfrico

valorado para captar el amonaco,
titulando posteriormente
NaOH valorado.
su
exceso
con
Mtodo de Kjeldahl
UN POCO DE HISTORIA
La
en:
modificacin consiste
recibir
NH3 sobre una solucin de
cido
el brico,
valorarlo directamente
con
solucin valorada de H2SO4
(Winkler) o HCl.
Ventajas:
la solucin de cido brico no necesita

ser exactamente medida, eliminando los errores
en la medicin del cido valorado en el colector y
H
o HCl.
por
parte slo se requiere una solucin
2SO4otra
valorada
Mtodo de Kjeldahl
ESQUEMTICAMENTE
Mtodo de Kjeldahl
ESQUEMTICAMENTE
Mtodo de Kjeldahl
UNIDADES DE DIGESTIN Y DESTILACIN
Mtodo de Kjeldahl
ALGUNOS EQUIPOS
Lo
equipos mas modernosvienencon

de
EXTRACCIN
sistema
s
NEUTRALIZACIN DE GASES:
un
Y
una
Scrubber que bloquea el
unidad neutraliza
las
paso
y
condensaciones
cidas,
una
bomba de recirculacin de agua que

proporciona un gran caudal de vaco para
la aspiracin de los gases.
Mtodo de Kjeldahl
UNIDADES DE DIGESTIN, SCRUBBER Y BOMBA
Mtodo de Kjeldahl
DESTILADORES
Mtodo de Kjeldahl
DESTILADORES Y TITULADORES
Mtodo de Kjeldahl
VENTAJAS DEL MTODO
Apropiado
para
varios
de productos.
Alta confiabilidad.
Usado como mtodo
tipos
de referencia.
DESVENTAJAS DEL MTODO
Interfieren
proteicos.
compuestos nitrogenados no
Uso de catalizadores txicos o caros.

Eleccin del factor de conversin.
Mtodo de Kjeldahl
FACTOR DE CONVERSIN
contenido porcentual promedio de N en
las protenas de diversos alimentos es de
16%.
El
El
factor para convertir N en protenas

sera entonces 100/16 = 6,25.
Este
factor general de conversin no es sin

embargo exacto, ya que las protenas de
origen animal contienen generalmente menos
nitrgeno y las de origen vegetal ms.
As, el factor de conversin para
la es 5,7 y para la
protena
del
de
productos
lcteos es 6,38.
trigo
Mtodo de Kjeldahl
FACTOR DE CONVERSIN
Actualmente
se conoce el contenido de N,
y por lo tanto el factor apropiado, de una
gran cantidad de productos agrcolas.
Debido
a la confusin que podra derivarse

del hecho de utilizar el factor general de
conversin 6,25 o el especfico para la
protena en estudio
Es
necesario aclarar siempre en los

informes el factor de conversin utilizado
para el clculo de protenas.
Mtodo de Kjeldahl
FACTOR DE CONVERSIN
Mtodo de Kjeldahl
ECUACIONES
Digestin:
n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores
CO2 + (NH4)2SO4 + SO2
Neutralizacin y destilacin
(NH4)2SO4 + 2
NaOH
NH3 + H3BO3
2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O

NH4+ + H2 BO3-
Titulacin
H2BO3- + H+
H3BO3
Mtodo de Kjeldahl
CLCULOS
%N = V x N x 14 x
100 1000
p
%N = V x N x 0,014 x 100
p
V: mL de cido
N: normalidad del cido P:
gramos de muestra
0,014: equivalente volumtrico
del
N
Mtodo de Kjeldahl
Mtodo de Kjeldahl/Berthelot
Este mtodo combina la digestin
del mtodo de Kjeldahl con la
reaccin colorimtrica de Bethelot.
hmeda
Al producto de la digestin se le reduce la

acidez, lleva a volumen final
y luego
somete una a la
se
alcuota
reaccin
colorimtrica.
El NH4+ presente en la digestin sulfrica

reacciona con el fenol e hipoclorito de sodio
en medio alcalino, formndose un complejo de
color a ul.
La
intensidad del color producido es

directamente proporcional a la cantidad de N
amoniacal presente en la muestra.
Mtodo de Kjeldahl
Mtodo de Kjeldahl /Berthelot
La absorbancia del complejo de se lee

a 540 nm.
Se calibra con solucin de sulfato de
amonio.
Po lo tanto lo que se determina por

este
mtodo es NITRGENO
r
TOTAL.
Otros mtodos
Los alimentos son una matriz compleja
por lo que se sugiere que estos mtodos
empricos e indirectos sean calibrados con
el mtodo de Kjeldahl.
Se espera una buena correlacin entre

estos dos tipos de determinaciones de
protena cuando la relacin N no
proteico/N proteico es baja y constante.
satisfactorios para
cereales e insatisfactorios
de los vegetales y
alimentos.
mayora
Son
leche
y
para
la mezclas
Otros mtodos
Mtodo de absorbancia a 280 nm
El
mtodo se basa en la medicin de

absorbancia a 280 nm.
La
mayora de las protenas muestran una

absorcin a 280 nm., la cual se atribuye al
grupo fenlico de la tirosina y al grupo
indlico del triptofano.
Otros mtodos
Es
un mtodo
no destructivo.
Es un
simple,
mtodo
rpido
directo
para
la
determinacin
de
protenas
que
puede
aplicarse en algunos sistemas alimenticios.
Es necesaria
una estndar.
protena
Generalment
la
calibracin
con
se toma una protena

como
la Albmina Srica Bovina (BSA), que
e
es soluble en agua, para construir curvas
patrn que sirvan de referencia para
cuantificar otras protenas, que sern ms
precisas mientras la protena en cuestin
se parezca ms a la BSA.
Otros mtodos
La
solucin debe ser clara e incolora,

la turbidez puede afectar los resultados.
El contenido de aminocidos aromticos
difiere considerablemente entre las distintas
protenas.
Lo
cidos nucleicos interfieren (anillos de

purina
y pirimida), no as el amonio.
s
Otros mtodos
Mtodo de Biuret
Comprend
un ensayo colorimtrico de un
paso donde se cuantifica la formacin
de un
e
complejo estable entre protenas y cobre (II)
de configuracin desconocida.
El
complejo presenta un color violeta

caracterstico, que se puede observar
310nm o 540-560nm, el cual a se da
por conlacuatro
coordinacin de un tomo de cobre
tomos de nitrgeno.
El
complejo se basa en la desprotonacin de

los grupos amida para formar el enlace con
el cobre (II) o por el establecimiento de un
enlace coordinado entre el metal y los pares
de electrones libres de los tomos de oxigeno
y de nitrgeno del pptido.
Otros mtodos
Mtodo de Biuret
Otros mtodos
Mtodo de Biuret
Despus de la adicin del reactivo de
cobre se requiere de tiempo para desarrollar
una coloracin de Biuret estable; es necesario
considerar
la
posible
influencia
de
aminocidos
libres que forman buffer en
configuracin tris y amoniaco.
El
complejo tiene dos mximos a 330 y a

545 nm.
La
lectura se hace usualmente a 545 nm,

dado que a la longitud de onda de 330 es mas
susceptible a las interferencias.
Otros mtodos
Mtodo de Biuret
Es
rpido, simple y no detecta nitrgeno de

fuentes no proteicas o no peptdicas.
Es
necesaria la calibracin con una protena

estndar.
Altas
concentraciones
de carbohidratos,
lpidos pueden causar opalescencia en la solucin
final.
Las
sales de amonio tambin interfieren en la

reaccin.
Se
ha encontrado poca aplicacin en anlisis

de alimentos debido a la presencia
interferentes como azcares de reductores
que
reducen el ion cprico
medio
en produciendo
alcalino
resultados Ejemplo: leche.
insatisfactorios.
Otros mtodos
Mtodo de Lowry
El
mtodo de Lowry combina la reaccin de

Biuret con la reduccin del reactivo de FolinCiocalteu (cidos fosfomolbdico y fosfotngstico)
por la oxidacin de tirosina, triptofano, cistena,
cistina de las cadenas polipeptdicas (Nielsen,
1988).
El proceso de oxido-reduccin se acompaa de
la formacin de un color azul caracterstico.
Lo quelatos de cobre en la estructura del
pptido
facilitan la transferencia de electrones de
s
los grupos funcionales amino al cromforo cido.
Este mtodo es til para determinar pequeas
cantidades de protena en una disolucin.
El
desarrollo de color es dependiente del pH,

que se debe mantener entre 10 y 10.5.
Otros mtodos
Mtodo de Lowry
Otros mtodos
Mtodo de Lowry
Tiene
Biuret.
mayor sensibilidad que el mtodo del
La
respuesta del color vara de acuerdo al

tipo de protena.
La
intensidad del color no es estrictamente

proporcional a la concentracin de protena.
Los iones potasio, magnesio, EDTA e
hidratos de carbono interfieren en la
reaccin.
Es menos afectado por la turbidez de la
muestra.
Es
afectado por la presencia de

azcares reductores al igual que el mtodo
de Biuret.
Otros mtodos
Mtodos de adhesin de colorante
Controlando
el pH y la fuerza inica del medio

los grupos funcionales cidos y bsicos de las
protenas pueden interactuar con grupos orgnicos
de carga opuesta.
Al
realizarse la unin se presenta coloracin o

bien un cambio de sta.
Comnment se usan colorantes sulfonados los
cuales
reaccionan a pH cido con el grupo -amino
e
de la lisina y el grupo guanidina de la arginina, el
imidazol de la histidina y un nmero limitado de amino terminales.
Puede
adherirse colorantes
CATINICOS
(BRADFORD).
n
ANINICOS
Otros mtodos
Mtodos de adhesin de colorante aninico
El
COLORANTE ANINICO se une a los

grupos catinicos de los residuos bsicos de
las protenas (histidina, arginina, lisina) y
forman un complejo insoluble.
El
colorante en exceso permanece soluble y

se relaciona inversamente con la
concentracin de protenas.
El
mtodo con el colorante NARANJA 12

est descripto en la AOAC para leche fluida,
helados,
leche
en
polvo
descremada
nm).
(=480
Alguno
compuestos no proteicos como

almidn
o metales pueden unirse al colorante.
s
Otros mtodos
Mtodo de Bradford
Se
basa en la unin del colorante Coomassie

Blue G-250 a las protenas.
La protenas (aminocidos bsicosy
aromticos)
se unen a la forma azul
s
para
formar un complejo protena-colorante
con un
coeficiente de
mayor que el
extincin colorante libre.
Este
mtodo es sensible, simple, rpido,

barato y pocas sustancias interfieren en su
determinacin.
Entr
las sustancias que interfieren estn

los detergentes y las soluciones bsicas.
e
No
interfieren los carbohidratos.
Otros mtodos
Mtodo de Bradford
Los
aminocidos que son reconocidos por el

colorante son arginina, fenilalanina, triptofano
y prolina.
El
azul de Coomasie libre se detecta a 470

nm mientras que la forma unida a protenas a
595 nm.
Esto
se debe a que el Coomassie se

a los aminocidos
preferencialmente
une
de
un
mencionados y cambia
estado
catinico a uno aninico.
Otros mtodos
Mtodo de Bradford
Otros mtodos
Espectroscopia infrarroja
Se
aprovecha la absorcin del grupo

del enlace peptdico.
amida
Ventajas:
Es
No
un mtodo rpido,
de multicomponentes
anlisis
destructivo.
Desventajas
Interferido por agua.
Proceso de c libracin
complejo.
Otros mtodos
Espectroscopia infrarroja reflectante
La
muestra se ilumina con seis longitudes

de onda cercanas a la radiacin infrarroja y
se detecta la luz reflejada.
Consideracin
Es
necesaria
la calibracin contra
conjunto un
de muestras estadsticamente
analizadas
por
significativas,
mtodos de
referencia
tradicionales.
Ventajas
Rpido,
anlisis de
multicomponentes.
Aplicable
Cuantific
agua.
a
a materiales slidos.
protena en presencia
de
Determinacin de la secuencia de
aminocidos
La determinacin de la composicin
proporciona
protena.
una
informacin
sobre
una
veces se necesita identificar la secuencia

de los aminocidos, para lo que se cuenta con
dos mtodos:
secuenciacin
de la cadena polipeptdica
en equipos automatizados llamados
secuenciadores de protenas.
anlisis con espectrometra de masas
de los pptidos generados y sus
moleculares respectivas.
masas
aminocidos
Po el tamao de las molculas, se
especficas,
hidrolizan
con proteasas
r
posteriormente para secuenciar e
fcilmente porciones
identificar
de 10 a 20ms
aminocidos
de los pptidos generados.
La
combinacin de proteasas especficas

los
y pptidos generados alimentados a bases
informacin de
de datos que tengan la
permiten
digestiones
enzimticas,
ir
completando las secuencias.
Se
ensaya el orden posible de los pptidos

al compararlos con bases de datos que tengan
la informacin de digestiones enzimticas
provenientes de protenas cuya secuencia ha
sido ya elucidada.
aminocidos
de
Pehr Edman descubri una
secuencia
reacciones
identificar
los Nterminales yque
que permiten
al realizarse
repetidamente
permiten identificar la secuencia completa de
los polipptidos en cuestin.
El
reactivo utilizado por Edman es el

fenilsiotiocianato que reacciona con el amino
terminal para producir el feniltiocarbamilo del
pptido.
la
secuencia
El conocimiento de
de vez ms
protenas es cada
necesario
paranaturales
identificar la presencia
de variantes
a la luz
los nuevos alimentos de origen
de
transgnico.
Determinacin de protenas por

electroforesis
Puede
realizarse
electroforesis
en
condiciones
nativas en las que las protenas
n
migran
conservando
su
diversidad
y
propiedades fsicas, especialmente su punto
isoelctrico y peso molecular.
Es
posible utilizarla en una sola dimensin o

en dos dimensiones (2D). Se les denomina 1D
o 2D-PAGE (por sus siglas en ingls,
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida).
Un vez realizadas las
generalmente
se contina separaciones, con
a
proteoltica y la separacin una
de losdigestin
fragmentos
por electroelucin o para su anlisis por
espectroscopia de masas (MS).

electroforesis
La
cabo
PAGE puede llevarse a
en si se
condiciones denaturalizantes
utilizan
tiol-reductores fuertes como mercaptoetanol
y ditiotreitol (DTT) y un detergente
desnaturalizante fuerte: el dodecil sulfato de
sodio (SDS).
El
tratamiento con ambas sustancias las

despliega y las cargas negativas conferidas
por los grupos sulfato del SDS permite la
migracin de las molculas hacia el nodo, de
acuerdo
con
su
molecular
peso exclusivamente.

electroforesis
La
tcnicas 2D permiten una segunda

s
separacin
que discrimina protenas que en 1D
se
traslapan,
por
ejemplo,
cuando
son
especies moleculares mltiples, aun cuando se
trate de protenas purificadas.
Para
el primer paso en una 2D-SDS-PAGE

se aplica una separacin por carga elctrica
(isoelectroenfoque) y una segunda separacin
por peso molecular.
Esta
poderosa tcnica se ha convertido en

un sinnimo de Protemica y el mejor mtodo
para la resolucin de mezclas complejas de
protenas.

electroforesis
La
tcnicas 2D permiten una segunda

s
separacin
que discrimina protenas que en 1D
se
traslapan,
por
ejemplo,
cuando
son
especies moleculares mltiples, aun cuando se
trate de protenas purificadas.
Para
el primer paso en una 2D-SDS-PAGE

se aplica una separacin por carga elctrica
(isoelectroenfoque) y una segunda separacin
por peso molecular.
Esta
poderosa tcnica se ha convertido en

un sinnimo de Protemica y el mejor mtodo
para la resolucin de mezclas complejas de
protenas.

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Mtodos de anlisis del contenido

ensayos dependen de la PRESENCIA

mtodos se basan en la determinacin

Mtodos de anlisis del contenido

numerosas fuentes de NITRGENO

fuentes de interferencia pueden ser

Mtodos de anlisis del contenido

Mtodos de anlisis del contenido

un mtodo oficial descrito en mltiples

Se basa en los siguientes supuestos:

determinacin del contenido de

proporcin que representa el nitrgeno

conversin del nitrgeno

se realiza una VALORACIN

convierten en dixido de carbono y agua.

digestin se libera el nitrgeno

uso de perlas de vidrio sirve de ncleo

CO2 + (NH4)2SO4 + SO2

2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O

mtodo original fue

el mtodo original la digestin

modificaciones del mtodo

de mercurio como catalizador

se usa Hg como catalizador, ste debe

originalmente se utilizaba cido sulfrico

la solucin de cido brico no necesita

equipos mas modernosvienencon

bomba de recirculacin de agua que

DESVENTAJAS DEL MTODO

Uso de catalizadores txicos o caros.

factor para convertir N en protenas

factor general de conversin no es sin

a la confusin que podra derivarse

necesario aclarar siempre en los

CO2 + (NH4)2SO4 + SO2

2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O

Al producto de la digestin se le reduce la

El NH4+ presente en la digestin sulfrica

intensidad del color producido es

La absorbancia del complejo de se lee

Se calibra con solucin de sulfato de

Po lo tanto lo que se determina por

Se espera una buena correlacin entre

mtodo se basa en la medicin de

mayora de las protenas muestran una

se toma una protena

solucin debe ser clara e incolora,

cidos nucleicos interfieren (anillos de

complejo presenta un color violeta

complejo se basa en la desprotonacin de

complejo tiene dos mximos a 330 y a

lectura se hace usualmente a 545 nm,

rpido, simple y no detecta nitrgeno de

necesaria la calibracin con una protena

sales de amonio tambin interfieren en la

ha encontrado poca aplicacin en anlisis

mtodo de Lowry combina la reaccin de

desarrollo de color es dependiente del pH,

mayor sensibilidad que el mtodo del

respuesta del color vara de acuerdo al

intensidad del color no es estrictamente

afectado por la presencia de

el pH y la fuerza inica del medio