7.

Fundamento
de la
espectrofotometr
a
UV-visible

Interaccin radiacin materia

Interaccin radiacin
materia.
EL COLOR

Transiciones energticas

Transiciones energticas

Espectros IR

Espectros UV-visible

REGIN

VISIBL
E

700 nm

UV-VISIBLE

UV
cercan
o

UV
vaco

380

200

Tipos de electrones (e-)

Transiciones UV - visible

Transiciones UV visible.
Teora Orbital Molecular (TOM)

Transiciones UV - visible

Espectro

de

ESPECTROFOTOMETRA UV VISIBLE

Tomado de
www2.chemistry.msu.edu/faculty

Disolvente polar:
hipsocrmico.- transiciones n --- *
batocrmico.- transiciones --- *

Sistemas conjugados

Sistemas conjugados

Sistemas conjugados

n *: mx =
324 nm
mx =
25
*:
=

n *: mx = 274
nm
mx =
13.6
*: mx = 195
nm
mx =
9000

Sistemas conjugados

Sistemas conjugados.
Compuestos aromticos
polinucleares

Sistemas conjugados.
Compuestos aromticos
polinucleares

Interaccin

mx

e- n y e

benceno
fenolato
(nm) =
255
287

fenol
270

Interaccin

e- n y e
p-dimetilazobenceno

(AMARILLO MANTEQUILLA

cido 4-(((4dimetilamino)fenil)azo)ben
ceno sulfnico
(ANARANJADO DE
METILO)

Interaccin radiacin
materia.
EL COLOR
Tabla 1. Espectro visible
Intervalo (l)

Color absorbido

Color transmitido

400 435

Violeta

Amarillo verdoso

435 480

Azul

Amarillo

480 490

Azul verdoso

Anaranjado

490 500

Verde azulado

Rojo

500 560

Verde

Prpura

560 580

Amarillo verdoso

Violeta

580 595

Amarillo

Azul

595 650

Anaranjado

Azul verdoso

650 750

Rojo

Verde azulado

ABSORCIN MOLCULAS
BIOLGICAS

Trp
(W)

Tyr
(Y)

Phe

ABSORCIN MOLCULAS
BIOLGICAS

ABSORCIN MOLCULAS
BIOLGICAS

ABSORCIN MOLCULAS
BIOLGICAS

ABSORCIN MOLCULAS BIOLGICAS

Tomado de Cavaluzzi M. y Borer P. (2004)

ABSORCIN MOLCULAS BIOLGICAS

Absortividad molar de los

nucletidos
(medida a 260 nm)
AMP

15 400

GMP

11700

CMP

7500

UMP

9900

dTPM

9200

ABSORCIN MOLCULAS BIOLGICAS

Espectro de absorcin UV del DNA de E. coli en

estados nativo y desnaturalizado

ABSORCIN MOLCULAS
BIOLGICAS. Temperatura fusin
(Tm) DNA

Tm =

f ([C-G], [A-T])

DETERMINACIN pka

Ecuacin HendersonHasselbalch,
pKa = pH en el que
[A ] = [AH]

DETERMINACIN pka

Mtodo
de
Adiciones
Estndar

las

Muestras complejas:
suelos,
minerales,
vegetales, etc

cenizas

Reproducir matriz en laboratorio

= tarea difcil
Solucin: Adicin directa de
una
disolucin
estndar
del
analito a una (o varias) alcuotas
de la muestra

Adiciones mltiples:

Indispensable para demostrar la

linealidad del sistema

ADiluc = absorbancia de la muestra +

st +
b Cm
b Cst
ADiluc
Vm
Vst
=
Vt
b Vt
Si Vt= constante y factor comn
=k
:

(
)

(
)

ADiluc =

kCmVm

kCstVst

Adilu
c

Vst

y =

mx

ADiluc =
kCmVm
kCst Vst

Si de la grfica se conocen
m y b
m
kCst
b
m = pendiente de la recta;
b =
kCmVm
ordenada al origen
=

Cst = conc. del analito en disolucin

estndar
Cm = conc. del analito en la muestra
problema
Cst
b
Vm = volumen de la muestra en los
Vm m
matraces

Cm

Ejemplo: un grupo de estudiantes de IBQ de

la ENCB, decide estudiar los niveles de
contaminantes en el Lago de Chapala, Jalisco.
Para tal propsito recolectan muestras de
diferentes zonas y las procesan en el
laboratorio,
siguiendo
el
protocolo
establecido para el mtodo de adiciones
mltiples.
Alcuotas de 15 mL de la muestra problema
se transfieren a 7 matraces diferentes.
A 6 de ellos se les agregan 4, 8, 12, 16, 35 y
50 mL de una disolucin estndar de 2.0 ppm

Posteriormente a los 7 matraces se les

adiciona un exceso del reactivo cromgeno a
fin de formar un complejo colorido con
mximos de absorbancia en la regin UVvisible del espectro.

Finalmente, los volmenes son llevados

hasta el aforo (100 mL) y se registraron las
absorbancias de las diferentes diluciones.

Tabla 1. Absorbancia de las

diluciones adicionadas con el
estndar
(ADICIONES MLTIPLES)
Matraz

1
2
3
4
5
6

mL
adicionados
del estndar
0
4
8
12
16
35

Absorbancia
0.27
0.47
0.69
0.92
1.17
1.35

Con base en los resultados de la Tabla 1,

determine:
A) El intervalo til de trabajo (r > 0.98)
B) Si la concentracin del contaminante
representa un riesgo para la preservacin
del Lago, tomando en cuenta que el lmite
mximo permitido por la Secretara de
Medio Ambiente y Recursos Naturales es
de 0.25 ppm.

Mtodo de adiciones mltiples

1.6

f(x) = 0.02x + 0.5

R = 0.84

1.4

1.2

Absorbancia

0.8

0.6

r
=
0.9154

0.4

0.2

0
0

10

20

30

40

50

60

Volumen adiiconado disoluc. estndar

Grfica

1.-

Mtodo

de

adiciones

Regresin
lineal
descartando
los
correspondientes a los matraces 6 y 7:

puntos

Mtodo de adiciones mltiples

1.4

1.2

f(x) = 0.06x + 0.25

R = 1

0.8

Absorbancia

0.6

r
=
0.999

0.4

0.2

0
0

10

12

14

16

Volumen adicionado disoluc. estndar

Grfica

2.-

Mtodo

de

adiciones

18

De acuerdo a la Grfica 2, el intervalo til de trabajo

ser de 0 16 mL adicionados de la disolucin
estndar.
A partir de la ecuacin:
y = 0.0564x + 0.252

Cm =

Cst b
Vm m

(2.0 ppm) (0.252)

(15 mL) (0.0564)

Cm = 0.596 ppm
Conclusiones:
A) Para la matriz en estudio el mtodo es vlido
(cumple la linealidad) siempre que el volumen de
estndar adicionado NO supere la sexta parte del
volumen total
B) La concentracin del contaminante S representa

Adicin en un solo punto:

Demostrada la linealidad del sistema Analito
Matriz, es vlido aplicar adicin en un solo punto

Absorbancia - Concentracin
A = b C =
abC
A1 = absorbancia de la muestra
Muestra

A2 = absorbancia de la muestra +
estndar (st)
Muestra

Tenemos que:
A1 = b
Cm
A2 = b
+b Cst
Vm
Cm

(
)
Vt

(
)
Vt

Vst

b es un factor comn en la absorbancia tanto de

la disolucin 1 como2 de la disolucin 2, por
tanto
2
podemos despejarlo de A1, y la sustituimos en A2
para obtener:

b=
k
A

1
A2 =
Vm

A1 =
k*C

Si:

A1

k=
A1/Cm

Cs
Vst t

A1
Si Vt = constante y factor comn
2
=
:
A1
A2 =
+ Vst
Cst
Vm
Vt2Cm = concentracin
Despejando
del
Cm

analito en la muestra problema, se obtiene:

A1CstVst
Cm
A2Vt2
=
Cst = concentracin del estndar;
A
Vm
1
Vst = volumen adicionado del estndar;
Vt2 = volumen total dilucin 2;
Vm = volumen de la muestra en dilucin 2

Ejemplo: se determina la concentracin de

azcar, como sacarosa, en una bebida
comercial, mediante el mtodo de adicin
de disolucin estndar en un solo punto.
De acuerdo al procedimiento, una alcuota de
25 mL de la muestra comercial se transfiere a
un matraz aforado de 100 mL y se diluye
hasta la marca. De la disolucin anterior, se
toma una alcuota de 15 mL, se somete a una
hidrlisis enzimtica y posteriormente es
tratada con una mezcla de resorcinol y HCl
concentrado para desarrollar la reaccin
colorida (prueba de Seliwanoff), cuyo
producto presenta un mximo de absorcin

De manera paralela, una segunda alcuota

de 20 mL de la disolucin 25/100,
es
adicionada con 2 mL de una disolucin
estndar de sacarosa de concentracin 0.1
g/mL, y se trata bajo las mismas condiciones
que la disolucin anterior a fin de desarrollar
el complejo colorido.

Por ltimo, de cada una de las disoluciones

coloridas se transfiere una alcuota de 3 mL a una
celda de vidrio para ser leda en el
espectrofotmetro, previamente ajustado con un
blanco de reactivos, obteniendo las siguientes
lecturas
A1 = absorbancia de la muestra sin adicin =
0.372
A2 = absorbancia de la muestra sin adicin =
0.407
B = blanco de reactivos = 0.033
Con base en los resultados reportados determine
la concentracin de azcar en la bebida:

1) Correccin de absorbancias (Amuestra Ablanco)

A1 = 0.372 0.033 = 0.339
A2 = 0.407 0.033 = 0.374
2) Clculo Cm
(0.339)(2mL)(0.1 g/mL)
= 0.047 g/mL
Cm =
(0.374)(22 mL) (0.339)
(20mL)
3) Correccin por factor de dilucin (FD):
25 mL de la muestra original se diluyeron en 100 mL,
por tanto:

Cm = 0.047 g/mL (100/25) =

0.18 g/mL