1

ISO 7218:2007

Requerimientos generales y Directrices

para los exmenes microbiolgicos

ISO 7218
El sentido comn en el
laboratorio

INTRODUCCIN

Solo aquellos microorganismos que estn

presentes en la muestra sean aislados y
enumerados

Los microorganismos no contaminen el

ambiente

ISO 7218, 2007

INTRODUCCIN
Medidas

de higiene personal
Empleo de tcnicas de trabajo
Asegurar
Ausencia de contaminacin de origen externo
4

ISO 7218, 2007

Precauciones a tener en cuenta durante

los anlisis microbiolgicos
Establece las principales medidas para la preparacin,
esterilizacin y almacenamiento de medios de cultivo,
as como para la utilizacin de equipos
Abarca el anlisis de bacterias, levaduras y mohos
Afecta a la microbiologa de los alimentos para consumo
humano, la alimentacin animal y las muestras
ambientales procedentes de la produccin de alimentos
5
y la produccin primaria

OBJETO
Asegurar

la VALIDEZ de los anlisis

microbiolgicos de los alimentos

Asegurar tcnicas generales iguales en todos los

laboratorios

Conseguir

unos resultados homogneos en todos

los laboratorios

Seguridad

del personal de laboratorio

3. Instalaciones

ISO 7218, 2007

Diseo y organizacin en la distribucin del lab

Anlisis de muestras de produccin primarias
separado del de otras muestras
Recepcin y preparacin de la muestra
SEPARADAS

Reduce el riesgo de contaminacin cruzada

7

3.2 Consideraciones de Seguridad

ISO 7218, 2007

Categoria de riesgo 1 (ningn o muy bajo riesgo para

el individuo y la comunidad)
Baja probabilidad de producir enfermedad en humanos
y animales
Categora de riesgo 2 (riesgo moderado para el
indivduo y muy bajo para la comunidad)
Patgeno que puede causar enfermedad en humanos y
animales pero muy improbablemente causar dao a
los trabajadores del laboratorio, a la comunidad o al
medio ambiente. Hay tratamiento efectivo, hay
medidas preventivas y el riesgo de diseminacin de la
infeccin es limitado.
8

3.2 Consideraciones de Seguridad

ISO 7218, 2007

Categoria de riesgo 3 (alto riesgo para el individuo y

bajo para la comunidad)
Patgeno que habitualmente causa enfermedad seria
en humanos y animales, pero no suele diseminarse
desde un individuo infectado a otros. Hay tratamiento
efectivo y se dispone de medidas preventivas.
Categora de riesgo 4 (alto riesgo para el indivduo y
para la comunidad)
Patgeno que habitualmente causa enfermedad seria
en humanos y animales y puede transmitirse desde un
individuo infectado a otros directa o indirectamente.
Generalmente no hay tratamiento efectivo ni se
dispone de medidas preventivas.
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3.3 Diseo del Laboratorio

ISO 7218, 2007

reas destinadas a las Muestras y Anlisis

reas Generales

SEPARADAS

Diseo del Laboratorio

ISO 7218, 2007

3.4.2 reas asociadas a las muestras y a los anlisis

Se considera una buena prctica tener localizaciones separadas o reas

claramente designadas para

Recepcin y conservacin de muestras

Preparacin de muestras (materia prima)
Examen de las muestras, desde la dilucin inicial hasta la incubacin
Manipulacin de presuntos patgenos
Conservacin de cepas de referencia y otras
Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo y equipos
Conservacin de medios de cultivo y reactivos
Examen de esterilidad de productos alimenticios
Descontaminacin
Limpieza del material de vdrio y otro equipo
Conservacin de productos qumicos peligrosos, preferiblemente guardados en
cabinas especialmente diseadas, armarios, habitaciones.

Diseo del Laboratorio

Debera considerarse disponer de reas separadas para

3.4.3 reas generales

Entradas, pasillos, escaleras, ascensores
reas administrativas
Servicios, habitaciones para cambiarse la ropa
Archivos
Almacenes
Salas de descanso
Otros

ISO 7218, 2007

3.5 Distribucin y caracterstica de los edificios

ISO 7218, 2007

3.5.1 OBJETIVO: Que el ambiente del laboratorio no afecte a la fiabilidad de los

resultados

Evitar el riesgo de contaminacin cruzada

-ejem. - diseo de no retorno
- trabajo de manera secuencial asegurando la
integridad de la muestra
- actividades separadas en TIEMPO o ESPACIO
y, adems:
Evitar condiciones extremas tales como exceso de
Temperatura,
Polvo,
Humedad,
Mantener el espacio de trabajo
Vapor,
limpio y ordenado
Ruido,
Vibraciones
A >volumen de trabajo>espacio

3.5Distribucin y caracterstica de los edificios

ISO 7218, 2007

3.5.2 Caractersticas:

Paredes, techos y suelos lisos, fciles de

limpiar
Suelos antideslizantes
Tuberas aisladas hermticamente
Puertas y ventanas diseadas para poder
cerrarse y limpiarse
T ambiente (18-27C)
Calidad del aire (sistema de filtracin)
Sistema de extraccin para evitar la exposicin
al polvo de los medios de cultivo
Emplear cabinas de flujo laminar y cabinas de
seguridad
Ambiente protegido de la radiacin solar

3.5Distribucin y caracterstica de los edificios

ISO 7218, 2007

3.5.3:Otros aspectos
Disponibilidad de agua corriente, suministro
elctrico, gas
Iluminacin adecuada
Mobiliario y mesas de material liso, impermeables
fciles de limpiar
Mobiliario diseado para la fcil limpieza
Ausencia en la zona de anlisis de documentos etc
Disponibilidad de lugares para guardar la
documentacin
Lavamanos en todas las salas
Autoclave para la destruccin del material de
desecho
Sistemas de seguridad de proteccin contra el
fuego, duchas de emergencia y lavaojos.
Servicios de primeros auxilios

3.6 Limpieza y desinfeccin

Reparacin y mantenimiento de roturas en
suelos, paredes, techos, mesas, para evitar
acmulos de microorg.
Desinfeccin y limpieza peridica
Mantenimiento peridico de los sistemas de
ventilacin y sus filtros.
Verifiacin peridica de la calidad
microbiolgica de las superficies de trabajo y
del aire
Estimar la contaminacin de las superficies
Placa de contacto con agentes
neutralizantes
Exponer una placa (no selectiva)
al aire 15 min
ISO 7218, 2007

4. el personal

ISO 7218, 2007

4.2 Competencia (criterios objetivos de evaluacin)

4.3 Verificacin permanente de la competencia (controles internos, IL)

4.5 Higiene
Evitar la contaminacin de la muestra y de los medios de cultivo
Evitar el riesgo de infeccin del personal

Ropa limpia y de un material no inflamable

No usar esa misma ropa fuera del rea de trabajo
Usar protectores de pelo y barba
Uas lmpias y preferiblemente cortas
Lavar las manos antes y despus de ir al servicio
Secarse con papel de un solo uso
Cuando se trabaja con la muestra expuesta, el medio de cultivo o
cuando
se est inoculando, evitar hablar, toser, etc
No comer ni beber en el laboratorio ni utilizar las neveras o los
congeladores
para los alimentos de consumo personal
Tomar precauciones cuando se tengan infecciones en la piel
Pipetear con la boca est totalmente prohibido

5. Aparatos y equipos

ISO 7218, 2007

Antes de utilizar verificar si cumplen con

la intencin prevista (Uso)
Mantener lmpios y en buenas
condiciones de funcionamiento (BPL)
(Mantenimiento)
Cuando sea necesario calibrar frente a
estndares (Verificacin)
Para equipos con control de T comprobar
homogeneidad y estabilidad (Verificacin)

18

ISO 7218, 2007

5. Aparatos y equipos

Operador
Medio ambiente
Muestra

5.2 Cabinas de seguridad

5.3 Balanzas y diluidores gravimtricos
5.4 Homogenizadores, y mezcladores 1-3 min
5.5 pHmetros
No usar el mismo autoclave para esterilizar
5.6 Autoclavesel material limpio y para descontaminar el
equipo o los medios de cultivo usados a la vez
5.7 Preparador de medios
Lavar y enjuagar exhaustivamente
5.8 Incubador
entre cada lote de medios

(agua pura)

Temperatura estable y uniforme

Que no le de la luz del sol directamente
No llenarlo
Limpiar y desinfectar regularmente

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5. Aparatos y equipos

ISO 7218, 2007

Conservacin de muestras para anlisis:

3C2C
Utilizar diferentes cmaras
o al menos diferentes contenedores para
Otros
usos 5C3C
conseguir una separacin fsica en la conservacin de:

5.9 Neveras y cmaras

de sin inocular y reactivos
Medios de cultivo
refrigeracin Muestras
Cultivos de microorganismos y medios
5.10 Congeladores
y
inoculados
-15C , -18C
Por debajo de -70C
ultracongeladores
5.11 Baos termostticos
5.12 Vapor fluente y baos de agua
hirviendo
160C , 180C
5.13 Horno de esterilizacin
5.14 Horno microondas
20
5.15 Lavavajillas

Ojo! Verificar que el material queda libre de sustancias inhibidoras

5. Aparatos y equipos

5.16 Microscopio ptico

5.17 Mechero bunsen o incinerador de asas.
5.18 Dispensadores de medios de cultivo y reactivos
5.19 Mezcladores Vortex
5.20 Contadores de colonias
5.21 Equipos para cultivos en atmsferas modificadas

ISO 7218, 2007

Anaerbiosis [O2]<1% y [CO2]9-13%

Microaerofilia [O2] 5-7% y [CO2]10%

5.22 Centrfuga

Verificar con indicador

Qumico o Biolgico
21

ISO 7218, 2007

5. Aparatos y equipos
5.23 Placas calefactoras (limpiar)
5.24 Sembrador espiral (v3 determinado)
5.25 Destiladores, desionizadores y unidades de
smosis inversa (<25siemens; control microbilog)
5.26 Cronmetros/Temporizadores
5.27 Pipetas y pipeteadores
5.28 Termmetros y dispositivos para
monitorizacin de temperatura
5.29 Separador inmunomagntico
5.30 Sistemas de filtracin
5.31 Otros equipos y software
22

ISO 7218, 2007

6. Preparacin del material de vidrio y de

otro material de laboratorio

Material adecuado

Utilizarse adecuadamente

Esterilizado o bien desechable

Almacenado alejado del polvo

Despus de
usar
Descontaminacin

Calor seco: 1 hora a 170C

Calor hmedo: 15 a 121C
Compuestos qumicos

Al menos 30 a 121C
23

ISO 7218, 2007

7. Preparacin y utilizacin de medios de

cultivo

ISO/TS 11133 -1 e ISO/TS 11133 -2

8. Muestras de laboratorio

Representativa del lote de producto

Que no se cambie o dae durante el transporte y almacenamiento
Protegida de contaminaciones externas ocasionadas por el aire, el
recipiente,
los equipos de toma de muestra o por una incorrecta manipulacin.

Etiquetada y perfectamente empaquetada

Enviada
inmediatamente y procesada sin demora
T transporte
-18C)

(24h, 36h si no

- productos estables: temperatura ambiente (<40C)

productos congelados: < -15C y preferiblemente < -18C
otros productos no estables a T ambiente: 1-8C
T almacenamiento
- productos estables: temperatura ambiente (18-27C)
productos congelados: < -15C y preferiblemente < -18C
24
otros productos no estables a T ambiente: 1-8C

8.5.2 Conservacin y Destruccin de las

Muestras

ISO 7218, 2007

onservar las muestras de laboratorio hasta los RESULTADOS

Nota:
Habitualmente no se acepta la prctica de re-testar las muestras, debido
a los posibles cambios en el status microbiolgico

25

9. Examen

ISO 7218, 2007

9. 1 Precauciones higinicas durante el anlisis

Evitar contaminar el ambiente

Evitar contaminar la muestra

gunos aspectos a destacar:

Los aerosoles son la causa principal de infeccin y de contaminacin

ambiental
Ejem:
Al abrir placas Petri, tubos, botellas
Cuando se utilizan agitadores, jeringas, centrfugas, etc
Cuando se vacan pipetas
Cuando se esterilizan agujas o asas de siembra
Cuando se abren ampollas que contienen cultivos liofilizados
26

9. Examen

ISO 7218, 2007

9. 1 Precauciones higinicas durante el anlisis

rea de trabajo limpia y sin corrientes

Descontaminacin de la superficie de trabajo antes y despus del
trabajo.
Tener disponible todo lo necesario para realizar el trabajo
Realizar el trabajo sin demoras
Separar las actividades limpias y sucias en tiempo y lugar
Utilizar equipamiento desechable
Los paquetes de material que no se terminen cerrarlas bin (ej. Placas
petri)
Absorber todo tipo de vertido con toallas impregnadas en etanol al 70%.
Cabinas de seguridad biolgica para manipular productos con mioroorg.
Patgenos
Cuidado al retirar las puntas de pipetas estriles, evitar que contaminen
otras.
Evitar que las pipetas toquen el borde o el cuello de las botellas de 27
dilucin.

9. 2 Preparacin de las suspensiones y diluciones iniciales

ISO 7218, 2007

9. 2.1 General

ISO 6887 o ISO 8261

El tiempo entre el final de la preparacin de la
suspensin inicial y el momento en que el inculo entra
en contacto con el medio de cultivo no debe exceder 45
min

28

9. 2. 2 Concentracin

ISO 7218, 2007

9. 2. 2.1 Centrifugacin o Filtracin de Membrana

9. 2. 2. 2 Inmunoseparacin

29

10 Recuento

Examen directo (Microscopio)

Inoculacin de medios slidos y lquidos

Citometra de Flujo

PCR tiempo real

ISO 7218, 2007

10. 2 Recuento en medios slidos

ISO 7218, 2007

Una placa por dilucin de al menos dos

diluciones sucesivas

Si se siembra una sola dilucin, utilizar

dos placas

31

ISO 7218, 2007

10. 2. 3 Tcnica de siembra en profundidad

18-20 ml en 90mm ; unos 3mm de espesor

Agar fundido y atemperado a 44- 47C

10. 2. 4 Inoculacin superficial

Fcil observacin de la morfologa

Distincin entre diferentes tipos de
colonias
No estrs por el calor del agar fundido
(se pueden obtener mayores recuentos)

32

ISO 7218, 2007

10. 2. 3 Tcnica de siembra en profundidad

10. 2. 4 Inoculacin superficial

33

10. 2. 4 Inoculacin superficial

ISO 7218, 2007

10. 2. 4.2 Mtodo del asa de extensin (o de la esptula)

10. 2. 4. 3 Mtodo de la siembra en espiral

34

10. 2. 5 Incubacin

ISO 7218, 2007

Incubar inmediatamente despus de

inocular
Ojo! T
No apilar mas de 6 placas Petri
Separar las filas al menos 25 mm
Examinar inmediatamentte despus de la
incubacin, (a veces se puden dejar en
refrigerancin hasta 48 horas).
35

10. 3 Clculo y Expresin de los Resultados obtenidos con medios

ISO 7218, 2007
Slidos

Contar solo las placas con < de 300

colonias
(Totales, tpicas o sospechosas)

Para que un resultado sea vlido se considera

generalmente necesario contar las colonias de al menos
una placa que contenga al menos 10 colonias (colonias
totales, colonias tpicas o colonas que cumplen con los
criterios de identificacin)

10. 4. 2 Recuento de colonias de Mohos y Levaduras

Contar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias
36

10. 3 Clculo y Expresin de los Resultados obtenidos con medios

ISO 7218, 2007
Slidos

Inoculacin de una placa Petri de 90 mm por cada dilucin

Recuento mximo de colonias totales (tpicas y atpicas)
300 colonias
Recuento mximo de colonias tpicas o sospechosas: 150 por
placa
N de placas para posterior confirmacin: 5
Mtodo de clculo: Caso general (Rco. Colonias totales
o tpicas)

V n1 0,1n2 d

Donde: a suma de las colonias contadas de las placas escogidas

n1: n de placas escogidas de la primera dilucin
37
n2:n de placas escogidas de la segunda dilucin
d: tasa de dilucin correspondiente a la primera dilucin
v: volumen del inculo en ml aplicado a cada placa

10. 3 Clculo y Expresin de los Resultados obtenidos con medios

ISO 7218, 2007
Slidos

Mtodo de clculo: Despus de la identificacin

b
a C
A
Donde:
A: n de colonias sospechosas (5) de cada placa para el recuento
b: n de colonias que cumplen los criterios de identificacin
C: n total de colonias sospechosas contadas en cada placa

38

10. 3 Clculo y Expresin de los Resultados obtenidos con medios

ISO 7218, 2007
Slidos

Mtodo de clculo: Contiene menos de 10 colonias

Si la placa contiene 4>colonias<10 Caso general
Expresin: NE n estimado de microorganismos por ml o por g
Si la placa contiene < 4 colonias.
Expresin: Hay microorganismos presentes a nivel inferior a
(4d) por gramo o ml.
Mtodo de clculo: No contiene colonias
Expresin: Menos de 1/d microorganismos por (ml o g)
39

10. 5 Enumeracin empleando medio

Lquido

ISO 7218, 2007

Criterios:
Deteccin visual de la turbidez
Produccin de gas
Cambio de color
Posterior crecimiento en medio de agar selectivo

Cada porcin de anlisis suministra un valor

CUALITATIVO
CUANTITATIVO NMP
40

11 Mtodo de Deteccin (Mtodo Cualitativo)

ISO 7218, 2007

Determinacin de la presencia o ausencia de un

microorganismo particular en una cantidad dada
de producto

9 x P ml o 9 x P g
Se suele pre enriquecer (para favorecer recuperacin)

Se suele incubar en caldos de enriquecimiento selectivo

Se suele utilizar dos caldos de enriquecimiento selectivo
Aumenta la Sensibilidad del mtodo

41

12 Mtodos de Confirmacin

ISO 7218, 2007

Usar solo cultivos PUROS

Un cultivo puro se prepara por seleccin de una
sola colonia
Se inocula en un medio de agar no selectivo
Tras la incubacin se selecciona una colonia bien
aislada para someterla a las pruebas de
confirmacin

42

12 Mtodos de Confirmacin

12.3 Tincin de Gram

12.4 Uso de galeras de identificacin bioqumica
12.5 Uso de sondas de cidos nucleicos
12.6 Mtodos serolgicos
Despus de la identificacin bioqumica
12.6.2 Pruebas de Aglutinacin en porta
12.6.3 Pruebas de Aglutinacin de Ltex

ISO 7218, 2007

13. INFORME DEL ANLISIS

Especificar el mtodo de Anlisis
La T de incubacin si es necesario
Resultados obtenidos
Y todo tipo de detalles o incidencias que
pudiera haber influido sobre los resultados
Debe incluir TODA la informacin necesaria para
la completa identificacin de la muestra (y es
adecuado que incluya la informacin necesaria
para la interpretacin de los resultados de
los anlisis)
La incertidumbre

44

14 Validacin de Mtodos Microbiolgicos

ISO 7218, 2007

Validacin de mtodos de referencia (se est

investigando en el subcomit ISO/TC34/SC9)

Validacin de mtodos alternativos (ISO

16140)
Validacin de mtodos propios (se est
investigando por el subcomit ISO/TC34/SC9)

45

15 Valoracin de la calidad de los resultados/

Control de calidad del funcionamiento

ISO 7218, 2007

15.1 Control Interno de la Calidad :

todo procedimiento diseado por el
laboratorio para la evaluacin contnua
de su trabajo
Objetivo: asegurar la consistencia de los
resultados da a da y la conformidad de
los mismos con los criterios previamente
establecidos
46

15 Valoracin de la calidad de los resultados/

Control de calidad del funcionamiento

ISO 7218, 2007

Programa peridico para demostrar que la

variabilidad (entre analistas, entre equipos o
entre los materiales) est bajo control
Uso de muestras inoculadas artificialmente con niveles variables de
contaminacin, incluyendo targets y flora indeseable
Uso de muestras natural o artificialmente contaminadas procedentes de
varias matrices
Uso de material de referencia (incluyendo material de los ensayos de
aptitud)
Muestras duplicadas

Periodicidad: depende de la naturaleza de los anlisis y de

47
su frecuencia

15 Aseguramiento de la calidad de los resultados/

Control de calidad del funcionamiento

ISO 7218, 2007

15.2 Cepas de Referencia

15.3 Evaluacin Externa de la Calidad (Ensayos
de Aptitud, ejercicios interlaboratorios)
Participacin peridica
Utilizacin para evaluar las tendencias del laboratorio y
para comprobar la validez de su sistema de calidad global