Cintique enzymatique

-Modle de base de la cintique enzymatique Michaelis Menten

-Dtermination des constantes cintiques
-Reprsentation hyperbolique (Michaelis-Menten )
-Reprsentation de Lineweaver-Burk
-Inhibitions des ractions enzymatiques
-Inhibition comptitive
-IC50 pour inhibition comptitive
-Inhibition non comptitive
-IC50 pour inhibition non comptitive
-Inhibition in comptitive
-IC50 pour inhibition in comptitive
- Graphiques de Dixon

AITFELLA R E.APP

AITFELLA R E.APP

 Ltude cintique dune raction enzymatique

consiste en ltude de la vitesse de la raction
et de linfluence de divers paramtres
susceptibles de la modifie.
La vitesse dune raction enzymatique est la
quantit de substrat transform (ou de produit
apparu) par unit de temps et les conditions
exprimentales dans les quelles se droule
cette raction ([E], T, pH, et la [effecteurs]).

Au
cours dune
exprience
cintique
enzymatique, on mesure habituellement les
variations de V en fonction dun seul des ces
paramtres, tous les autres demeurent
constants.

AITFELLA R E.APP

AITFELLA R E.APP

AITFELLA R E.APP

Complexe enzyme-substrat

E+S

ES

t=0, la concentration
dsigne [S]0

E+P
en

substrat

est

la concentration en enzyme est dsigne [E]T

et reste constante tout au long de la mesure
t=0, la concentration du complexe enzymesubstrat, [ES], est gale 0

t=0, la concentration en produit est gale 0

AITFELLA R E.APP

Phases de la raction

3 tats lors de la cintique

tat prstationnaire
tat stationnaire
tat poststationnaire

AITFELLA R E.APP

quation de Michaelis-Menten

Concentrations

tat prstationnaire

E+
S

tat poststationnaire

tat
stationnaire

ES

E+P
[P]

[S]

[P]
[ES]

Vi

d[ES]
=0
dt

[E]libre
Temps

[S]
[E]libre
[ES]
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AITFELLA R E.APP

AITFELLA R E.APP

quation de Michaelis-Menten

E+S

k
k

ES

E+P

-1

La vitesse dapparition du produit P (vitesse

de la raction catalyse par lenzyme) dpend
de k2 et de la concentration en ES.

vi =

[ES]

La [ES] dpend de sa vitesse de formation et

de sa vitesse de disparition.

k [E] [S]
= k [ES] + k [ES] = (k
vformation ES =

vdisparition ES

-1

-1

k)
2

[ES

10
AITFELLA R E.APP

ES se forme partir de E + S et se dcompose soit en E + S , soit en E +

P
Vitesse de formation de ES: vf = k1[ E ][ S ]
Vitesse de
de ES:
vd = (k-1dite
+ k2)[
]
[ ES ] atteint rapidement
unedgradation
valeur constante
(condition
de ES
"steady
state"),
donc

vd = vf

(k-1+ k2)[ ES ] = k1[ E ][ S ]

[ ES ] = [ E ][ S ] k1/ (k-1+ k2) = [ E ][ S ] / KM
KM = (k-1+ k2) /k1 = constante de Michaelis (-Menten)

Il faut maintenant connaitre la concentration de l'enzyme libre [ E ].

[ E ] = [ E ]T - [ ES ]
o [ E ]T est la concentration totale d'enzyme, libre ou li. On a donc:
AITFELLA R E.APP

11

[ ES ] = [ E ][ S ] k1/ (k-1+ k2) = [ E ][ S ] / KM

[ ES ] = ([ E ]T - [ ES ])[ S ] / KM = [ E ]T[ S ] / KM - [ ES ][ S ] / KM
[ ES ] + [ ES ][ S ] / KM = [ E ]T[ S ] / KM
[ ES ]( 1 + [ S ] / KM ) = [ E ]T[ S ] / KM
[ ES ](KM + [ S ]) / KM = [ E ]T[ S ] / KM
[ ES ](KM + [ S ]) = [ E ]T[ S ]
[ ES ] = [ E ]T[ S ] / (KM + [ S ])
On peut enfin introduire ce terme dans l'quation pour la vitesse initiale:
vo = k2[ ES ] = k2[ E ]T[ S ] / (KM + [ S ]) = vmax[ S ] / (KM+ [ S ])
AITFELLA R E.APP

12

vo = k2[ ES ] = k2[ E ]T[ S ] / (KM + [ S ]) = vmax[ S ] / (KM+ [ S ])

Lquation de Michaelis-Menten

Vitesse
initiale

vi = Vmax

[S]

KM + [S]

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AITFELLA R E.APP

Constante de Michaelis-Menten
vi = Vmax

[S]

KM + [S]

Si vi = Vmax Vmax = Vmax

[S]

KM + [S]

(KM + [S]) = [S]

KM = [S] - [S]
KM = [S]

KM = [S]
KM est la concentration en
substrat
pour
laquelle
lenzyme
fonctionne

la
moiti de sa vitesse maximale

KM est inversement proportionnelle laffinit de

lenzyme. Plus laffinit est leve, et moins il faudra de
substrat pour que lenzyme fonctionne.
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AITFELLA R E.APP

15
AITFELLA R E.APP

vi = Vmax

[S]

KM + [S]

In vivo, la [S] est rarement saturante. Le rapport [S]/K M

est compris entre 0,01 et 1 de sorte quau maximum la
moiti des sites actifs est occupe par le substrat.

Vmax =

[E]T

k2 = kcat
Prenons une condition o KM >>
[S] :
kcat
[S]
vi =
[E]T [S]
devient
vi = Vmax
KM
KM + [S]
Dans ces conditions [E]T [E]libre

vi =
kcat

KM

kcat

KM

[E] [S]

est une constante de vitesse apparente dordre 2

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AITFELLA R E.APP

Reprsentations linaires
Lineweaver - Burk

vi = Vmax

Si on crit lquation en double inverse :

vi

o
u

[S]

Vmax

KM+ [S]

1
vi

Vmax = k2 [E]

KM

kcat [E]

vi
1

KM + [S]

KM + [S]
Vmax

[S]

KM

x
=
+
vi
Vmax [S] Vmax

En rarrangeant on obtient :
Or

[S]

kcat [E]

[S] kcat [E]

o
u

[E]

vi

kA

1
[S]

kcat

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AITFELLA R E.APP

18
AITFELLA R E.APP

est appele constante catalytique ou kcat . Elle est

proportionnelle au nombre de ractions que peut effectuer
une molcule denzyme par unit de temps ( le turn-over
number).
2

Vmax =
mole de P. mL-1.sec-1

sec-1

cat

[E]T

mole de E . mL-1

kcat/KM est lefficacit catalytique de lenzyme. On l'appelle

galement kA.
1/Kcat: est la dure , en s de lacte catalytique
Kcat: donne la mesure de lefficacit de lacte catalytique
Lorsquun enzyme peut utiliser plusieurs substrats, kcat/KM
permet destimer quel sera le substrat le plus utilis par la
protine.
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AITFELLA R E.APP

Constante catalytique
Exemple
:Dans le tube il y a une concentration saturante en substrat donc
lenzyme fonctionne en Vmax.
On calcule la quantit de produit apparue dans le tube chaque
minute :
2 mL x 30 moles/mL/min = 60 moles/min
Il y a donc 60 moles de produit fabriques par min par les 10
nmoles denzyme prsentes dans le tube.
60 moles/min / 10 nmoles denzyme = 6000 ractions/min

ou 100 ractions/sec
Le turn-over number est donc de 6000 ractions/min ou 100
ractions/sec.
Chaque molcule denzyme catalyse 100 ractions chaque seconde.
k2 ou kcat est gale 100 sec-1.
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AITFELLA R E.APP

Units de vitesse : systme international

dans le systme international (S.I.), l'unit officielle est le katal
(kat) : quantit d'enzyme qui catalyse la transformation de 1
mole de substrat par seconde. Les biochimistes prfrent
utiliser les units internationales (U.I. ou U.E.)

1 U.I = 1 U.E. = 0,0166 kat = 16,6 nkat

1 U.I = 1 mol.min-1 ( signifie ) 16.67 nmol.s-1 =16.67
nkat

Exemple:
vi = 600 moles de P / L / mincorrespond vi = 600 U / L = 600 UIE / L
vi = 10 moles de P / L / sec

donc

vi = 10 kat / L

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AITFELLA R E.APP

Mode daction des inhibiteurs

Certains inhibiteurs s'associent de manire rversible l'enzyme en
interagissant de manire non covalente. D'autres se fixent de manire
Irrversible et sont souvent utiliss pour dterminer les groupes actifs du site
catalytique. Enfin, selon le type d'inhibiteur, l'enzyme peut fixer :
-le substrat ou l'inhibiteur : c'est la fixation exclusive avec formation de
complexes binaires ES ou EI : Inhibiteurs comptitifs: fixation la
place du substrat
-le substrat et l'inhibiteur : c'est la fixation non-exclusive avec formation de
complexes ternaires (ESI). Si ce complexe ternaire reste encore actif (moins
que le complexe ES), l'inhibition est dite partielle et s'il est totalement inactif,
l'inhibition est dite totale.
Inhibiteurs non-comptitifs: fixation ailleurs quau site substrat
empchant la catalyse davoir lieu

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AITFELLA R E.APP

Inhibiteur comptitif : (fixation exclusive)

C'est un mcanisme o la fixation de l'inhibiteur empche celle du substrat
(et rciproquement) : la fixation du substrat et celle de l'inhibiteur sont
donc mutuellement exclusives. En effet, puisque la fixation du substrat et
celle de l'inhibiteur sont mutuellement exclusives, l'addition d'une trs forte
concentration de substrat dplace l'quilibre E + S <==> ES en faveur de
ES et donc dplace l'quilibre EI <==> E + I en faveur de E.
Un inhibiteur comptitif ne peut se fixer que sur l'enzyme libre sa fixation
et celle du substrat tant exclusives l'une de l'autre.

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AITFELLA R E.APP

La vitesse dapparition du produit sexprime :

Vi =

[ ES ]

En vitesse initiale, les vitesses

disparition de ES sont gales :

do

[E] [S] =

[ ES ] =

1/KM

-1

de

[ ES ] +

formation

et

de

[ ES ]

[E] [S] [E] [S]

=
-1

KM

On admet que la [ EI ] est rapidement atteinte et que [ EI ] f = [

EI ]d

[E] [I] =

-3

[ EI ]
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On a vu que :

[E] [ I ]
[ EI ] =

On sait que :

Ki

[E]T = [E] + [ EI ] + [ ES ]

On peut donc crire :

[E] [I] [E] [S]

[E]T = [E] +

Ki

KM
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AITFELLA R E.APP

On dfinit
EI :

[ EI ] =

Ki

:comme la constante de dissociation du complexe

[E] [ I ]

Ki

[E] [I] [E] [S]

[E]T = [E] +

Ki

[I]
[E]T = [E] ( 1 +

Ki

[E]T = [E] (

KiKM

[S]
+

KM
)

KM

+ KM [I] K
+ i [S]

Ki

KM
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AITFELLA R E.APP

[E]T = [E] (

KiKM

+ KM [I] K
+ i [S]

Ki

On peut galement lcrire :

[E] =

KM

Ki x KM x [E]T
Ki x KM + KM[I] + Ki [S]

La vitesse de la raction est donne par :

Vi =

[ES]
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AITFELLA R E.APP

Vi =

[E] [S]
2

KM

Si on remplace [E] par sa valeur :

[E] =

Ki

KMx [E]T

Ki x KM + KM [I] + Ki [S]

On obtient donc :

k x x K x [E]T [S]
vi =
K
i
(K
x
K
KM i
M + KM [I] + Ki [S])
2

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AITFELLA R E.APP

vi =
Comme

Ki

x [E]T [S]

Ki x KM + KM [I] + Ki [S]
Ki

Vmax = k2 [E]T

vi = Vmax

KM

Sans
inhibiteur :

Avec
inhibiteur :

[S]
[I]
(1 +

) + [S]

Ki
vi = Vmax

[S]

KM + [S]
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Inhibition comptitive

Km'

[I ]

Km. 1
KI

--1/Km -1/Km
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31
AITFELLA R E.APP

32
AITFELLA R E.APP

Inhibiteur non comptitif : (fixation non exclusive)

Un inhibiteur non comptitif classique n'a aucune influence sur la fixation
du substrat (et rciproquement) : les sites de fixation du substrat et de
l'inhibiteur sont distincts.
En consquence, l'inhibiteur se fixe l'enzyme libre E et au complexe ES ;
de mme, le substrat se fixe l'enzyme libre E et au complexe EI. Les
inhibiteurs non comptitifs n'ont pas d'homologie structurale avec le
substrat. Un inhibiteur non comptitif au sens large peut se fixer la fois
sur l'enzyme libre et sur le complexe E-S, avec des constantes d'quilibre
diffrentes

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34
AITFELLA R E.APP

Inhibition non comptitive :

V max'

V max
[I ]
1
KI

1/Vmax

1/Vmax

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AITFELLA R E.APP

Inhibiteur incomptitif : (fixation non exclusive) du terme anglo - saxon :

"uncompetitive".
Ce type d'inhibition est aussi appel inhibition par blocage du complexe
intermdiaire. Cette appellation dcrit mieux le mcanisme : l'enzyme et le
substrat forment d'abord le complexe enzyme substrat (le complexe
intermdiaire), puis l'inhibiteur se fixe ce complexe

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38
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Inhibition incomptitive

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40
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