Citogentica Molecular

Las limitaciones de la Citogentica clsica y de la Gentica Molecular

por s solas han sido superadas por el desarrollo de las tcnicas de
Citogentica Molecular que utiliza las ventajas de ambas.
HIBRIDACION IN SITU POR FLUORESCENCIA
(FISH)
La tcnica del FISH es un procedimiento de citogentica molecular que
se fundamenta en el uso de sondas ADN dirigidas especficamente para
reconocer secuencias conocidas del ADN cromosmico (Hibridacin) y
su posterior visualizacin mediante la fluorescencia, puesto que las
sondas estan marcados con fluorcromos.
La hibridacin in situ es una tcnica de gran sensibilidad que permiye
detectar y localizar secuencias especficas de cidos nucleicos en
cromosomas, clulas y tejidos preservados morfolgicamente.

Citogentica Molecular: FISH

La tcnica utiliza fragmentos de ADN ARN marcados (sondas), que
hibridan especficamente con sus secuencias complementarias de
ADN presentes en cromosomas, clulas interfsicas y mitocondrias
ARN citoplsmico, formando hbridos estables que luego pueden ser
detectados.
La tcnica de hibridacin in situ fue desarrollada en 1969 por Gall y
John en dos grupos de trabajo independientes. Cuando se describin
por primera vez, la unica posibilidad de marcaje para las sondas
era la radioactividad, y la autorradiografia la forma de deteccin.
Po otro lado, no estaban desarrolladas tcnicas de clonaje de cidos
nuclecos y las nicas soncas disponibles eran secuencias aisladas por
tcnicas bioqumicas.

Citogentica Molecular: FISH

La posibilidad de clonar cidos nucleicos y la mejora de las tcnicas
de marcaje han permitido que la hibridacin in situ, que hasta hace
poco era una tcnica slo accesible a laboratorios de investigacin, se
utilice rutinariamente en hospitales para diagnstico y seguimiento
de muchas enfermedades.
En estos ltimos aos el marcaje de las sondas ADN con fluorcromos
han permitido desarrollar la metodologa del FISH la que se basa
principalmente en la hibridacin in situ, mediante este mtodo es
posible la deteccin y localizacin de secuencias especficas de cidos
nuclecos en estructuras biolgicas morfolgicamente conservadas.
Este mtodo emplea la capacidad que tiene la Sonda ADN de
encontrar en algn lugar del genoma, una secuencia de ADN
complementario y de unirse hibridizar especficamente con ella.

Citogentica Molecular: FISH

La Sonda para que cumpla su funcin debe ser de simple hebra y de
una secuencia u origen conocido
Si la sonda y el ADN problema hibridizan la seal fluorescente podr
ser observada mediante el microscopio de fluorescencia y as poder
confirmar la presencia del segemento cromosmico en estudio.
Para poder poner de manifiesto la hibridacin se utiliza un sistema de
deteccin muy especial y sensitivo basado en el uso de Sondas
Biotiniladas, no radioctivas. Las sondas para FISH disponibles en el
mercado puden ser marcadas con:
1. Biotina, la cual se une a la Avidina que previamente ha sido unida al
Isotiocianato de fluorescena (FITC)
2. Digoxigenina, que podr ser detectada con Fluorescena o Rodamina
unida a la Antidigoxigenina.

Citogentica Molecular: FISH

La visulaizacin de la seal emitida por estos fluorcromos es
facilitada por la tincin de los ncleos en interfase y metafases con
un medio de montaje que contiene tincin de contraste. Se utilizan
como contraste el Ioduro de Propidium cuando se emplea la
Fluorescena y el 4,6-diamino-2fenil-indol (DAPI) para la
Rodamina.
La especificidad y utilidad del FISH va ha depender del problema a
resolver y de la sonda elegida. En general existen 3 tipos de sondas:
1. Sondas de Secuencias Repetidas o Sondas Alfa Satlites:
Que identifican secuencias generalmente pericentromricas, muy
repetidas, de cada cromosoma, producen seales que se detectan
fcilmente y pueden usarse en metafase e interfase.
Se utilizan generalmente para detectar Aneuploidias.

Citogenetica Molecular: FISH

Son por lo tanto de gran utilidad para la deteccin rpida de
Aneuploidias en el diagnstico prenatal, as como para el
diagnstico y seguimiento de muchos tipos de cnceres donde la
citogentica es de muy bajo rendimiento.
2. Sondas de Cromosomas Completos o Sondas Paiting
Son un conjunto de sondas que hibridan especficamente a lo
largo de todo el cromosoma. Solo se utilizan en clulas en
metafases y permiten la identificacin del par cromosmico que
deseemos.
Son de gran utilidad para:
- Identificar segmentos cromosmicos de origen desconocido
-Identificar el origen de cromosomas que participan en un
rearreglo complejo.

Citogentica Molecular : FISH

- Identificacin de cromosomas marcadores, imposibles de determinar por

la citogentica clsica.
3. Sondas de ADN de secuencias nicas:
Son sondas mucho ms especficas que reconocen un locus determinado y
pueden reconocer un gen, incluso una parte de l (desde 1000 pb hasta
300,000 pb).
Se utilizan en la deteccin de microdeleciones que no pueden detectarse
por citogentica clsica y que son responsables de diferentes sndromes.
Tambin son de gran utilidad en el diagnstico, pronstico y seguimiento
de enfermos de cncer que presentan clulas con microdeleciones,
translocaciones que involucran regiones crticas amplificaciones gnicas.
Hasta ahora podan hacerse estudios utilizando varias sondas diferentes
simultneamente, con la nica limitacin de que los fluorcromos
disponibles pudieran

Citogentica Molecular:FISH
ser detectados como colores distintos por el ojo humano, a travs de un
microscopio.
Pero en la actualidad ya se han puesto a punto la tecnologa necesaria
para el anlisis automtico de imgenes, que permite la utilizacin
simultnea de multitud de sondas marcadas con mezclas de fluorcromos
(Fish Multicolor) que son percibidas como colores diferentes por el
analizador, aunque son distinguibles por el ojo humano.
Esta tecnologa permite hibridar todos los cromosomas
simultneamente, obetniendose un cariotipo de 24 colores, o incluso
obtener un patrn de colores asignando diferentes combinaciones de
fluorcromos a sondas de regiones cromosmicas diferentes.
En conclusin podemos decir que el Fish es una tcnica de gran
sensibilidad y especificidad, que mejora la capacidad de la citogentica
clsica en la deteccin de

Citogentica Molecular: FISH

alteraciones. Generalmente se utilizan conjuntamente,
pero el Fish es insustituible en el estudio de alteraciones
muy pequeas, en el caso de rearreglos cromosmicos
muy complejos, cuando los cultivos no crecen bien y no
pueden obtenerse metafases para su estudio, o cuando el
tiempo es el factor limitante del anlisis.

FISH de nucleos interfsicos con una sonda centromrica para el

cromosoma 21 se muestran tres seales

FISH de una microdelecin en uno de los cromosomas 15 (flecha) , de

un nio con Sindrome de Prader-Willi

Pintado de cromosomas para mostrar una sutil translocacin entre

los cromosomas 10 (azul) y 18 (rojo)

FISH mostrando una falla en la sonda especfica del locus WT1 (rojo)
en el cromosoma 11 defectuoso de un paciente con sindrome WAGR.
La sonda verde actua como marcador centromrico cromosoma 11

FISH mostrando una falla en la sonda especfica del locus PAX6

(rojo) para hibridar en el cromosoma 11 de un nio con Sindrome de
WAGR. La sonda verde actua como marcador centromrico del
cromosoma 11

FISH mostrando una delecin del cromosoma 4p (rojo) en un nio

con Sindrome de Wolf-Hirschhorn. La sonda amarilla actua como
marcador centromrico del cromosoma 4

Pintado de cromosomas 5 se observa una insercin de un pequeo

fragmento del cromosoma 13 (indica la flecha)

Pintado del cromosoma 13 en donde se observa material del

cromosoma 13 insertado en el cromosoma 5 (flecha)

Pintado de cromosomas mostrando dos cromosomas 17 normales y un

pequeo cromosoma en anillo.

FISH mostrando Hibridacin del cromosoma Y (amarillo) con el

brazo corto del cromosoma X en un varn 46XX

Citogentica Molecular
Hibridacin Genmica Comparativa (CGH)
La CGH es una tcnica de citogentica molecular que permite
determinar amplificaciones y deleciones de material gentico. Su
aplicacin se ha centrado bsicamente en los estudios tumorales.
En los ultimos aos, la investigacin gentica del cncer a travs de
la citogentica clsica ha encontrado limitaciones, porque en
muchos casos el cultivo celular de los tumores no es todo lo bueno
que se deseara, ya que no es fcil obtener metafases analizables,
adems en cada tumor pueden existir diferentes clones, haciendo
del estudio citogentico una ardua y difcil tarea e imposibilitando
muchas veces el diagnstico.
La necesidad de encontrar una tcnica que permitiera el estudio de
cualquier tipo de tumor, evitando el cultivo celular y con ello los
probles que ste conlleva, impulso el desarrollo de la CGH.

Citogentica Molecular: CGH

La CGH es especialmente usado para detectar anormalidades en
tumores no identificados por la citogentica y que puden revelar
regiones importantes en la iniciacin y progresin tumoral como:
- La amplificacin o ganancia de ADN
- Deleciones perdida del ADN
- Origen de cromosomas marcadores supernumerarios
El procedimiento del CGH bsicamente consiste en partir de un ADN
tumoral marcado con un fluorcromo de un color determinado (verde),
que se compara con una ADN normal (control) marcado con otro
fluorcromo de distinto color (rojo). Ambos ADN (uno rojo y otro verde)
compiten en la hibridacin sobre metafases previamente obtenidas a
partir de un cultivo de sangre perifrica de un individuo normal.
Luego mediante el uso de un microscopio de fluorescencia que tiene
unido un equipo automatizado

Citogentica Molecular: CGH

(ordenador y cmara), se pueden determinar las
ganancias y prdidas del material gentico del tumor.
As se obtiene informacin valiosa que ayudar tanto al
diagnstico como al pronstico de los procesos
tumorales malignos.
Una vez localizadas las regiones cromosmicas
amplificadas o delecionadas, se hace ms fcil la
determinacin del gen o genes implicados (oncogenes,
genes supresores); ya que mediante la CGH se delimita
la regin de ubicacin de dichos genes, facilitando al
genetista molecular su bsqueda e identificacin, que de
otra manera se hubiera hecho ms extensa y difcil.

CGH mostrando areas de amplificacin gnica y reduccin (delecin)

en tumores

Citogentica Molecular:CGH
Deteccin de Sondas con Marcacion Indirecta
Kit de deteccin Reactivo de Deteccin Contraste

Digoxigenina-FITC Anti-digoxigenina marcada

con fluorescena
DigoxigeninaRoda Antidigoxigenina marcada
mina
con Rodamina
Biotina-FITC
Avidina marcada con
fluorescena
Biotina-Rojo Texas Avidina marcada con Rojo
Texas
Deteccin doble
Mezcla de reactivos
simultanea

0.3 ug/ml de
Ioduro Propidium
0.1 ug/ml DAPI
0.3 ug/ml IP
0.1 ug/ml DAPI
0.1 ug/ml DAPI

Citogenetica convencional

Citogentica Molecular
Fish (Interfase)

Requiere clulas en divisin

. No requiere clulas en divisin
Anlisis global de todos los cromo- . Permite anlizar gran nmero somas
Admite el anlisis de pocas clulas . Anlisis rpido y sencillo.
(15-100)
conocer el tipo de clula
La interpretacin precisa de mucha analizada y la frecuencia real
experiencia.
de clulas con la alteracin
. Bajo costo econmico
cromosmica frente a la pobla.

No permite establecer a que clula

pertenece el cariotipo analizado.

cin celular total .

. Anlisis puntual de la alteracin que
detecta la sonda.
. Elevado costo econmico (a ms sondas empleadas, mayor costo).
. La deteccin de prdidas cromosmicas es conflictiva ya que siempre
se observan clulas sin seal de hibridacin (falsas monosomias)
. Deteccin de falsas seales de hibridacin (background).

de clulas.
. Permite

Citogenetica Molecular
Comparacin entre citogenetica y las tcnicas de biologa molecular
Citogentica
Material de

Cantidad de
10%

Fish

Southern

clulas en cultivo No requiere

No requiere
No requiere
cultivo cel.
cultivo cel.
cultivo cel.
2x106 clulas
depende de N

1000 clulas

2x106 clulas

1-10%
1 sobre 10 5
clulas analizar

Tamao de las 1000 pb

100-400 pb

500 pb

5-7 das

4 das

1 da

Bajo

PCR

2 a 3 das
elevado

elevado

elevado

estudio

1 clula
material
Sensibilidad
5clulas
1 pb

realizacin

alteraciones
Tiempo de
Costo