Algoritmul operatiilor implicate n

diagnosticul virusologic: Etapele

izolarii si identificarii virusurilor de la
bolnavi; Prelevare, transport,
prelucrarea produselor patologice.
Stocarea tulpinilor. Etichetare si
evidenta; Izolare virala. Culturi de
celule: Obtinerea unei culture de
celule. Izolarea virusurilor pe culturi
celulare. Principalale tipuri de efect
citopatic.

ALGORITMUL
DIAGNOSTICULUI IN VIROZE

Etapele diagnosticului
virusologic
Suspiciunea de viroz
Recoltarea produsului patologic
Transportul produselor
patologice
Direciile diagnosticului
virusologic

Suspiciunea de viroz
Date clinice si epidemiologice

RECOLTAREA PRODUSULUI PATOLOGIC

locul si timpul potrivit

esul disgnosticului virusologic depin

in mod absolut
de recoltarea probelor de la locul si
la momentul potrivit

RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE STERIL!!!

Trusa de recoltare a probelor

Conteiner steril pentru

recoltarea si stocarea

Fluidele orale reduc riscul

contaminarii, simplifica procedura de
recoltare

Recoltarea produselor
patologice

 Se recolteaza si probe de la contactii bolnavilor in

viroze
Gravitatea unei afectiuni nu este proportionala cu
sansa de izolare, cantitatea de virus nu e
proportionala cu virulenta sa
Organul tinta nu este locul unde se replica virusul
Cantitatea de virus este maxima inainte de aparitia
simptomatologiei (incubatie) si dupa aparitia acesteia
Aparitia anticorpilor scade sansa de izolare a virusului

PRODUSE PATOLOGICE

Snge - 3-5 ml prin punctia venoasa aseptica, pe anticoagulant.

Virusuri frecvent izolate: virusuri care disemineaza viremic si agentii
etiologici ai febrelor hemoragice.

Materiile fecale - 4-8 g in solutie de Mg SO4 (stabilizeaza

infectivitatea enterovirusurilor).
Virusuri frecvent izolate: enterovirusuri, rotavirusuri, calicivirusuri,
mai rar adenovirusuri enterice.

Secretii nazo faringiene

a) spalatura nazo faringiana se obtine cu ajutorul unor
tampoane cu coada (sterile) introduse in cornetul nazal inferior.
b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind un speculum
nazal prin administrarea a 3 ml ser fiziologic in nari cu o seringa
atasata la un tub de plastic.
c) lavaj traheobronsic se obtine prin bronhoscopie in conditii
speciale de catre personal calificat
Virusuri frecvent izolate: virusurile gripale A si B, virusurile
paragripale, adenovirusuri, rhinovirusuri, coronavirusuri, virusul
respirator sincitial, v.rujeolos, v. rubeolos, v. urlian.

Lichid cefalorahidian (LCR) - 5-6 ml prin punctie rahidiana,

inainte de inceperea tratamentului.
Virusuri frecvent izolate: virusul rabic, unele arbovirusuri.

PRODUSE PATOLOGICE

Saliva. Se recolteaza saliva de langa ductul Stenon cu tampon

steril.
Frecvent este limitata la diagnosticul infectiei rabice.
Lichid vezicular - Colectarea lichidului din vezicule, bule, pustule
se face dupa dezinfectia prealabila a regiunii cutanate sau
mucoase. Se perforeaza vezicula cu un ac atasat la o seringa de
tuberculina sau cu ajutorul unei pipete.
Virusuri frecvent izolate: HSV I, HSV II si VZV.
Urina -100 ml - orice specimen urinar obtinut prin abstinenta de
la mictiune timp de 2 ore este adecvat pentru diagnosticul
virusologic.
Virusuri frecvent izolate. V. citomegalic, v. rujeolos.
Tampoane vaginale, lavaj cervico-vaginal, tampon uretral
de la nivelul colului uterin si uretrei (atat la femeie cat si la
barbat); cu tampoane sterile, respectiv periuta citologica (pentru
uretra masculina), fara toaleta prealabila a regiunii.
Virusuri frecvent izolate: virusuri herpetice si papilomavirusuri;
diagnostic BTS, uretritelor, leziunilor veziculare si hiperplazice
genitale.
Biopsia tisulara. Fragmente de organ recoltate n ctiva ml de
solutie salina + ser de vitel 10% + antibiotice n concentratiile
folosite n culturile de celule.

Nasopharyngeal Specimen

14

Tampoane nazo-faringiene

La copii

Transportul probelor
recoltate
Rapid
La rece
Sigur
ambalare riguros
corecta
etichetarea cu semn
biorisc
documentatie in
legatura cu agentul
biologic transportat

Formular de trimitere pentru diagnostic

virusologic
Adresa spitalului/policlinicii/
cabinetului ce trimite produsul
patologic

Medicul caruia i se va
comunica rezultatul (tel, fax, email)

Nume, prenume pacient

Sex, Varsta

Date clinice, suspiciune

diagnostic

Data debutului
simptomatolgiei

Tipul produs patologic

Data, ora recoltarii

Tipul tratamentului administrat

in prealabil

Date epidemiologice (contact

cu boli infectioase
transmisibile, vectori, calatorii
in zone endemice pt o anumita
boala, vaccinari)

Analiza solicitata
Semnatura, parafa medicului

Direciile diagnosticului
virusologic
1. Izolare virala in:
Culturi de celule
Ou de gaina embrionat
Animal de laborator

2. Detectia directa a :
Particulelor virale EM , IEM
Antigene virale ELISA, IF
Genom viral PCR; Rt-PCR

3. Teste Serologice:

a. Ac virus- specifici tip IgM

b. seroconversia in ac virus- specifici tip IgG

1. Izolarea virusurilor in
culturi de celule

Izolarea pe culturi de celule

HeLa
BSC-40
HEK 293
Neinfectate

Infectate cu v. variolic

RABIE
Sus- neuron fara
incluzii corpii
Babes-Negri
Jos neuron cu
incluzii corpii
Babes-Negri (col
HE)

IZOLAREA VIRALA prin inoculare la

animalul de laborator
Primates make up
0.3% of research
animals, with
50,000 being used
each year in the
US, according to its
Dept of Agriculture,
and 10,000 in the
UE.

Alegerea sistemului de izolare

virala
AVANTAJE

DEZAVANTAJE

Animalul de
laborator

Infectie naturala Cost crescut

Oul de gaina
embrionat

Cost scazut

Culturi de celule Sensibilitate

buna,
disponibilitate

Susceptibilitate
variabila
Susceptibilitate
variabila,
Infectie
nenaturala

Animal Facility

from Stefan S. Nicolau Institute of Virology use

Techniplast Sealsafe technology

which combine the barrier at the cage level with a ventilation system
controlled by a microprocessor and HEPA filter decontamination. The system
confer a double protection barrier for the animals involved in experiments and
human staff protection during quarantine period.

Izolarea virala prin inoculare pe OGE

Pocks-uri pe MCA a OGE - v. variolic

Direciile diagnosticului
virusologic
1. Izolare virala in:
Culturi de celule
Ou de gaina embrionat
Animal de laborator

2. Detectia directa a :
Particulelor virale EM , IEM
Antigene virale ELISA, IF
Genom viral PCR; Rt-PCR

3. Teste Serologice:

a. Ac virus- specifici tip IgM

b. seroconversia in ac virus- specifici tip IgG

Detectia
directa a
particulei
virale

Detectia directa a
particulei virale prin Microscopie
Electronica
Coloratia negativa
acetat de uranil
acid fosfotungstic
Metode care cresc
sensibilitatea (106-108
particule/ml): SPIEM, SIA
Metode de concentrare:
ultracentrifugare
difuzia in agar
centrifugare directa pe grila
de ME

Microscopie electronica
Coloratie negativa

vaccinia

Microscopie electronica
Coloratie negativa

variola

Detectia
directa a
componentelo
Acid nucleic
r virale
Antigene virale

Detectia directa a acidului

nucleic viral - PCR

Thermocycler

Detectia ampliconului

Titrarea ADN - real time PCR

Detectia directa a antigenelor

virale - ELISA

Detectia directa a antigenelor virale

reactia de imunofluorescenta (IF)
(test rapid de detectie a Ag)

Test develops in 20 minutes (OraQuick)

Direciile diagnosticului
virusologic
1. Izolare virala in:
Culturi de celule
Ou de gaina embrionat
Animal de laborator

2. Detectia directa a :
Particulelor virale EM , IEM
Antigene virale ELISA, IF
Genom viral PCR; Rt-PCR

3. Teste Serologice:

a. Ac virus- specifici tip IgM

b. seroconversia in ac virus- specifici tip IgG

Diagnosticul serologic in infectiile virale

Raspuns
imun
primar

Raspuns
imun
secundar

Diagnosticul serologic
pe
de
de
pe

prob unic de ser - anticorpi antivirali

tip IgM (rspunsul imun primar) - ELISA
captur
probe pereche de ser
- proba I - la debut
- proba II - la 2-3 sptmni

ELISA tehnica indirect sau de competiie

seroconversia (proba I - nu exist anticorpi/
proba II - apar anticorpi specifici virusului de
detectat),
creterea semnificativ a titrului de anticorpi
ntre cele 2 probe (de minim 4 ori)

Etapele diagnosticului
virusologic
Izolarea viral

Dem. virusului/componente

Diagnosticul
serologic

Direciile diagnosticului
virusologic
Transportul produselor patologice
Recoltarea produsului patologic

Suspiciunea de viroz

IZOLAREA VIRUSURILOR IN
CULTURI CELULARE
EFECTE CITOPATICE

CLASIFICAREA CULTURILOR
CELULARE
CULTURI DE ORGAN =

mentinerea in vitro a
unor fragmente de organ in vederea pastrarii arhitecturii si
functiei intacte a celulelor. Corona, rhinovirusurile nu
cultiva decat pe culturi de trahee

CULTURI DE CELULE DISPERSATE =

propagarea in vitro a unui fragment de tesut sau a unor

celule dispersate obtinute din tesuturi cu ajutorul unor
enzime proteolitice si introduse intr-un mediu nutritiv
capabil sa le asigure homeostazia si proliferarea. Se
clasifica dupa timpul de supravietuire in vitro:
CULTURI PRIMARE
TULPINI CELULARE
LINII CELULARE

Culturile de celule dispersate

componente

Celule dispersate
Mediu nutritiv

reflecta tesutul de
provenienta
TESUT EMBRIONAR
TESUT ADULT
TESUT TUMORAL

MRC-5
fibroblast
(Prod. No. 84101801-1vl)

Hela
epithelial
(Prod. No. 93021013-1vl)

Culturile de celule dispersate

componente

Celule dispersate
Mediu nutritiv

Sruri tamponate izotone Earle:

1)NaCl; 2) KCl;
3)MgSO4; 4)CaCl2; 5) NaH2PO4 6) D-glucoz;
Sruri tamponate izotone Hanks: 1)NaCl; 2)KCl;
3)MgCl2 ; 4) MgSO4; 5) CaCl2; 6) KH2PO4; 6) Na2HPO4; 8) Dglucoz;

Substante nutritive: Aminoacizi eseniali:

1) L-arginin; 2) L-cistin; 3) L-fenilalanin: 4) L-glutamin; 5) Lhistidin; 6) L-izoleucin; 7) L-leucin; 8) L-lizin; 9) L-metionin;
10) L-tirozin; 11) L-treonin; 12) L-triptofan; 13) L-valin.

SER DE VIEL 2-10%, n funcie de tipul de cultur

folosit: factori de cretere i factori de adeziune
Vitamine

: 1) Colin HCl: 0,01g; 2) Acid folic: 0,01g; 3) Inozitol:

0,02 g; 4) Nicotinamid: 0,01 g; 5) D-pantotenat de calciu: 0,01 g;
6) Piridoxal HCl: 0,01 g; 7) Riboflavin: 0,001 g; 8) Tiamin HCl:
0,01 g.

Antibiotice si antifungice: penicilin i

streptomicin // griseofulvina

Condiii necesare pentru pstrarea n

via a celulelor din cultura celular
pH adecvat
temperatur constant
atmosfer cu 10% CO2
condiii aseptice

ECHIPAMENTE

Diagram of microbiological
safety cabinet airflow patterns

Obtinerea unei culturi

celulare
-se prelev esutul surs n condiii aseptice
- se fragmenteaz esutul n buci, se spal cu soluie salin
tamponat
- disocierea enzimatic a celulelor: tripsinizarea n soluie de
tripsin 0,25%
-suspendarea celulelor n mediu nutritiv
-controlul viabilitii celulelor cu coloraie vital albastru de
tripan
- repartizarea celulelor in volume egale n flacoane de culturi
celulare
-incubare n poziie culcat
- urmrirea formrii culturii cu microscopul invers

Subcultivarea culturilor celulare - film

Dup 5-7 zile de la realizarea culturii se epuizeaz substanele
nutritive, sursele de energie, se acidific mediul.
Pentru meninerea celulelor n via, acestea trebuie pasate,
subcultivate.
Celulele se detaeaz de pe peretele flaconului cu soluie de
tripsina si
EDTA , se centrifugheaz, se spal cu soluie salina tamponata i
se resuspendeaz n mediu nutritiv.
Se verific viabilitatea celulelor, se numr celulele i se
ajusteaz la concentraia optim.
Se repartizeaz volume egale n flacoane de cultur celular.

Culturile primare pot fi subcultivate de cteva ori, 3-5x.

Tulpinile celulare pot fi subcultivate de mai multe ori, 50-60x.

Liniile celulare pot fi subcultivate la infinit.

Inocularea virusurilor n culturile

celulare
Se arunca mediul nutritiv i se introduce
suspensia viral.
Incubare 1 or (adsorbtia virusurilor n celulele
receptive).
Se adaug mediu de ntreinere, se incubeaz.
n 3-5 zile apar modificrile survenite n cultura
celular.

Izolare:
urmrirea efectelor citopatice = ECP

fara ECP

Ver
o

MA-104

Huh-7

pCMK

COS

MEK

EC
P

EFECTE CITOPATICE
SINCITIAL: HIV, v
rujeolos, VRS

PICNOTIC LITIC:
enterovirusuri

INCLUZIONAR:
Intranuclear: papovavirusuri,
adenovirusuri
Intracitoplasmatic: v rabic, v
vaccina
Mixt: v herpetice, v rujeolos

EFECT CITOPATIC
SINCITIAL
(HIV)

SINCYTIA

INCLUZII
CITOPLASMATICE
(RABIE)
Sus - neuron fara incluzii Negri
Jos neuron cu incluzii Negri
(col HE)

INCLUZII INTRANUCLEARE (BOALA

CU INCLUZII CMV)

HSV corpii Cowdry tip A

Infectia CU
adenovirusuri

se multiplica in
nucleu unde
proteinele capsidare,
produse in exces,
formeaza
incluziile
intranucleare

reovirus

HPV

ECP picnotic litic

Robert Hooke's microscope (1665)

- an engineered device used to study living systems.

An old pocket microscope